β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21,β-D-glucosidase)作为糖苷水解酶家族的重要成员之一,于1837年首次发现于苦杏仁汁中,能够特异性催化末端非还原性β-D-葡萄糖苷键的水解反应,从而进一步释放出葡萄糖与对应的糖苷配基[1]。β-葡萄糖苷酶属于纤维素酶类,作为纤维素酶系的关键限速酶,β-葡萄糖苷酶的催化效率能够对纤维素降解的整体速率与程度起到决定性的作用[2]。β-葡萄糖苷酶凭借其独特的催化特性,在生物质能源转化、食品加工(如风味物质释放、功能性成分制备)、生物医药和植物保护等多个领域展现出广阔的应用前景[3-5]。目前工业上规模化应用的β-葡萄糖苷酶主要来源于植物及真菌,而对细菌来源的β-葡萄糖苷酶挖掘的不够充分,其应用范围及规模相对有限[6-7]。虽然β-葡萄糖苷酶的工业应用潜力巨大,但其规模化应用仍面临诸多瓶颈,如酶活力偏低导致的催化效率不足,热稳定性较差难以适应工业生产中的高温工艺条件,且酶活力易受水解产物(如葡萄糖)的反馈抑制等,显著限制了其应用范围,增加企业生产能耗与成本,制约了其产业化进程的推进[8]。因此,挖掘新型高效、热稳定且抗产物抑制的β-葡萄糖苷酶,成为突破当前技术瓶颈、推动其工业应用升级的关键[9]。
嗜热微生物是一类长期生存在高温环境下的微生物,其体内代谢系统及酶类分子进化出独特的空间结构与功能特性,是高温酶、热稳定性酶的重要天然资源库[10-11]。随着高通量测序技术的飞速发展及基因测序成本的持续降低,越来越多嗜热微生物的全基因组序列被解析并纳入公共数据库,为功能酶基因的挖掘提供了丰富的素材。已完成测序的嗜热微生物基因组中,蕴藏着众多尚未被深入研究和开发利用的功能酶编码基因,其中极有可能筛选出具有高效催化活性、优良热稳定性及抗产物抑制能力的新型β-葡萄糖苷酶,为解决当前β-葡萄糖苷酶工业应用中的技术难题提供新的思路与支撑[12]。
嗜热玫瑰红球菌(Thermomicrobium roseum)作为一类典型的嗜热微生物,其基因组中可能含有潜在的新型β-葡萄糖苷酶基因。本研究以NCBI数据库中T.roseum基因组中分析比对获得的一个新型的β-葡萄糖苷酶序列为研究对象,通过密码子偏好性优化,合成基因序列并构建重组表达载体。通过电转化法将重组载体导入至大肠杆菌细胞内实现目的基因的异源表达,进一步纯化得到高纯度β-葡萄糖苷酶,并对其催化活性、热稳定性、pH适配性及抗产物抑制能力等关键酶学性质开展系统性分析,旨在挖掘新型高效的β-葡萄糖苷酶资源,为该酶在食品发酵、生物质转化等领域的工业化应用提供理论基础和技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株与质粒
大肠杆菌BL21(DE3)菌株来自于本实验室保存菌种,使用前经平板划线分离活化后使用;pET 22b 表达质粒由通用生物系统(安徽)有限公司提供。
1.1.2 主要试剂
Ni-NTA 柱胶,翌圣生物科技(上海)股份有限公司;对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside,pNPG)、邻硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(o-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside,oNPG)、纤维二糖、乳糖,阿拉丁生化科技股份有限公司;蛋白质marker、IPTG、氨苄青霉素、葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、木糖、麦芽糖、蔗糖、阿拉伯糖,上海生工生物工程有限公司;BCA蛋白定量检测试剂盒、葡萄糖检测试剂盒,上海碧云天生物技术有限公司;酵母提取物、胰蛋白胨,英国Oxoid公司;其他常规试剂主要从国药集团化学试剂公司购置。
1.2 仪器与设备
