糖尿病作为一种慢性代谢性疾病,其显著特征是血糖水平持续偏高,这主要是由于胰岛素分泌的缺乏或机体对其利用效率的低下造成的[1]。口服降糖药物和注射胰岛素是糖尿病的一般治疗措施,但两者均需长期使用,且有明显副作用。天然降糖物质因其较低的毒副作用而更适合长期辅助使用,逐渐成为研究热点[2]。
多糖是天然植物中存在的一类重要的生物大分子,具有抗氧化、保肝、免疫刺激、抗病毒和抗肿瘤等生物活性,在生化和医学领域得到了广泛的研究[3-5],因其丰富的生物学功能,已被开发为多种保健产品。
花椰菜(Brassica oleracea L.var.Botrytis L.),也称菜花,属于十字花科芸苔属,一年生草本植物,其味道鲜美且营养价值高[6]。多糖是花椰菜主要活性成分之一。MIYASHITA等[7]通过研究花椰菜证实其含有免疫刺激活性的多糖,可用于开发具有免疫调节功能的食品原料;ZHANG等[8]研究数据表明花椰菜副产物多糖组分PBB-1c在抗氧化和降血糖方面具有显著潜力,未来有望作为功能性食品原料或辅助药物进一步开发利用;XU等[9]从西兰花茎中提取纯化水溶性多糖,解析其化学结构,并验证其对肿瘤细胞的增殖具有抑制活性。目前对花椰菜多糖的研究,重点主要放在提取工艺的优化以及分离纯化这2个方面,对其在治疗糖尿病方面的研究较少,有关降血糖和降血脂作用尚未明确。
本研究采用水提醇沉法提取花椰菜粗多糖,DEAE-52阴离子交换柱、Sephadex G-200凝胶柱对花椰菜粗多糖分离纯化,得到花椰菜多糖(Brassica oleracea L.var.Botrytis L.polysaccharide,BBP),研究综合运用物理与化学分析手段,系统地表征了纯化多糖的结构,同时研究不同给药方式下,该多糖对2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)模型小鼠产生的作用。本研究旨在为该多糖后续的开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
本实验采用的原料花椰菜干产自江苏徐州,花椰菜于电热鼓风干燥箱中55 ℃干燥3 d除去水分,将得到的花椰菜粉碎过80目筛,干燥条件下密封贮存。
实验选用60只SPF级C57BL/6 J雄性小鼠[6周龄,体重(18±2)g,北京斯贝福生物技术有限公司,SCXK(京)2024-0001],实验全过程于恒温恒湿动物房[(22±2)℃,(50±5)%湿度,12 h光暗循环]中进行。实验方案经天津科技大学动物伦理委员会审批(批准号:2024053),其内容遵循中国国家研究委员会颁布的《实验动物福利伦理审查指南》相关规定。
无水乙醇、正丁醇,天津市化学试剂厂;四硼酸钠、间羟基联苯,天津索罗门生物科技有限公司;氢氧化钠,天津市江天化工技术有限公司;三氯甲烷,天津市风船化学试剂;葡聚糖标准品、单糖标品,Sigma公司;苯酚、考马斯亮蓝、纤维素DEAE-52、Sephadex G-200、刚果红、链脲佐菌素(streptozotocin,STZ),北京索莱宝科技有限公司。
1.2 仪器与设备
HWS-26恒温水浴锅,天津亿诺科学仪器有限公司;TDZ5-WS低速离心机,长沙湘仪仪器有限公司;1260 infinity Ⅱ高效液相色谱仪,美国安捷伦仪器有限公司;Synergy HTX多功能酶标仪,美国伯腾仪器有限公司;UV-2550PC紫外可见分光光度仪,日本岛津仪器有限公司;IS-50傅里叶红外光谱仪(Fourier-transform infrared spectroscopy,FT-IR),美国尼高利仪器有限公司;SU1510扫描电子显微镜,日本株式会社日立高新技术;BSZ-100自动部分收集器,北京东南仪诚有限公司;ICS-5000离子色谱仪、氮气吹扫仪,美国赛默飞世尔科技公司。
1.3 实验方法
1.3.1 结构表征
1.3.1.1 多糖提取及分离纯化
过80目的花椰菜粉,参照刘盈等[10]的方法并稍作改动:料液比1∶20(g∶mL),提取时间3 h,提取温度80 ℃,滤液浓缩至原体积的20%,用80%的乙醇醇沉12 h,离心20 min,取沉淀用蒸馏水充分溶解,旋蒸除去有机相得到多糖粗提物。将粗多糖溶液与Sevag(氯仿和正丁醇体积比为4∶1)试剂按4∶1的体积比混合,摇床充分振摇30 min,分层后取上清液重复上述操作,直至无蛋白层,除去上层清液中多余有机试剂,流水透析3 d,冷冻干燥得到花椰菜粗多糖。
