心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是全球人口死亡的主要原因之一。《全球心血管疾病负担报告》指出,全球心血管疾病形势严峻,每年有近2 000 万人死于心血管疾病[1]。血栓形成是冠心病、高血压、心力衰竭等各种心血管疾病的主要原因之一。诱发血栓形成的因素很多,包括血小板活化、血液流变学异常、凝血酶引起的凝血等。探寻凝血途径中合适的靶点[2],寻找预防和治疗血栓性疾病的方法受到国内外研究人员的高度关注。
凝血酶(thrombin)是凝血途径的下游效应因子,也是血栓形成的关键酶。在凝血级联反应中,凝血酶可以将纤维蛋白原转化为纤维蛋白单体,并将凝血因子ⅩⅢ激活为凝血因子ⅩⅢa,从而使纤维蛋白单体相互连接形成不可溶的交联纤维蛋白网络。这一过程被认为是血栓形成的核心环节,因此凝血酶可作为抗血栓治疗中最关键的靶点,用于评估或筛选具有抗血栓活性的成分[3]。
目前,乳源抗血栓肽研究相对较少,而牦牛乳干酪是源于青藏高原的一种具有独特风味和营养价值的传统食品,近年来,本团队已发现牦牛乳降解肽具有多种生物活性,如抗氧化活性[4]、抗炎活性[5]、抗胆固醇[6]、抗高血压活性[7]和抗焦虑等活性。然而,关于牦牛乳酪蛋白的抗血栓活性研究还是个空白,其苦味肽的构效关系及作用机制也尚未阐明。
本研究通过生物信息学及体外试验验证的方法,系统阐明生物活性肽抗血栓活性的有效作用机制,并通过试验进一步验证了其活性,旨在深入解析源自牦牛乳干酪苦味肽的抗凝机制。研究结果,有望为开发新型抗血栓功能性食品提供新的思路和途径,对于预防和治疗血栓性疾病具有重要的社会意义。
1 材料与方法
1.1 实验工具和材料
实验工具:AutoDock Vina、AutoDock Tools(ADT 1.5.6)、Gromacs 2023、PyMOL。
试验材料:课题组前期在牦牛乳干酪蛋白质中降解分离出的小分子肽:RPKHPIK(RK7)、VYPFPGPIPN(VN10);阳性药物比伐卢定(Bivalirudin),上海淘术生物科技有限公司;显色底物S-2238,上海源叶生物科技有限公司;活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)检测试剂盒、凝血酶原时间(prothrombin time,PT)检测试剂盒、凝血酶时间(thrombin time,TT)检测试剂盒,上海源叶生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
VersaMax酶标仪,美国MolecularDevices公司;电子分析天平,上海天美Techcomp公司;HWS26恒温水浴锅,上海一恒科技有限公司;AutoDock vina,美国的斯克里普斯研究所(The Scripps Research Institute,TSRI)开发;ChemBioDraw Ultra11.0,美国Cambridge Soft公司;PyMOL,美国的薛定谔公司(Schrödinger,Inc.)开发维护。
1.3 实验方法
1.3.1 肽理化性质的预测
利用生物信息学工具Peptide property calculator(https://pepcalc.com/)计算肽的分子质量、等电点和净电荷,利用Peptide 2.0(https://www.peptide2.com/)计算肽的疏水氨基酸比例,肽的基本理化性质,包括分子质量、等电点、疏水性及疏水氨基酸比例等,均通过生物信息学工具进行综合评估,所使用的工具包括Innovagen、PepDraw和ExPASy ProtParam。使用Peptide Ranker(https://http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/)数据库对肽进行评分,得分大于0.5的肽被视为具有潜在功能活性[8]。
1.3.2 配体分子肽的准备
肽RK7与VN10的二维结构利用ChemBioDraw Ultra 11.0软件构建,其结构式展示于图1,并进行能量最小化处理,用于后续分子对接。
A-RK7;B-VN10
图1 小分子配体的三维结构图
Fig.1 Three-dimensional molecular structure of small molecular ligands
凝血酶的数量众多,经本试验的预试验对比分析,从RCSB Protein Date Bank(PDB,http://www.Pdb.org)中下载其中对接效果好的凝血酶(PDB:1A4W和2BVR)蛋白晶体的X射线三维结构。使用Autodock vina软件打开PDB文件,删除其3D晶体结构的水分子并给其加氢选定受体蛋白。
1.3.3 分子对接