1652100微生物电穿孔仪、1658033小型垂直电泳转印系统,美国Bio-Rad公司;1600凝胶成像仪,上海天能生命科学有限公司;LRH-70生化培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;ZHJH-C1115C超净工作台、ZHWY-200B恒温培养振荡器,上海智城分析仪器制造有限公司;JY88-IIN超声波细胞粉碎机,宁波新芝生物科技股份有限公司;7200可见分光光度计,尤尼柯(上海)仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 序列分析与重组质粒构建
β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列及保守结构域分析所需数据来源于NCBI与碳水化合物活性酶数据库(Carbohydrate-Active enZYmes Database,CAZy),蛋白的理论分子质量的分析预测主要通过ExPASy在线翻译工具完成,不同微生物来源β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列分析比对工作主要通过Clustal Omega在线分析软件完成。bgl95基因的人工合成以及重组表达质粒pET22b-bgl95的构建工作,主要通过委托通用生物系统(安徽)有限公司完成。
1.3.2 蛋白的异源表达与纯化
采用电转化法将重组质粒pET22b-bgl95导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经抗性筛选后挑取阳性单菌落,接种至含氨苄青霉素的LB液体培养基中,于37 ℃、220 r/min条件下进行摇床振荡培养,当培养液的OD600nm值达到0.6～0.8时,加入IPTG使其终浓度为1 mmol/L以诱导目的蛋白的表达,继续在 37 ℃、220 r/min条件下诱导培养12 h后,于4 ℃、8 000 r/min离心10 min收集菌体,加适量纯水重悬菌体,离心10 min后,获得清洗后的菌体沉淀。加入50 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH 7.5)重悬菌体,冰浴超声破碎20 min后,将破碎液置于 4 ℃、12 000 r/min的条件下离心20 min,收集离心后的上清液部分,得到粗酶液。将粗酶液通过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化处理,即获得纯化后的目的蛋白Bgl95,将纯化后的蛋白置于50 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH 7.5)中进行透析处理,去除杂离子与杂质后,经超滤浓缩处理,得到浓缩后的Bgl95纯蛋白,将蛋白样品置于4 ℃条件下保存,以备后续实验使用。采用SDS-PAGE检测目的蛋白的分子质量与纯度,蛋白浓度通过BCA蛋白定量检测试剂盒测定。
1.3.3 酶活力测定方法
以pNPG为底物测定Bgl95的酶活力,反应体系中pNPG终浓度为5 mmol/L,反应体系总体积为1 mL(含适量纯化酶液与50 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4缓冲液,pH 7.5)。将配置完成的反应体系置于最适反应温度下恒温反应5 min,随即加入等体积1 mol/L的Na2CO3溶液终止酶促反应;采用紫外分光光度计测定反应产物对硝基苯酚(p-nitrophenol,pNP)在410 nm波长下的吸光值(OD410nm值),以未添加酶液的空白反应体系作为对照,依据吸光值差异计算不同反应条件下酶的相对活力。同时,配制一系列不同浓度的PNP标准溶液,测定其OD410mm值并绘制标准曲线,用于酶活力的定量计算。在上述酶促反应条件下,将每分钟催化水解底物生成1 μmol PNP所需的酶蛋白量,定义为一个酶活力单位(U)。
1.3.4 最适反应温度和最适反应pH的测定