将花椰菜粗多糖溶解于去离子水中(10 mg/mL),滤膜(0.45 μm)过滤后,上样至预平衡(5倍柱体积缓冲液)的DEAE-52阴离子交换柱。使用0、0.1、0.3、0.5、0.7 mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱。通过恒流泵控制洗脱流速为8 mL/管。合并目标洗脱峰组分,于4 ℃超纯水中用3 500 Da透析袋透析72 h,真空冷冻干燥24 h获得初步纯化多糖。
将上述多糖用去离子水复配(1 mg/mL),滤膜(0.45 μm)过滤后过SephadexG-200凝胶柱。通过恒流泵(流速5.6 r/min)控制洗脱速度为3.2 mL/管,收集吸光度值最高的管,真空冷冻干燥24 h获得花椰菜纯多糖,命名为BBP。
1.3.1.2 BBP基本成分测定
总糖含量:采用苯酚-硫酸法测定[11];蛋白质含量:采用考马斯亮蓝法测定[12];糖醛酸含量:采用间羟基联苯法测定[13];总酚含量:按照植物总酚含量检测试剂盒测定[14]。
取1.0 mg样品精确称重后,溶于1 mL超纯水中配成1.0 mg/mL的测试溶液。随后采用紫外可见分光光度计,将超纯水当作参比,在190～400 nm波长进行全谱扫描。
1.3.1.3 BBP平均相对分子质量
精密称取T系列葡聚糖标准品用超纯水溶解(1 mg/mL),同时用超纯水配制相同质量浓度的BBP,利用高效液相色谱仪分析,选用示差检测器测定出峰时间,运行参数为柱温32 ℃,柱压20 MPa,进样量20 μL,流速0.6 mL/min,检测时间25 min。以保留时间作为横轴,相对分子质量对数值为纵轴,建立标准曲线。根据测定标准曲线计算BBP的相对分子质量。
1.3.1.4 BBP单糖组成分析
标准品溶液制备:分别准确称取包括岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖在内的13种单糖标准品,用水溶解并定容为10 mg/mL的单标母液;再移取适量母液混合,配制成所需浓度的混标工作液。
多糖样品前处理:精确称取2 mg多糖样品,加入1 mL 2 mol/L三氟乙酸,在121 ℃下加热反应2 h。随后使用氮气将酸液吹干,残余物以99.99%甲醇清洗并再次吹干,重复清洗2～3次。最终使用无菌水溶解定容,并移入色谱瓶待测。
离子色谱系统:ICS 5000+,Thermo Fisher Scientific,USA;检测器:电化学检测器;液相色谱柱:DionexTM CarboPacTM PA20(150 mm×3.0 mm,10 μm);进样量为5 μL,流速0.5 mL/min,柱温为30 ℃;流动相A(H2O),流动相B(0.1 mol/L NaOH),流动相C(0.1 mol/L NaOH,0.2 mol/L NaAc)[15]。
1.3.1.5 BBP傅里叶红外光谱分析
精确称取1 mg干燥的BBP样品,与120 mg溴化钾混合研磨后压片,在波数4 000～400 cm-1扫描并记录其光谱。
1.3.1.6 BBP刚果红实验
配制0.5 mg/mL多糖溶液和50 μmol/L刚果红溶液,同时加入不同量(1 mol/L)溶液,使NaOH的最终浓度依次为0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4 mol/L。以单独刚果红溶液为空白对照,室温反应10 min后,使用紫外分光光度计在400～600 nm的波长下进行扫描,记录不同NaOH浓度下的最大吸收波长[16]。
1.3.1.7 扫描电子显微镜
将少量干燥BBP样品经镀金处理后放置于扫描电镜样品台,在5 kV加速电压条件下,分别采用500×、2 000×及5 000×放大观察其微观结构形态。
1.3.2 活性研究
1.3.2.1 动物实验