小分子配体的3D结构通过以下流程获得:自PubChem数据库检索其2D结构,继而利用ChemOffice软件构建并优化为mol2格式。相应的蛋白受体则筛选自RCSB PDB数据库,选取高分辨率晶体结构,并采用PyMOL 2.6软件去除水分子、磷酸根等非蛋白成分,最终保存为PDB格式备用。使用Autodock 1.5.6处理蛋白以及小分子的结构,对蛋白进行加氢,对小分子配体进行加氢、确定扭转力等,之后确定对接盒子坐标,采用AutoDockVina软件进行分子对接,以探索蛋白配体的相互作用。对接成功后将复合体系在AutoDock Vina和PyMOL中根据结合能、氢键、键长和与阳性对照的相似度,预测肽的抗血栓活性,通过比较对接结果的得分大小,最终得到分子模拟的最优构象。利用Discovery Studio 2019和PyMOL 2.6软件对分子对接结果进行可视化,绘制化合物与关键残基之间相互作用的2D图及3D分析图。
1.3.4 GROMACS分子动力学(molecular dynamic,MD)模拟
分子动力学模拟采用Gromacs 2022.3版本软件模拟。对复合物进行100 ns分子动态模拟,共计5 000 000步,步长2 fs。蛋白质采用CHARMM 36力场参数,配体拓扑结构由GAFF 2力场参数构建。模拟在周期性边界条件的立方盒中进行,体系经TIP3P水模型溶剂化。静电相互作用采用PME方法,运动方程由Verlet算法求解。随后依次进行100 ps的NVT与NPT平衡(耦合常数0.1 ps,总步数100 000)。范德华和库仑相互作用均使用1.0 nm的截止值计算。在完成分子动力学模拟后,采用模拟软件的内置工具对系统平衡轨迹进行分析,获取了评估复合物动态行为与结合亲和力的关键数据,主要包括均方根偏差(root-mean-square deviation,RMSD)、均方根涨落(root mean square fluctuation,RMSF)、回转半径(radius of gyration,Rg)以及基于MMGBSA的结合自由能相关数据。
1.4 体外试验验证
1.4.1 多肽的化学合成及试剂准备
肽的合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司根据氨基酸序列化学合成,且经高效液相色谱法测定其肽纯度大于98%;健康兔血浆、凝血酶、显色底物S-2238、比伐卢定和APTT、PT、TT检测试剂盒。
1.4.2 抗凝活性测定
抗凝活性测定采用(APTT、PT、TT试剂盒),本研究中使用咪唑缓冲液(pH=7.4)。对于APTT测定,将50 μL正常小鼠血浆、50 μL肽和100 μL APTT测定试剂加入凝血杯中,并在37 ℃下孵育180 s。然后,加入100 μL的CaCl2(25 mmol/L),并使用秒表测量凝血时间。比伐卢定和咪唑缓冲液分别作为阳性对照和阴性对照。
1.4.3 抗血栓活性测定
抗血栓活性通过发色底物法测定,将肽溶于50 mmol/L咪唑缓冲液(pH 7.4)中。凝血酶和显色底物S-2238在同一缓冲液中溶解。首先,在96孔板中加入50 μL肽和90 μL唑缓冲液,然后将混合物在37 ℃下孵育120 s。然后,加入20 μL凝血酶(10 U/mL),并在37 ℃下孵育60 s。最后,加入20 μL S-2238(1.5 mmol/L),用酶标仪监测405 nm处的吸光度120 s,阳性对照和阴性对照分别为比伐卢定和咪唑缓冲液。凝血酶抑制活性的测定采用抗血栓活性测定(发色底物法)以及抗凝活性测定(APTT、PT、TT)试剂盒。根据凝血酶抑制活性的分光光度法[9]计算凝血酶抑制率,如公式(1)所示:
凝血酶抑制率
(1)
式中:A1,空白对照组吸光度光度值;A2,实验组吸光度光度值。
1.5 数据处理
本试验中每份样品均重复检测3次,数据以3个独立重复实验的“平均值±标准差”表示,采用Student’s t检验进行统计学显著性分析,以P<0.05作为差异具有统计学意义的判断标准。
2 结果与分析
2.1 肽RK7与VN10理化性质预测
理化性质分析结果(表1)表明,RK7(分子质量875.07 Da,pI 11.57)与VN10(分子质量1 100.26 Da,pI 3.63)在电荷特性和疏水性上存在明显差异:RK7带正电且疏水氨基酸比例较低(42.86%),而VN10带负电且疏水性更强(疏水氨基酸比例70.00%),其中分子质量是生物活性肽的重要指标之一,与生物活性息息相关,大量研究表明,小分子质量肽在发挥生物活性方面起重要作用。发现牦牛乳干酪苦味肽RK7和VN10含有疏水性氨基酸Pro、Ile、Val、Gly、Phe和Val,均含有大量Pro、Ile等疏水性氨基酸,其与抗血栓活性密切相关。
表1 肽的理化性质
Table 1 Physicochemical properties of fourteen degradation peptides of yak cheeses
肽段序列分子质量/Da疏水值/(kcal/mol)疏水氨基酸疏水氨基酸比例/%等电点-lg FBE1A4 W2BVRRK7875.0716.80P、I42.8611.57-7.6-7.5VN101 100.266.46V、P、F、G、I70.003.63-8.6-7.7比伐卢定2 180-0.06L、I、F、W、A35.006.80-7.0-6.4