在20～100 ℃内,以 5 ℃为梯度设置反应温度梯度,测定各温度下Bgl95的相对酶活力,以测得的最高酶活力为100%换算不同温度对应的相对酶活力,以此确定该酶的最适反应温度。
配制50 mmol/L不同pH值的缓冲液体系,其中pH 4.0～5.0采用Na2HPO4-柠檬酸缓冲液,pH 5.0～9.0采用Na2HPO4-KH2PO4缓冲液,在最适反应温度下,分别以不同pH缓冲液配制反应体系,测定各pH条件下的相对酶活力,以最高酶活力为100%,计算不同pH下的相对酶活力,确定其最适反应pH。
1.3.5 热稳定性和pH稳定性分析
将酶液分别置于75 ℃、80 ℃、85 ℃恒温条件下孵育,分别在孵育0、5、10、15、20、25、30、60 min时取样,迅速置于冰浴中终止热胁迫;随后在最适反应条件下,测定各时间点样品的残余酶活力。以未进行热孵育处理的酶液在最适条件下测定的酶活力为100%,计算各时间点样品的残余酶活力,分析Bgl95的热稳定性。
将酶液分别稀释至不同pH缓冲液(pH 4.0～9.0)中,置于4 ℃冰箱中保存48 h后,在最适反应条件下测定各pH处理组的残余酶活力。以未进行pH处理并直接在最适条件下测定的酶活力为100%,计算各pH处理组的残余酶活力,分析Bgl95在不同pH环境下的酸碱稳定性。
1.3.6 金属离子和化学试剂对酶活力的影响
在标准酶活力测定体系中,分别添加终浓度5 mmol/L的各类金属离子(Zn2+、Mg2+、Mn2+、Fe3+、Fe2+、Co2+、Cu2+、Ca2+、Cr2+、Ni2+)、终浓度5 mmol/L的Urea和EDTA、以及终质量分数为1%的Triton X-100、Tween 80、SDS,以未添加任何金属离子与化学试剂的标准酶活力体系作为空白对照,于最适反应条件下完成各组反应并测定残余酶活力。以空白对照组的酶活力为基准,计算各处理组的相对酶活力,以此分析不同金属离子与化学试剂对Bgl95催化活力的调控效应。
1.3.7 酶对底物的水解特异性和酶促反应动力学
最适反应条件下,分别以不同类型底物测定其水解特异性,其中人工合成底物选用终浓度为5 mmol/L的pNPG和oNPG,按照标准酶活力测定方法测定酶活力;天然底物选用终质量分数为1%的纤维二糖和乳糖,反应结束后采用葡萄糖检测试剂盒测定反应产物中葡萄糖的生成量,间接计算酶活力。以pNPG为底物时的酶活力为100%,比较Bgl95对不同底物的水解效率,明确其底物特异性。
提前配制好不同浓度(0.5～10 mmol/L)的pNPG底物溶液,在最适反应条件下,分别测定不同底物浓度下的酶活力。根据米氏方程,结合Lineweaver-Burk双倒数作图法进行数据拟合分析,分析计算出Bgl95的米氏常数(Km)与最大反应速率(Vmax)2个关键动力学参数。
1.3.8 各类糖对酶活力的影响
以50 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH 7.5)为溶剂,分别配制浓度为1 mol/L的各类糖的母液。在标准酶活力测定体系中,分别加入各类糖母液,使体系中糖的终浓度为0.1 mol/L;以未添加任何糖的实验组作为空白对照,在最适反应条件下测定各组酶活力。设定空白对照组的酶活力为100%,计算各实验组的相对酶活力,分析0.1 mol/L浓度下的各类糖对Bgl95酶活力的影响。
1.3.9 高浓度葡萄糖与木糖对酶活力的影响
最适反应条件下,在酶活力测定体系中分别添加不同浓度梯度(0～4.0 mol/L)的葡萄糖或木糖溶液,以未添加葡萄糖和木糖的实验组作为空白对照,测定各组酶活力。以空白对照组的酶活力为100%,计算不同浓度葡萄糖、木糖处理组的相对酶活力,明确高浓度葡萄糖和木糖对Bgl95酶活力的影响,评估其产物耐受性。
1.4 数据处理方法
本研究所有实验均采用3次独立重复设计,每次独立实验设置3组平行样;采用Origin 2024软件进行实验数据拟合、分析及图表绘制,图片优化采用Adobe Photoshop CS8软件。
2 结果与分析
2.1 蛋白的氨基酸序列分析