对所有小鼠适应性喂养7 d后,随机分成正常对照组(n=10)和糖尿病模型组(n=50),糖尿病模型组持续喂养14 d高糖高脂饲料以诱导代谢异常,随机腹腔注射STZ(80 mg/kg)3 d,建立糖尿病模型,反应4 d后测小鼠空腹血糖值(fasting blood-glucose,FBG),成模标准为FBG≥11.1 mmol/L。将造模成功的小鼠分为5组(n=10),试验共分为6组,包括正常对照组(normal control group,NC,生理盐水)、模型对照组(model control group,MC,生理盐水)、阳性对照(二甲双胍)组(metformin group,MET,200 mg/kg,0.2 mL/只)、低剂量花椰菜多糖组(low-dose BBP group,L-BBP,100 mg/kg,0.2 mL/只)、高剂量花椰菜多糖组(high-dose BBP group,H-BBP,300 mg/kg,0.2 mL/只)、花椰菜多糖-二甲双胍协同组(BBP combined with metformin group,BBP-MET,BBP 100 mg/kg+MET 200 mg/kg,0.2 mL/只),持续给药28 d。所有小鼠在末次给药结束后,先禁食12 h,接着进行体重测量。完成这些准备后,摘除小鼠眼球收集眼眶血,收集到的血液需在4 000 r/min的转速下离心10 min,之后分离出上清液,将其放在-80 ℃ 环境中保存,留待后续检测分析生理生化指标使用。
之后处死小鼠并快速获取肝脏组织后,样品经液氮速冻,再通过干冰转运,最终保存于-80 ℃超低温环境,以用于后续的各项生理生化指标分析。
1.3.2.2 空腹血糖及生理指标测定
实验过程中,每间隔7 d,测定并记录小鼠的FBG值、体重、日常摄食量以及饮水量。
1.3.2.3 口服葡萄糖耐量试验
实验最后一周,进行口服葡萄糖耐量(oral glucose tolerance test,OGTT)测定,让各组小鼠先禁食12 h,之后为它们灌胃对应的葡萄糖溶液,灌胃剂量为2 g/kg。灌胃结束后,分别于0、30、60、90、120 min检测小鼠血糖。实验期间一旦发现小鼠血糖过高,立即为其皮下注射胰岛素。运用梯形法计算OGTT的血糖-时间曲线下面积(area under the curve,AUC)。按公式(1)计算AUC:
AUC=BG0×0.25+BG30×0.5+BG60×0.75+BG120×0.5
(1)
式中:BG0、BG30、BG60、BG120分别代表0、30、60、120 min时的血糖。
1.3.2.4 血脂代谢水平测定
取离心处理后的血清样本(离心条件:4 500 r/min,4 ℃,10 min),通过预实验确定最佳稀释浓度,并按照相应试剂盒的操作流程,测定小鼠血清中总胆固醇(total cholesterol,TC)、游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)含量。
1.3.2.5 肝脏中氧化应激水平测定
取部分肝脏组织,以1∶9(g∶mL)的料液比加入PBS,匀浆后经4 ℃离心,获得上清液备用。接下来按照试剂盒说明书的操作要求,严格检测上清液中的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、过氧化氢酶(catalase,CAT)以及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)。
1.4 统计学分析
所有数据通过GraphPad Prism 10.1.2软件进行单因素方差分析,并进行显著性检验。
2 结果与分析
2.1 结构表征
2.1.1 BBP分离纯化及基本成分测定
如图1-a所示,通过DEAE-52阴离子交换层析柱对花椰菜粗多糖进行纯化分离,选择峰面积最高的0.5 mol/L NaCl洗脱下来的组分,收集洗脱曲线峰上所有管,3 500 Da透析72 h,冻干后过G-200葡聚糖凝胶柱可得完全单一均匀的单峰(图1-b),表明其纯度较高,将最终洗脱得最高管纯糖组分命名为BBP。
a-DEAE-52洗脱曲线;b-Sephadex G-200洗脱曲线;c-紫外光谱
图1 BBP的分离纯化及紫外光谱
Fig.1 Isolation,purification and ultraviolet spectrum of BBP
经测定,该样品中总糖的含量为(92.08±0.32)%,而其中蛋白质与总酚的含量则相对较低,分别为(2.05±0.17)%、(2.67±0.52)%,表明多糖仅含少量杂质,其纯度较高。BBP糖醛酸含量较高,为(30.29±0.26)%,可推测其为酸性多糖。