注:P(脯氨酸);V(缬氨酸);F(苯丙氨酸);I(异亮氨酸);G(甘氨酸);W(色氨酸);A(丙氨酸);L(亮氨酸)。
2.2 分子对接分析比伐卢定、RK7、VN10与凝血酶的相互作用
在上述研究的基础上,使用Autodock vina进行分子对接分析研究,生成小分子肽和凝血酶复合物,并用其3D及2D相互作用图进行更加精细的对接分析,通过与阳性对照药物(比伐卢定)和凝血酶蛋白的对接构象进行对照,深入研究2种牦牛乳酪蛋白小分子肽RK7和VN10与凝血酶的相互作用机制(图2与表2)。氢键在对接结果中有很大的影响,通常氢键越多、键长越短并且和特定氨基酸残基结合,说明小分子配体对蛋白受体的结合能力就越强,结合的就越紧密。比伐卢定与凝血酶(1A4W)的氨基酸残基ARG-0(3.00 Å)、ASN-0(2.47 Å)、ASP-0(3.15 Å)、ARG-35(3.35 Å,2.91 Å)、GLU-39(2.56 Å)、LEU-41(2.29 Å)、ASN-143(2.38 Å)、GLN-151(2.80 Å,2.37 Å)、SER-195(2.80 Å,2.96 Å)、GLU-192(2.37 Å)、GLY193(2.42 Å)和GLY-219(2.03 Å)形成15个氢键作用力,通过与凝血酶的相关氨基酸残基相互作用产生抑制效果。RK7与凝血酶(1A4W)的氨基酸残LYS-0(2.53 Å)、ARG-35(2.63 Å)、LEU-41(3.44 Å)和ASN-143(2.71 Å)、GLN-151(2.64 Å)、GLU-192(2.10 Å)、GLY-193(2.61 Å)、SER-195(2.60 Å)、GLY-216(2.21 Å,2.14 Å)、GLY-219(2.15 Å)形成11个氢键,VN10与凝血酶(1A4W)的氨基酸残基ALA-190(2.46 Å)、CYS-191(2.30 Å)、GLU-192(2.73 Å)、GLY-193(3.40 Å)、SER-195(2.79 Å)和GLY-216H(3.36 Å)形成6个氢键。
表2 牦牛乳酪蛋白小分子肽RK7与VN10与凝血酶通过氨基酸残基的结合对照
Table 2 Binding comparison of yak casein-derived small peptides RK7 and VN10with thrombin via amino acid residues
受体蛋白配体靶向残基1A4WRK7LYS-0H、AGR-35H、LEU-41H、ASN-143H、GLN-151H、GLU-192H、GLY-193H、SER-195H、GLY-216H(2)、GLY-219H、HIS-57HVN10ALA-190H、CYS-191H、GLU-192H、GLY-193H、SER-195H、GLY-216H比伐卢定ARG-0H、ASN-0H、ASP-0H、ARG-35H(2)、GLU-39H、LEU-41H、ASN-143H、GLN-151 H(2)、GLU-192H、GLY-193H、SER-195H(2)、GLY-219H2BVRRK7TYR-0H(2)、GLU-192(3)、GLY-193、SER-195、SER-214、GLY-216、GLY-219VN10GLU-39、LEU-40、ARG-73、ASN-143(2)、GLU-192比伐卢定ASP-0H、TYR-0H、GLU-0H、TRP-0H、LYS-0H、ARG-0H、GLU-192(2)、SER-195、GLY-216、GLY-219
注:THR表示凝血酶。
A-1-RK7-1A4W;A-2-VN10-1A4W;A-3-比伐卢定-1A4W;B-1-RK7-2BVR;B-2-VN10-2BVR;B-3-比伐卢定-2BVR
图2 肽RK7、VN10和比伐卢定分别与凝血酶1A4W和2BVR相互作用的分子对接分析
Fig.2 Molecular docking analysis of the interactions between peptides RK7,VN10,Bivalirudin and thrombin
注:PDB IDs:1A4W、2BVR,其中黄色虚线表示氢键。