Bgl95蛋白的氨基酸序列(ACM06095)来源于嗜热微生物T.roseum基因组,该菌株已完成全基因组测序[13]。生物信息学分析显示,Bgl95由452个氨基酸残基组成,ExPASy在线工具预测其理论分子质量为52 kDa。通过NCBI数据库中的Blast序列比对程序开展氨基酸序列同源性分析,结果显示,Bgl95的氨基酸序列与糖苷水解酶GH1家族的β-葡萄糖苷酶存在较高的同源性,据此推测该酶归属于GH1家族。为进一步明晰Bgl95的氨基酸序列保守特征,选取5条已有文献报道的GH1家族β-葡萄糖苷酶氨基酸序列与Bgl95进行多序列比对分析,5条序列信息分别来源于黄热厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus flavithermus subsp.yunnanensis E13T)的BglP(KF453503)[14]、热解糖高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)的BglY(AST56446)[15]、嗜热淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans)的Bgl52(AWI14273)[16]、Microcerotermes annandalei的MaBG(KU170546)[17]以及脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus sp.A4)的AsBG1(KY039184)[18]。多序列比对结果如图1所示,Bgl95与GH1家族不同来源的β-葡萄糖苷酶之间共享保守序列NEP和TENG,该保守序列是GH1家族β-葡萄糖苷酶的标志性特征,与酶的催化活性发挥存在紧密关联性,其中2个高度保守的谷氨酸残基Glu166和Glu357,分别在催化反应中作为酸/碱催化基团与亲核基团,共同介导酶促反应的顺利进行。
图1 Bgl95与5种GH1家族来源β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列比对
Fig.1 Amino acid sequence alignment of Bgl95 and five GH1 family derived β-glucosidases
2.2 重组表达与纯化
SDS-PAGE检测结果如图2所示,含重组质粒pET22b-bgl95的菌体破碎上清液在45 kDa和66 kDa之间出现一条清晰的特异性目的条带,与理论分子质量基本相符,表明重组的bgl95基因在大肠杆菌中成功实现了可溶性表达。经Ni-NTA柱纯化后,杂蛋白条带基本消失,经检测,纯化后Bgl95蛋白质量浓度为2.52 μg/μL。
泳道M-蛋白marker;泳道1-含pET22b的大肠杆菌BL21(DE3)破碎液上清液;泳道2-含pET22b-bgl95的大肠杆菌BL21(DE3)破碎液上清液;泳道3-纯化后的Bgl95蛋白
图2 重组蛋白Bgl95的SDS-PAGE分析
Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant protein Bgl95
2.3 最适反应条件和稳定性
最适反应温度曲线如图3-a所示,在20～90 ℃内,Bgl95酶活力随温度升高显著上升,于90 ℃时达到峰值,表现出最高催化活性;温度继续升至100 ℃时,酶活力虽有所下降,但仍可保留32%的相对活力,表明该酶具有较强的耐高温特性。温度稳定性实验结果如图3-b所示,该酶在75 ℃下孵育1 h后,仍可保留56%以上的残余酶活力,表明其热稳定性良好;在80 ℃下,酶活力衰减较快,半衰期约为10 min;而在85 ℃下,酶活力下降更为显著。最适反应pH结果如图3-c所示,Bgl95在pH值为7.5时相对酶活力最高,同时该酶在pH 5.0～8.5,相对酶活力可维持在65%以上,表明Bgl95对酸碱环境具有较广泛的适应性,能够在偏酸、中性及弱碱性条件下发挥催化功能。pH稳定性实验结果如图3-d所示,该酶具有优良的pH稳定性,其中在pH 5.0～9.0范围内保存48 h后,残余酶活力仍可维持在90%以上;即使在pH 4.0的酸性条件下,仍可保留65%以上的残余酶活力,说明Bgl95对复杂酸碱环境均具有良好适应性。