图1-c的紫外可见光谱分析(190～400 nm)显示,BBP在260、280 nm特征波长处均未出现显著吸收峰,表明BBP只含有极少量蛋白质、核酸。此结果与基本化学成分测定分析结果表现一致。
2.1.2 BBP的平均相对分子质量
由图2-b可知,BBP的HPLC图为单一对称的尖锐峰,表明其纯度较高。根据T系列葡聚糖标准品出峰时间可得标准曲线为lgMw=-0.452 7t+10.693,其中R2=0.994 7。由保留时间(8.607 min)计算得BBP的平均相对分子质量为3.98×106 Da。
a-葡聚糖标品标准曲线;b-高效液相色谱图
图2 BBP平均相对分子质量测定
Fig.2 Determination of the average relative molecular mass of BBP
2.1.3 单糖组成分析
图3展示了混合单糖标准品与花椰菜多糖BBP的单糖组成离子色谱分析结果。色谱分析显示,BBP由6种单糖组成,包括鼠李糖(rhamnose,Rha)、阿拉伯糖(arabinose,Ara)、半乳糖(galactose,Gal)、葡萄糖(glucose,Glc)、甘露糖(mannose,Man)和半乳糖醛酸(galacturonic acid,Gal-UA)。单糖组成的摩尔比为Rha∶Ara∶Gal∶Glc∶Man∶Gal-UA=0.26∶1.42∶1∶0.13∶0.12∶0.8,阿拉伯糖、半乳糖和半乳糖醛酸的含量较高,半乳糖醛酸的存在进一步验证了BBP为酸性多糖。
1-岩藻糖;2-鼠李糖;3-阿拉伯糖;4-半乳糖;5-葡萄糖;6-木糖;7-甘露糖;8-果糖;9-核糖;10-半乳糖醛酸;11-古罗糖醛酸;12-葡萄糖醛酸;13-甘露糖醛酸。
图3 BBP的离子色谱图
Fig.3 Ion chromatogram of BBP
2.1.4 红外光谱分析
FT-IR是一项用于分析多糖特征官能团并解析其初级结构的重要技术[16]。图4显示BBP具有典型多糖特征吸收峰,3 417.36、2 928.69、1 631.86、1 439.73 cm-1处分别代表—OH的伸缩振动、C—H对称伸缩振动、C
O的伸缩振动、C—H的弯曲振动。1 742.54 cm-1处吸收峰可以证明羧基的存在,从而可进一步判断糖醛酸的存在情况。1 237.17、1 101.43 cm-1处分别产生了SO的伸缩振动、C—O—C的伸缩振动,表明含有硫酸根基团与吡喃糖环,1 019.98 cm-1处吸收峰表明含有多糖特有的糖苷键C—O—H。917.66、829.95 cm-1两处特征峰的出现,分别指示了α-构型和β-构型糖苷键的存在。
图4 BBP的红外分析
Fig.4 Infrared analysis of BBP
2.1.5 刚果红分析
刚果红实验常用于多糖三股螺旋构象的检测。刚果红可以和具有三股螺旋构象的多糖分子形成复合物,当NaOH浓度升高,该复合物的结构被破坏,溶液最大吸收波长呈下降趋势,即红移现象[17]。如图5所示,在BBP与刚果红形成复合物后,可观察到其最大吸收波长在弱碱性条件下发生红移,然而当处于高碱浓度环境时,该波长值并未呈现降低态势。该光谱变化不满足三股螺旋结构的典型判别依据,推测BBP不具备三股螺旋构型[16]。
图5 BBP的刚果红反应
Fig.5 Congo red reaction of BBP
2.1.6 扫描电子显微镜分析
图6展示了BBP在500×、2 000×和5 000×放大倍数下的微观形态。如放大500倍的图像所示,BBP呈现丝状和杆状相互交联的网状结构,表明其分子链间存在较强的相互作用力[18]。随着放大倍数的增加(2 000×和5 000×),多糖表面结构更为清晰,BBP形态呈现球状、杆状和片状结构,相互连接且表面较光滑。研究表明具有片状形态结构的多糖水溶性较好[19]。
图6 BBP的电镜扫描图
Fig.6 SEM of BBP
2.2 活性研究
2.2.1 生理指标监测
通过监测小鼠体重、饮食、饮水量变化,可以反映药物对糖尿病小鼠的治疗改善情况。由表1的数据可以看出,NC组小鼠的体重、日常饮食量以及饮水量,全程都维持在平稳水平。MC组小鼠体重出现了显著下降,同时饮食量和饮水量有明显增多,数值远远超过正常组小鼠,呈现出较为严重的糖尿病症状。与MC组相比,治疗组小鼠体重均显著增加,饮食量和饮水量均显著降低,糖尿病症状有所改善。MET组摄入食物和水源增加率分别为28.73%、18.38%,BBP-MET组摄入食物和水源增加率分别为5.89%、12.19%,与MET组相比,BBP-MET组小鼠体重显著增加7.29%,实验数据表明,多糖联用二甲双胍BBP-MET组呈现出更好的治疗效果。