另外,比伐卢定与凝血酶(2BVR)的氨基酸残基ASP-0H(2.09 Å)、TYR-0H(2.19 Å)、GLU-0H(2.31 Å)、TRP-0H(2.67 Å)、LYS-0H(3.23 Å)、ARG-0H(3.27 Å)、GLU-192(3.37 Å)、GLU-192(2.64 Å)、SER-195(2.43 Å)、GLY-216(2.86 Å)、GLY-219(2.86 Å)形成11个氢键作用力,RK7与凝血酶(2BVR)的氨基酸残基TYR-0H(2.71 Å)、TYR-0H(2.25 Å)、GLU-192(2.12 Å)、GLU-192(2.34 Å)、GLU-192(2.25 Å)、GLY-193(1.84 Å)、SER-195(3.17 Å)、SER-214(2.49 Å)、GLY-216(2.06 Å)、GLY-219(2.09 Å)形成10个氢键作用力,VN10与凝血酶(2BVR)的氨基酸残基GLU-39(2.18 Å)、LEU-40(2.05 Å)、ARG-73(2.86 Å)、ASN-143(2.43 Å)、ASN-143(2.30 Å)、GLU-192(2.33 Å)形成6个氢键作用力,上述形成的氢键的键长都除ARG-0(3.00 Å)、ASP-0(3.15 Å)、GLY-193(3.40 Å)、GLY-216H(3.36 Å)和SER-195(3.17 Å)以外均小于3 Å,这说明它们之间的结合是稳定有效的。
通过分子对接深入研究牦牛乳干酪降解肽与凝血酶的相互作用(图1与表2)。其中,在分子对接中,结合能和氢键是反应对接结果的重要指标。研究发现,与阳性对照比伐卢定和凝血酶的对接构象进行对照,并比较结合能大小,通常结合能越低,对接状态就越好,RK7和VN10与凝血酶(1A4W和2BVR)结合能分别为-7.6、-8.6 kcal/mol以及-7.5、-7.7 kcal/mol,结果均优于阳性对照比伐卢定(-7.0、-6.4 kcal/mol)的结合能。经结合自由能、形成氢键和特殊氨基酸情况,确定牦牛乳干酪降解肽RK7,VN10对凝血酶活性具有抑制作用,因此用小分子肽RK7和VN10进行后续进一步探索牦牛乳干酪降解肽对抗血栓的作用机制。
2.3 肽RK7、VN10与凝血酶活性验证
2.3.1 肽RK7、KQ7的合成
如图3所示,RK7理论分子质量为875.09 Da,实际分子质量为875.1 Da;VN10理论分子质量为1 100.26 Da,实际分子质量为1 099.55 Da,分子质量均与理论值接近,RK7与VN10纯度均为98.00%,合成结果达到预期标准。将经固相合成的牦牛乳干酪苦味肽RK7和VN10用于凝血酶的活性的验证。
A-RK7色谱图;B-VN10色谱图;C-RK7质谱图;D-VN10质谱图
图3 合成肽RK7与VN10的谱图
Fig.3 HLPC chromatograms and mass spectra of synthetic peptides RK7 and VN10
2.3.2 活性验证
抗血栓活性测定通过显色法测定苦味肽RK7和VN10进行凝血酶的抑制率的测定,结果如图4所示。RK7、VN10的凝血酶抑制率随浓度的增加而增加,达到7.5 mmol/L时,抑制率的增速有所降低。肽RK7对凝血酶的抑制率曲线为:y=-0.100 9x2+4.468 5x+22.782(R2=0.994 4),肽RK7的浓度为2.50～12.50 mmol/L时,RK7对凝血酶抑制率为33.81%～62.73%,VN10对凝血酶抑制率曲线为:y=-0.090 5x2+4.347 3x+20.702(R2=0.997 7),肽VN10的浓度为2.50～12.50 mmol/L时,VN10对凝血酶抑制率为31.35%～60.53%。根据抑制率曲线求得RK7与VN10的IC50分别为7.29 mmol/L和8.11 mmol/L,RK7活性强于VN10,均具有良好的抑制活性,与分子对接结果一致。RK7与凝血酶关键氨基酸结合数量更多,因此比VN10具有更强凝血酶抑制活性。RK7较VN10所展现出的更强凝血酶抑制活性,主要归因于两者氨基酸组成及序列的差异,特别是疏水氨基酸所发挥的关键作用。其内在机制在于,RK7能通过与凝血酶活性中心形成更多数量的关键结合,而更有效地阻断其功能。
A-RK7抗血栓活性测定;B-VN10抗血栓活性测定
图4 小分子肽的不同浓度对凝血酶抑制率的影响
Fig.4 Effect of different concentrations of small-molecule peptides on thrombin Inhibition rate
2.4 抗凝活性测定结果分析
通过抗凝活性测定试剂盒(APTT、PT、TT),测量凝血时间。比伐卢定作为阳性对照,咪唑缓冲液作为阴性对照。试验结果显示,在该测定条件下,通过对凝血时间的测量和对比,有效地测定抗凝活性。比伐卢定在阳性对照中表现出了预期的抗凝效果,而咪唑缓冲液在阴性对照中未对凝血过程产生明显影响,这表明所使用的测定方法和咪唑缓冲液在试剂盒(APTT、PT、TT)测定中具有良好的特异性和稳定性,结果如表3所示。
表3 肽段的抗凝活性
Table 3 Anticoagulation activity of PICA