a-最适反应温度;b-温度稳定性;c-最适反应pH;d-pH稳定性
图3 Bgl95的最适反应条件以及稳定性分析
Fig.3 Optimal reaction conditions and stability analysis of Bgl95
2.4 底物水解特异性和酶动力学分析
底物水解特异性的检测结果如表1所示,Bgl95对本研究所选用的人工合成底物及天然底物均展现出一定的水解能力,展现出较广泛的底物适配性,其中以pNPG为催化底物时,该酶的催化活力达到最高,对其他3种底物的水解活力从大到小依次为oNPG>纤维二糖>乳糖。结合底物结构特征分析显示,Bgl95对含β-1,4糖苷键的底物表现出明显的水解偏好性,这与GH1家族β-葡萄糖苷酶的典型底物特异性特征一致,进一步印证了Bgl95属于GH1家族成员。酶促反应动力学参数测定结果显示,Bgl95在以pNPG为底物时的比酶活力为(310.5±4.1)U/mg,米氏常数(Km)为(6.1±0.5)mmol/L,最大反应速率(Vmax)为(163.9±3.6)μmol/(min·mg),表明Bgl95对pNPG具有较强的底物亲和力和催化效率。
表1 Bgl95对底物水解的特异性分析结果
Table 1 Specificity analysis results of Bgl95 for substrate hydrolysis
底物糖基连接 相对酶活力/%pNPG(β-1,4) 葡萄糖100oNPG(β-1,2) 葡萄糖23±1.8纤维二糖(β-1,4) 葡萄糖18.1±2.6乳糖(β-1,4) 半乳糖11.9±1.5
2.5 金属离子和化学试剂对酶活力的影响
金属离子与化学试剂对Bgl95酶活力的影响结果如表2所示。5 mmol/L Fe2+、Mg2+以及1% Tween 80对Bgl95酶活力具有显著的促进作用,酶活力可分别提升至(169±3.2)%、(106±3.3)%和(112±2.8)%。相比之下,5 mmol/L Co2+、Cu2+对Bgl95酶活力表现出显著的抑制作用,酶活力仅分别保留(29±1.1)%和(24±0.9)%,1% SDS则完全抑制其酶活力。其他几种供试的金属离子和化学试剂存在时,Bgl95的酶活力均能保持在(86±2.1)%以上。研究结果说明Bgl95对多数常见的金属离子和化学试剂都表现出较好的耐受性,有利于其在不同工业领域上的应用。
表2 金属离子和化学试剂对Bgl95酶活力的影响
Table 2 Effects of metal ions and chemical reagents on Bgl95 enzyme activity
金属离子和化学试剂相对酶活力/%空白组100Zn2+89±2.1Mg2+106±3.3Mn2+95±1.8Fe3+97±1.2Fe2+169±3.2Co2+29±1.1Cu2+24±0.9Ca2+93±1.6Cr2+98±0.7Ni2+90±1.3Urea100±1.4EDTA95±1.7Triton X-100 (1%)86±2.1Tween 80 (1%)112±2.8SDS(1%)ND
2.6 各种糖对酶活力的影响
如图4所示,在反应体系中葡萄糖、木糖终浓度为0.1 mol/L条件下,9种供试糖对Bgl95的酶活力均未表现出明显的抑制效应,反而9种供试糖对酶的活力均呈现出不同程度的激活效应。其中,葡萄糖和木糖对Bgl95酶活力的激活作用最为显著,分别可将Bgl95的酶活力提高至空白对照组的1.71倍和1.57倍;其余7种糖的激活作用相对温和,但均能不同程度提升酶的催化效率,这一特性优于多数易受糖抑制的β-葡萄糖苷酶,这为Bgl95在含多种糖组分的工业发酵体系中的应用奠定了良好基础。
图4 各种糖对Bgl95酶活力的影响