表1 小鼠体重、饮食量和饮水量表
Table 1 Weight、water and food consumption of mice
组别体重/g饮食量/[g/(只·d)]饮水量/[mL/(只·d)]造模前造模后灌胃后初始最终初始最终NC23.91±0.1625.86±0.2027.97±0.636.25±0.176.28±0.1516.27±0.1816.38±0.11MC24.03±0.7722.33±0.35∗18.89±0.16∗6.33±0.129.48±0.14∗16.28±0.2223.32±0.24∗MET24.36±0.4422.47±0.3220.84±0.35#6.30±0.158.11±0.27#16.21±0.1519.19±0.11#L-BBP24.26±0.5422.18±0.2420.06±0.78#6.30±0.167.67±0.17#16.28±0.1922.21±0.14#H-BBP24.32±0.1522.96±0.3620.88±0.27#6.25±0.157.16±0.19#16.3±0.2620.34±0.23#BBP-MET24.39±0.1722.36±0.8921.03±0.38#6.28±0.216.65±0.24#^16.32±0.2818.31±0.27#^
注:*与空白组比较,P<0.01,#与模型组比较,P<0.01,^阳性组与协同组比较,P<0.01。
2.2.2 空腹血糖及口服葡萄糖耐量试验
空腹血糖值是判断是否患有糖尿病的重要指标[20]。通过监测小鼠每周血糖值,来判断BBP的降血糖效果。如图7-a所示,以建模成功为第0周,除了正常组的小鼠,其他所有组别的小鼠血糖值都超过了15 mmol/L,这一结果表明,通过STZ诱导构建的糖尿病小鼠模型已经成功。在进行药物干预治疗之后,正常组小鼠的血糖始终维持在较低的范围,而模型组小鼠的血糖则整体表现出逐渐升高的态势,MET组、L-BBP组、H-BBP组、BBP-MET组小鼠血糖水平均呈现下降趋势,BBP-MET组血糖水平下降程度大于MET组,H-BBP组血糖水平下降程度大于L-BBP组,经过药物治疗28 d后,BBP-MET组降血糖效果最明显,达到(6.66±0.69)mmol/L。说明多糖含量越高,降血糖效果越明显,BBP联用二甲双胍协同治疗降糖效果最好。
a-空腹血糖水平;b-OGTT曲线图;c-AUC图
图7 空腹血糖及口服葡萄糖耐量试验
Fig.7 Fasting blood glucose and oral glucose tolerance test
注:##与空白组比较,P<0.01;**与模型组比较,P<0.01;^^不同剂量组间比较,P<0.01(下同)。
在糖尿病患者中,因胰岛素分泌功能受损及机体出现胰岛素抵抗,常引发葡萄糖耐量异常,造成进食后血糖水平持续升高且回落缓慢的现象[21]。OGTT可以反映机体糖代谢速率,是检测糖代谢异常的重要手段。小鼠口服葡萄糖耐量试验如图7-b所示,小鼠禁食12 h后,按体重灌胃给予2 g/kg葡萄糖后,在30 min处血糖水平达到最高值,之后呈下降趋势。药物治疗组降血糖程度均大于模型组,其中,降血糖效果BBP-MET组>MET组>H-BBP组>L-BBP组。
观察图7-c数据可知,与NC组进行比较,MC组小鼠AUC值有显著升高(P<0.01)。将治疗组与MC组对比可得,治疗组小鼠AUC值出现了显著降低(P<0.01),H-BBP组AUC小于L-BBP组,BBP-MET组AUC略小于MET组。结果表明多糖含量增加可以增加胰岛素敏感,协同治疗对糖尿病小鼠糖耐量改善效果最好。
综上所述,BBP联用二甲双胍协同治疗可以有效改善患病小鼠空腹血糖水平以及糖耐量。
2.2.3 血脂代谢水平