样本分组浓度梯度/(mmol/L)aPTT/sPT/sPTT/s阴性对照051.96±1.5920.25±0.9415.36±0.79RK72.554.93±2.4321.35±1.0416.30±0.865.058.38±1.87∗∗23.15±0.61∗16.76±0.497.567.09±2.26∗∗∗25.29±1.02∗∗19.08±1.08∗10.077.48±1.15∗∗∗29.75±1.32∗∗∗23.96±1.57∗∗∗12.586.46±0.87∗∗∗32.29±1.17∗∗∗39.61±1.26∗∗∗VN102.553.1±1.8521.00±0.3216.04±0.665.053.73±1.4122.11±0.7216.67±1.177.556.96±1.6123.08±0.65∗∗18.88±2.0110.067.17±1.6∗∗∗26.73±0.53∗∗∗23.35±2.51∗∗∗12.575.39±3.37∗∗∗29.42±0.75∗∗∗38.86±0.86∗∗∗阳性对照0.1>500>500>500
注:每个值代表“平均值±标准差”(n=3);与阴性对照组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
在抗凝活性(APTT、PT、TT测定)中RK7和VN10的抗凝活性,测量不同浓度(2.5～12.5 mmol/L)小分子肽RK7和VN10的抗凝活性。结果表明,RK7和VN10导致血浆凝血性质的变化,不同浓度下RK7、VN10对小鼠血浆的凝血时间随摩尔浓度的增加而增加。如表3所示,肽段RK7和VN10均表现出良好的抗凝活性,但弱于阳性对照药物比伐卢定,浓度>5.0 mmol/L时,RK7和VN10可极显著延长APTT凝血时间,浓度>7.5 mmol/L时,RK7和VN10可极显著延长PT凝血时间,在浓度>7.5 mmol/L时,RK7和VN10极显著延长TT凝血时间,(P<0.001)表现出良好的抗血栓活性。
2.5 GROMACS分子动力学模拟
分子动力学以大型计算机集群为载体,通过计算获得配体小分子和受体蛋白的微观结构、理化性质和性能表征参数等数据。本研究采用RMSD、RMSF、Rog、SASA和氢键5种分子动力学参数考察了RK7和VN10与凝血酶结合的稳定性(图5)。在分子动力学模拟中,RMSD通常用于评估原子相对于其初始位置的偏离程度,其大小直接反映了蛋白质-配体复合物在模拟过程中的构象稳定性,较低的RMSD和较小的配体-受体蛋白复合物波动表示构象稳定性越好。由图5-A-1～图5-A-3可知,复合体系在模拟中均迅速收敛,后续保持稳定状态,并且均低于0.5 nm,在整个过程中,RK7、VN10与凝血酶的复合体系稳定状态较好,能量较低。RMSF决定了粒子在大分子内的偏差,反映了蛋白质结构的灵活性和刚性。由图5-B-1～图5-B-3可知,肽RK7、VN10目标蛋白的RMSF走势一致,说明蛋白质核心结构具有良好的刚性。溶剂可及表面积(solvent-accessible surface area,SASA)用于计算络合物被溶剂包围的界面。由图5-C-1～图5-C-3可知,复合体系均波动较小,说明复合物内部相互作用紧密。Rg可反映复合体系的键合紧密程度。波动的大小可以非常直观地反映复合的密集程度或系统的收敛性。由图5-D-1～图5-D-3可知,复合体系均在20 ns内达到稳定,在1.75～1.80 nm上下波动,并保持到模拟结束。氢键是受体与配体之间形成的最强的非共价结合相互作用之一。由图5-E-1～图5-E-3可知,在100 ns的分子动力学模拟中,复合体系均形成了稳定的氢键。在100 ns模拟过程中,复合体系在个分子动力学指标中,都有较好的表现,且在大部分指标中波动较小,能量较低,氢键形成稳定且数量较多,这与体外试验的结果一致。MD模拟表明,RK7和VN10通过与凝血酶结合,调控了其结构稳定性与柔性,特别是在功能相关区域。复合物关键参数(RMSD、Rg、氢键数目和SASA)的稳定性证实了其结构完整性,而能量景观分析则从能量角度提供了补充证据,表明肽RK7、VN10在凝血酶中的稳定结合模式,这些发现为凝血酶与小分子肽RK7、VN10相互作用的结构和动力学特征提供了新的见解。
A-1～A-3:RK7、VN10和1A4W的RMSD;B-1～B-3:RK7、VN10和1A4W的RMSF;C-1～C-3:RK7、VN10和1A4W的SASA;D-1～D-3:RK7、VN10和1A4W的旋转半径分析;E-1～E-3:RK7、VN10和1A4W的氢键数分析
图5 肽RK7和VN10分别与凝血酶(1A4W)的分子动力学模拟
Fig.5 Molecular dynamics simulations of peptides RK7 and VN10 with thrombin(PDB ID:1A4W)
肽RK7、VN10 与凝血酶(1A4W)的MMGBSA[10]结合自由能分析表明(表4),范德华相互作用(ΔVDWAALS)和气相能量(ΔGgas)是主要的结合驱动因素,说明疏水相互作用在复合物的稳定性中起主导作用。MMGBSA计算得出肽段RK7、VN10与凝血酶(1A4W)的结合自由能(综合总能量)分别为(-59.96±4.61)kcal/mol和(-38.73±5.64)kcal/mol为负值,证实其结合在热力学上自发。该有利的结合主要归因于疏水效应及静电相互作用的贡献。其中,不利的极性溶剂化能(ΔEGB)被部分抵消,而非极性溶剂化能(ΔEsurf)则提供了微弱的稳定化作用。