Fig.4 Effects of various sugars on Bgl95 enzyme activity
2.7 高浓度葡萄糖和木糖对酶活力的影响
如图5所示,高浓度葡萄糖和木糖对Bgl95酶活力的影响呈现明显的浓度依赖性差异。随着葡萄糖浓度的不断升高,Bgl95酶活力呈现先升高后降低的趋势,在0～0.8 mol/L浓度内,Bgl95的酶活力随葡萄糖浓度升高呈现显著上升趋势,在葡萄糖浓度为0.8 mol/L时,其对Bgl95酶活力的激活作用达到峰值,与对照组相比,此时的酶活力可提升至3.55倍。当葡萄糖浓度超过0.8 mol/L时,其对Bgl95酶活力的激活效应呈逐渐下降趋势,直至葡萄糖浓度达到3.2 mol/L左右时才开始对Bgl95的酶活力产生明显的抑制作用。对于木糖而言,在0～1.8 mol/L内,其对Bgl95酶活力的激活作用随浓度升高而升高,木糖浓度为1.8 mol/L时,对酶活力的激活效果最佳,可将酶活力提升至4倍,总体激活效果优于同浓度的葡萄糖;当木糖浓度超过1.8 mol/L后,激活作用虽有减弱,但未出现抑制效应。值得注意的是,当体系中葡萄糖和木糖浓度均达到4.0 mol/L时,Bgl95仍可分别保留51%和139%的相对酶活力,表明该酶具有极强的产物耐受性,能够有效抵抗高浓度葡萄糖和木糖的反馈抑制,为其在高糖浓度工业发酵体系(如纤维素乙醇发酵、食品加工等)中的稳定应用提供了重要的数据支撑。
图5 高浓度葡萄糖和木糖对Bgl95酶活力的影响
Fig.5 Effect of high concentration glucose and xylose on Bgl95 enzyme activity
3 结论与讨论
本研究从T.roseum基因组中分析比对并筛选获得一个新型β-葡萄糖苷酶基因序列bgl95并成功构建了重组表达质粒pET22b-bgl95,实现了在大肠杆菌BL21(DE3)中的可溶性表达并获得Bgl95纯蛋白。多序列比对表明,Bgl95与糖苷水解酶GH1家族已知的β-葡萄糖苷酶具有高度同源性,含有该家族保守的催化基序及谷氨酸催化活性位点,其中Glu166与Glu357分别作为酸/碱催化基团和亲核基团,这一特征与GH1家族β-葡萄糖苷酶的典型催化机制高度一致[19]。
酶学性质测定结果表明,Bgl95的蛋白分子质量为52 kDa,最适反应条件为90 ℃、pH 7.5,该特征可使其在高温工业领域中展现出独特的应用优势。与已报道的其他微生物来源的β-葡萄糖苷酶相比,Bgl95 的最适反应温度显著高于多数同类酶,且最适反应pH呈偏中性,这一特性较为罕见,而目前已报道的微生物源 β-葡萄糖苷酶最适pH多偏向酸性,如A.flavithermus subsp.yunnanensis E13T来源的β-葡萄糖苷酶BglP最适反应温度为60 ℃、最适pH 6.5[14],热丝菌(Thermofilum adornatum)来源的β-葡萄糖苷酶TaBgl3的最适反应条件为80 ℃、pH 5.0[20],嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)来源的β-葡萄糖苷酶Bgl.tls最适反应条件为65 ℃、pH 5.0[21],嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)来源β-葡萄糖苷酶的最适反应条件为65 ℃、pH 4.5[22],嗜热古菌(Cuniculiplasma divulgatum)来源的β-葡萄糖苷酶CdBglA最适反应条件为55 ℃、pH 5.5[23]。此外,Bgl95 还展现出良好的热稳定性与pH稳定性。该酶在75 ℃下保温1 h仍可保留56%以上的残余酶活力,在80 ℃条件下的酶活力半衰期约为10 min,且对酸性和碱性环境都具有良好的适应性。以上特征有效弥补了现有β-葡萄糖苷酶热稳定性不足、酸碱适应性狭窄的短板,使其能够适应食品发酵、生物质转化等工业生产中的高温、复杂酸碱环境,降低酶制剂的使用成本。