血脂代谢紊乱是糖尿病小鼠的典型病理特征,主要表现为TC(图8-a)、TG(图8-b)、FFA(图8-c)及(图8-d)的异常升高,同时伴有HDL-C(图8-e)水平的下降[22]。图8为经过4周治疗后,糖尿病小鼠血脂代谢水平的改善情况。和正常组小鼠对比来看,模型组小鼠体内的TC、TG、FFA以及LDL-C这4种物质的含量,均有明显的升高,而 HDL-C的含量则出现了显著降低。经过4周药物治疗后,干预组小鼠TC、TG、FFA、LDL-C含量均有一定程度降低,HDL-C含量明显回升。与阳性组MET组相比,协同组BBP-MET组TC含量[1.50±0.13(mmol/L)]、TG含量[0.53±0.10(mmol/L)]、FFA含量[146.06±3.18(μmol/L)]、LDL-C含量[0.75±0.13(mmol/L)]显著降低(P<0.05),分别降低了23.07%、39.08%、14.29%、32.72%,HDL-C含量[1.87±0.11(mmol/L)]显著上升(P<0.05),增加了23.02%。与多糖低剂量组L-BBP组相比,多糖高剂量组H-BBP组对血脂代谢水平改善效果更好。结果表明,多糖联用二甲双胍协同作用对糖尿病小鼠的血脂代谢水平改善效果最好,同时,多糖含量对改善糖尿病小鼠血脂代谢水平有影响,高剂量多糖表现出更好的治疗效果。
a-TC;b-TG;c-FFA;d-LDL-C;e-HDL-C
图8 BBP对小鼠血脂水平的影响
Fig.8 Effect of BBP on blood lipid level in mice
注:*与模型组比较,P<0.05,^不同剂量组间比较,P<0.05(下同)。
a-CAT活性;b-SOD活性;c-MDA含量;d-GSH-Px活性
图9 BBP对小鼠肝脏氧化应激的影响
Fig.9 Effect of BBP on oxidative stress level in mice
2.2.4 氧化应激水平
研究表明,氧化应激状态与糖尿病及其并发症的进展存在显著关联。体内氧化与抗氧化作用的失衡,以及持续存在的轻度炎症反应,可能是引发该疾病及相关并发症的重要因素[23]。观察图9能够发现,和正常组小鼠比较,模型组小鼠体内的CAT(图9-a)、SOD(图9-b)以及GSH-Px(图9-d)这3种酶的活性,均出现了明显的下降,分别降低65.18%、51.19%、49.78%,MDA(图9-c)含量显著升高,增加98.13%,说明高血糖引发了小鼠的氧化应激损伤。经过干预治疗后,多糖组L-BBP、H-BBP和协同组BBP-MET均能有效提高CAT、GSH-Px含量和SOD活性,降低MDA含量。多糖联用二甲双胍协同组表现出最好的治疗效果,CAT、GSH-Px、SOD活性、MDA含量分别为(13.88±1.74)U/mg prot、(521.44±9.57)U/mg prot、(114.63±5.43)U/mg prot、(58.01±3.79)nmol/mg prot。
多糖含量对氧化应激水平改善有一定的影响,高剂量多糖表现出更好的治疗效果。与单用二甲双胍组相比,多糖联用二甲双胍协同组CAT、GSH-Px、SOD活性显著升高(P<0.01),分别增加41.50%、26.73%、19.31%,MDA含量显著降低(P<0.01),降低了34.47%。上述结果表明,多糖和多糖协同二甲双胍能减轻高血糖引发的氧化应激损伤,改善糖尿病相关的代谢紊乱,且多糖辅助治疗的效果最佳。
3 结论与讨论
从花椰菜中分离纯化得到一种分子质量均一的多糖,将其命名为BBP,对该多糖开展初步结构分析后发现,BBP分子质量为3.98×106 Da,是一种酸性多糖,可能含有α-型糖苷键和β-型糖苷键,不含三股螺旋结构,主要成分包含阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖醛酸,摩尔比为Rha∶Ara∶Gal∶Glc∶Man∶Gal-UA=0.26∶1.42∶1∶0.13∶0.12∶0.8。
在动物实验中,多糖干预组均能有效改善糖尿病小鼠症状。多糖含量对改善效果有一定影响,多糖协同二甲双胍组显示出最好的治疗效果。具体表现为FBG和OGTT降低;显著降低T2DM小鼠的TC、TG、FFA、LDL-C含量以及MDA活性;显著增加HDL-C、SOD、GSH-Px、CAT水平。综合以上实验结果,BBP通过降低糖尿病小鼠血糖水平,缓解血液中的胰岛素抵抗,改善脂质代谢和氧化应激,从而达到改善小鼠糖尿病的症状。
本研究对BBP只进行了初步的结构表征,其结构式等详细结构表征尚未得知,以及动物实验未对其降血糖机制进行进一步研究,后续将在这2方面进行深入研究,为天然多糖在辅助降血糖产品的开发应用提供依据。
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