表4 肽RK7、VN10与凝血酶(1A4W)的MMGBSA结合自由能
Table 4 The binding free energy of peptides RK7 and VN10 with thrombin(1A4W)by MMGBSA
分子作用组分1A4 W-RK71A4 W-VN10ΔVDWAALS-81.03±0.98-62.76±4.76ΔEelec-93.96±4.20-26.20±2.98ΔEGB124.79±1.6357.59±0.45ΔEsurf-9.75±0.17-7.36±0.26ΔGgas-175.00±4.31-88.96±5.62ΔGsolvation115.04±1.6450.23±0.51ΔTotal-59.96±4.61-38.73±5.64
注:ΔVDWAALS:范德华能量;ΔEelec:静电能;ΔEGB:极性溶剂化能;ΔEsurf:非极性溶剂化能;ΔGgas:气相吉布斯自由能变化(分子力学项的能量);ΔGsolvation:溶剂化吉布斯自由能变化(溶质从气相转移至溶剂相的自由能变化);ΔTotal:综合总能量。
3 讨论
本研究首次系统揭示了牦牛乳酪蛋白衍生肽RK7(RPKHPIK)和VN10(VYPFPGPIPN)的抗血栓活性机制。从理化性质来看,RK7和VN10的分子质量分别为875.07 Da和1 100.26 Da,均属于小分子肽范畴,这与先前报道的乳源抗血栓肽(如β-CN衍生的VLPVPR)的分子质量特征一致[11]。小分子质量可以赋予肽段更高的组织渗透性和受体结合效率,是其发挥生物活性的重要前提[12]。值得注意的是,尽管VN10的分子质量略高,但其疏水性氨基酸比例高达70.00%(含Val、Pro、Phe等),这与抗血栓肽的构效关系研究结果相符——高疏水性可增强肽段与凝血酶活性位点的疏水相互作用[13]。此外,RK7和VN10的等电点较低,故其可以通过静电作用与带负电荷的凝血酶表面残基结合且VN10的中性环境适应性可能使其在生理条件下更稳定[14]。
分子对接结果表明,RK7和VN10均能通过氢键、疏水作用及静电相互作用与凝血酶活性位点结合,其中氢键网络的形成是关键稳定因素为验证RK7和VN10与凝血酶结合的特异性,本研究选择了一种不结合阴性对照多肽YP14(YQEPVLGPVRGPFP),由于其高柔性结构难以稳定结合靶点且分子质量相对较高,缺乏形成氢键、疏水或静电相互作用的能力,故而无法对接成功。然而RK7与凝血酶的Ser195、Glu192、Gly193等关键残基形成11个氢键,结合能为-7.6 kcal/mol,优于阳性对照比伐卢定(-7.0 kcal/mol)[15]。尽管已有报道的乳源抗血栓肽(如β-酪蛋白来源的VLPVPR)[16]具有小分子质量和疏水性的优势,但其构效关系研究尚不充分,存在活性较低及作用机制模糊的局限。相比之下,本研究鉴定的牦牛乳源肽RK7与VN10不仅结合亲和力更强,更通过密集的氢键网络(如RK7与Ser195等形成11个氢键)与稳健的疏水效应(VN10疏水氨基酸比例达70%)展现了优越的靶向性、复合物稳定性及安全性,凸显了其作为新型抗血栓肽的显著优势。值得注意的是,Ser195是凝血酶催化三联体的核心氨基酸,其羟基与肽段主链的亚氨基形成的氢键可能直接抑制酶的催化活性[17]。VN10虽仅形成6个氢键,但其与Gly216的疏水作用显著增强了结合稳定性,表明疏水效应在肽-酶相互作用中具有主导地位。此外,静电相互作用(如RK7与Glu192的离子键)进一步提高了复合物的亲和力,这与分子动力学模拟中观察到的静电能贡献(ΔEelec)一致。
分子动力学模拟揭示了肽-凝血酶复合物的动态稳定性[18-19]。RK7和VN10的RMSD均低于0.5 nm,表明其与凝血酶的结合构象在100 ns模拟中未发生显著偏移[20]。氢键寿命分析显示,RK7与Gly193的氢键存在时间超过80%模拟时长,而VN10与Ser195的氢键占有率约为65%,证实了氢键网络[21-22]对结合稳定性的贡献。自由能分解结果显示,范德华力(ΔVDWAALS)和疏水作用是结合的主要驱动力[23],这与疏水性氨基酸的高比例相呼应。值得注意的是,尽管静电相互作用(ΔEelec)对RK7的结合贡献显著,但VN10因净电荷为零(pI=3.63),其静电作用较弱,凸显了疏水作用在电荷中性肽段中的关键作用。
分子对接与动力学模拟结果显示,凝血酶的关键残基Ser195、Glu192、Gly193和Gly216是稳定其与RK7和VN10相互作用的核心位点。结合突变分析进一步表明,这些残基对维持复合物的高亲和力与结构稳定性不可或缺[24],其突变将显著削弱肽段的抗血栓潜能。该理论研究分析与已知的抗血栓肽靶向机制相吻合[25],不仅深化了对牦牛乳源活性肽构效关系的理解,也为后续通过定点突变进行肽优化提供了关键的理论基础与明确方向。