底物水解特异性研究表明,Bgl95对天然及人工合成的各类糖苷底物均具有广泛的水解能力,其中以pNPG为底物时,该酶的催化活性表现最好,同时Bgl95也能高效水解纤维二糖、乳糖等各类天然糖苷底物。实验结果还表明,该酶对含β-1,4糖苷键的底物具有显著的底物水解偏好性。Bgl95所展现出的底物水解特异性特征与A.flavithermus subsp.yunnanensis E13T来源的BglP及T.thermosaccharolyticum来源的BglY具有高度相似性[14-15],说明这类β-葡萄糖苷酶可能在纤维素降解过程中发挥协同作用。动力学参数测定结果显示,Bgl95以pNPG为底物时的比酶活力为(310.5±4.1)U/mg,Km值为(6.1±0.5)mmol/L,Vmax为(163.9±3.6)μmol/(min·mg),表明其对pNPG具有较强的亲和力及较高的催化效率。金属离子及化学试剂对Bgl95活性的影响研究表明,Fe2+、Mg2+及1% Tween 80可显著激活酶活力,而Co2+、Cu2+及SDS则对酶活力具有强烈的抑制作用,这一结果为工业生产中通过添加适宜激活剂、规避抑制因素以提升Bgl95催化效率提供了重要参考,也为酶制剂的配方优化提供了实验依据。
已有研究表明,多数β-葡萄糖苷酶活力易受到产物反馈抑制,在纤维素水解过程中,中间产物木糖及终产物葡萄糖往往会显著抑制酶活力,从而降低纤维素降解效率[14]。也有少数报道发现,产物木糖和葡萄糖在一定浓度范围内还能对β-葡萄糖苷酶活力产生显著激活作用[16,24]。因此,筛选和开发对葡萄糖和木糖具有良好耐受性的β-葡萄糖苷酶,以及葡萄糖/木糖激活型β-葡萄糖苷酶具有重要的工业应用价值[14,24-25]。本研究发现,Bgl95属于可同时被葡萄糖与木糖双重激活的少数β-葡萄糖苷酶之一,当反应体系中葡萄糖、木糖的终浓度为0.1 mol/L时,酶活力分别可分别提升至1.71倍和1.57倍;当葡萄糖的浓度达到0.8 mol/L、木糖的浓度达到1.8 mol/L时,对酶的激活效应达到最强,酶活力可分别提升至3.55倍和4倍,该特征可为其在高糖环境中的应用提供有利条件。与此同时,Bgl95还具备优异的产物耐受性,当反应体系中葡萄糖浓度达到3.2 mol/L时,才开始对Bgl95的酶活力产生抑制作用。即使反应体系中葡萄糖、木糖浓度高达4 mol/L时,Bgl95仍可保留51%和139%以上的酶活力。与目前已报道的其他微生物源的β-葡萄糖苷酶相比,Bgl95对产物的耐受性表现更为优异,如来源于A.flavithermus subsp.yunnanensis E13T的β-葡萄糖苷酶BglP,葡萄糖和木糖对酶活力的抑制浓度分别为2.2 mol/L和1.4 mol/L[14];来源于T.thermosaccharolyticum的β-葡萄糖苷酶BglY,葡萄糖对酶活力的抑制浓度为0.6 mol/L[15];来源于B.thermoamylovorans的β-葡萄糖苷酶Bgl52,葡萄糖和木糖对酶活力的抑制浓度为1.1 mol/L和1 mol/L左右[16];来源于嗜热节革孢(Scytalidium thermophilum)的β-葡萄糖苷酶,葡萄糖和木糖对酶活力的抑制浓度分别为0.7 mol/L和0.5 mol/L[24]。Bgl95所表现出的这种优异的抵抗产物反馈抑制的特性,能够有效解决纤维素水解过程中产物积累导致的酶活力下降问题,提升纤维素降解效率,降低生物质能源开发及食品发酵等领域的生产成本。
综上,本研究成功挖掘并获得了一株具有独特酶学特性的新型嗜热β-葡萄糖苷酶Bgl95,其具备高温高活性、优良的热稳定性与酸碱稳定性、广泛的底物特异性,以及罕见的葡萄糖/木糖激活特性和产物耐受性,有望突破现有β-葡萄糖苷酶工业应用中的关键瓶颈。该研究结果不仅丰富了GH1家族β-葡萄糖苷酶的资源库,完善了嗜热微生物来源β-葡萄糖苷酶的酶学特性研究,同时为Bgl95在纤维素水解、食品发酵、生物质能源开发等相关工业领域的规模化应用提供了坚实的理论支撑与技术依据。
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