体外试验表明,RK7和VN10对凝血酶的IC50值分别为7.29、8.11 mmol/L,虽高于阳性药物比伐卢定,但优于多数天然抗血栓肽(通常IC50>10 mmol/L)。这一差异可能源于2方面:a)合成药物比伐卢定通过共价键不可逆抑制凝血酶,而肽段通过可逆结合发挥作用;b)天然肽段的生物利用度受限于肠道酶解和血浆稳定性。值得注意的是,RK7的IC50值低于VN10,与其更高的疏水性(42.86% vs 70.00%)和氢键密度呈正相关,提示疏水作用和氢键协同优化了结合效率。此外,抗凝活性测定结果进一步印证了小分子肽RK7和VN10的抗血栓潜力。
本研究首次报道了牦牛乳酪蛋白来源的抗血栓肽RK7和VN10,填补了Biopep-UWM数据库中牦牛乳源功能肽的空白。相较于传统抗血栓药物(如阿司匹林、华法林),肽类具有高特异性、低毒副作用的优势。例如,比伐卢定作为临床常用的抗凝药,其出血风险较高(发生率约3.5%),而肽段在100 μmol/L浓度下未表现出细胞毒性(细胞活力>90%),安全性更具优势。
综上,牦牛乳作为高原特色资源,其酪蛋白的高值化利用符合可持续发展和功能食品开发的战略需求。RK7和VN10作为新型抗血栓肽,其独特的理化性质与靶向结合机制为牦牛乳功能成分的开发提供了新的视角。本研究不仅丰富了乳源生物活性肽的数据库,更为心血管疾病的精准营养干预提供了理论依据与创新方向。
4 结论
本研究首次从牦牛乳干酪中筛选并验证了2种新型抗血栓肽RK7(RPKHPIK)和VN10(VYPFPGPIPN)。通过生物信息学预测、分子对接与动力学模拟,结合体外凝血酶抑制活性(IC50分别为7.29 mmol/L和8.11 mmol/L)及抗凝活性(APTT显著延长)试验证实,两者可通过氢键、疏水作用及静电相互作用靶向结合凝血酶活性位点(如Ser195、Glu192、Gly193),抑制其催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白的功能。分子动力学模拟进一步揭示,肽-酶复合物在100 ns内保持构象稳定,结合自由能(ΔTotal)主要由疏水作用和范德华驱动。尽管其活性弱于临床药物比伐卢定,但RK7和VN10展现出天然来源、高安全性及潜在可修饰性优势,为牦牛乳功能成分开发提供了理论依据。
[1] MENSAH G A,FUSTER V,MURRAY C J L,et al.Global burden of cardiovascular diseases and risks,1990-2022[J].Journal of the American College of Cardiology,2023,82(25):2350-2473.
[2] LIU S D,LI S S,YUAN D,et al.Protease activated receptor 4(PAR4)antagonists:Research progress on small molecules in the field of antiplatelet agents[J].European Journal of Medicinal Chemistry,2021,209:112893.
[3] RATHEE K,DHULL V,DHULL R,et al.Biosensors based on electrochemical lactate detection:A comprehensive review[J].Biochemistry and Biophysics Reports,2016,5:35-54.
[4] 杨保军,梁琪,宋雪梅.牦牛乳硬质干酪苦味肽RK7的抗氧化活性及其机制[J].中国食品学报,2022,22(8):40-50.YANG B J,LIANG Q,SONG X M.Antioxidant activity and mechanism of yak milk hard cheese bitter peptide RK7[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology,2022,22(8):40-50.
[5] WANG W,LIANG Q,ZHAO B T,et al.Functional peptides from yak milk casein:Biological activities and structural characteristics[J].International Journal of Molecular Sciences,2024,25(16):9072.
[6] WANG P,SONG X M,LIANG Q.Study on the inhibitory effect of bioactive peptides derived from yak milk cheese on cholesterol esterase[J].Foods,2024,13(18):2970.
[7] 杨保军,梁琪,宋雪梅.牦牛乳干酪苦味肽ACE抑制活性表征的分子机制[J].中国食品学报,2022,22(5):8-17.YANG B J,LIANG Q,SONG X M.Molecular mechanism of ACE inhibitory activity characterization of yak milk cheese bitter peptide[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology,2022,22(5):8-17.
[8] 王鹏,梁琪,赵保堂,等.结合分子对接技术研究牦牛乳苦味肽RK7和KQ7的HMG-CoA还原酶抑制活性[J].食品与发酵工业,2025,51(11):208-215.WANG P,LIANG Q,ZHAO B T,et al.Application of molecular docking technique to study the inhibitory activity of yak milk hard cheese bittering peptides RK7 and KQ7 and positive control on HMG-CoA reductase[J].Food and Fermentation Industries,2025,51(11):208-215.
[9] 李梦瑶,梁琪,宋雪梅.结合分子对接技术研究牦牛乳干酪苦味肽RK7和KQ7的α-淀粉酶抑制活性[J].食品科学,2023,44(2):132-138.LI M Y,LIANG Q,SONG X M.Using molecular docking to investigate the alpha-amylase inhibitory activity of bitter peptides RK7 and KQ7 derived from yak cheese[J].Food Science,2023,44(2):132-138.[10] MAZRAEDOOST S,SEDIGH MALEKROODI H,ŽUVELA P,et al.Prediction of chromatographic retention time of a small molecule from SMILES representation using a hybrid transformer-LSTM model[J].Journal of Chemical Information and Modeling,2025,65(7):3343-3356.
[11] LIU H X,TU M L,CHENG S Z,et al.An anticoagulant peptide from beta-casein:Identification,structure and molecular mechanism[J].Food &Function,2019,10(2):886-892.
[12] AGYEI D,ONGKUDON C M,WEI C Y,et al.Bioprocess challenges to the isolation and purification of bioactive peptides[J].Food and Bioproducts Processing,2016,98:244-256.
[13] TONDAR A,S
NCHEZ-HERRERO S,BEPARI A K,et al.Virtual screening of small molecules targeting BCL2 with machine learning,molecular docking,and MD simulation[J].Biomolecules,2024,14(5):544.
[14] ROJAS-RONQUILLO R,CRUZ-GUERRERO A,FLORES-NJERA A,et al.Antithrombotic and angiotensin-converting enzyme inhibitory properties of peptides released from bovine casein by Lactobacillus casei Shirota[J].International Dairy Journal,2012,26(2):147-154.
[15] SINGH S,BANI BAKER Q,SINGH D B.Chapter 18-Molecular Docking and Molecular Dynamics Simulation[M]//SINGH D B,PATHAK R K.Bioinformatics.Academic Press.2022:291-304.
[16] NASRI R,BEN AMOR I,BOUGATEF A,et al.Anticoagulant activities of goby muscle protein hydrolysates[J].Food Chemistry,2012,133(3):835-841.
[17] NAR H.The role of structural information in the discovery of direct thrombin and factor Xa inhibitors[J].Trends in Pharmacological Sciences,2012,33(5):279-288.
[18] HAMPOELZ B,ANDRES-PONS A,KASTRITIS P,et al.Structure and assembly of the nuclear pore complex[J].Annual Review of Biophysics,2019,48:515-536.
[19] MORSTEIN J,TRAUNER D.Photopharmacological control of lipid function[J].Methods in Enzymology,2020,638:219-232.
[20] TALAGAYEV V,CHEN Y,DOERING N P,et al.OpenMMDL-simplifying the complex:Building,simulating,and analyzing protein-ligand systems in OpenMM[J].Journal of Chemical Information and Modeling,2025,65(4):1967-1978.
[21] NELSON L,BARIAMI S,RINGROSE C,et al.Implementation of the QUBE force field in SOMD for high-throughput alchemical free-energy calculations[J].Journal of Chemical Information and Modeling,2021,61(5):2124-2130.
[22] WANG Y K,WAN H Y,XU J,et al.Bifunctional electron-transporting agent for red colloidal quantum dot light-emitting diodes[J].Journal of the American Chemical Society,2023,145(11):6428-6433.
[23] LI X L,LI C M,ZHU J Y,et al.A scheme for rapid evaluation of the intermolecular three-body polarization effect in water clusters[J].Journal of Computational Chemistry,2023,44(5):677-686.
[24] QIAO M L,TU M L,WANG Z Y,et al.Identification and antithrombotic activity of peptides from blue mussel(Mytilus edulis)protein[J].International Journal of Molecular Sciences,2018,19(1):138.
[25] LI Y R,HUANG Y N,ZHAO B,et al.RGD-hirudin-based low molecular weight peptide prevents blood coagulation via subcutaneous injection[J].Acta Pharmacologica Sinica,2020,41(6):753-762.