苹果酸-乳酸发酵(malic-lactic fermentation,MLF)阶段是葡萄酒降酸和丰富香气物质的重要阶段。在该阶段,乳酸菌可将葡萄酒中的L-苹果酸转化为L-乳酸并释放出CO2,使酒体尖酸的口感转变得更为柔和。目前,被用作MLF的乳酸菌主要有4个属,即酒球菌属(Oenococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠球菌属(Leuconostoe)和片球菌属(Pediococcus)[1-3]。在这些菌属中,因酒酒球菌(Oenococcus)可在低pH和高酒精度的葡萄酒环境中生长独立完成MLF而被常用作葡萄酒MLF的商业乳酸菌发酵剂。然而,因对营养胁迫的敏感性易导致的发酵停滞是目前该菌的缺陷[4]。部分植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)被发现同样能在葡萄酒高酒精度的恶劣环境下生存而作为商用发酵剂使用[5]。与O.oeni相比,L.plantarum具有香气修饰酶——β-葡萄糖苷酶和酚酸脱羧酶等更多的酶类,同时该类菌在发酵过程中对残留营养物质的竞争活性也更高。但该类菌发酵葡萄酒对风味的影响存在不确定性,具有异味风险[6]。目前,葡萄酒发酵多依靠单一菌种的乳酸菌直投式发酵剂或自然发酵进入MLF阶段。前者使得酒体风味的同质化现象严重,而后者则往往出现发酵效率低产品稳定性差的问题。
混种发酵赋予葡萄酒更为丰富风味的同时,可以大大提高MLF的效率[7]。DEVI等[8]研究L. plantarum YH-17与O.oeni S共同培养对赤霞珠葡萄酒MLF的影响,发现与单一接种相比,混合接种2种乳酸菌使MLF更加快速彻底,且葡萄酒的颜色损失更小。刘辉等[9]用其自主分离筛选的L.plantarum YH-17与O.oeni S研究混合培养,研究不同接种时序对红葡萄酒的影响,发现先接O.oeni 24 h后接入L.plantarum在苹果酸降解和挥发性香气物质生成方面均有显著优势。可见,发酵剂接种时间和接种顺序的差异,造成了葡萄酒风味上的差异。而接种时序的确定又与菌种自身的特点密切相关。
为了探究不同接种时序下L.plantarum与O.oeni的相互作用及对最终风味物质的影响,本研究前期从贺兰山东麓产区赤霞珠自然发酵葡萄酒中筛选出1株具有优良降酸特性和高耐受性的L.plantarum YH-17,与商用O.oeni S共发酵葡萄酒,检测MLF前后基本理化指标,并基于风味组学技术分析[顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)和液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS)]5种不同接种策略下葡萄酒挥发性与非挥发性风味物质的变化。本研究的开展将有助于了解乳酸菌共培养对红葡萄酒风味品质的影响,为葡萄酒发酵工艺的改进提供借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 实验材料
实验酒样:无菌取样袋收集宁夏贺兰山东麓产区酒精发酵结束后的赤霞珠葡萄酒,放在干冰上立即运至实验室,经0.22 μm孔膜过滤得到无菌葡萄酒。
供试菌株:L.plantarum YH-17(分离自2023年贺兰山东麓产区赤霞珠自然发酵葡萄酒,菌种保藏编号为CGMCC NO.34897);商业O.oeni S,法国诺盟公司。
1.1.2 实验试剂
MRS肉汤培养基、MRS琼脂培养基,青岛海博生物技术有限公司;苹果酸、乳酸、柠檬酸、甘油试剂盒,苏州格锐思生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
DSX-24L-I手提式高压蒸汽灭菌器,上海申安医疗机械厂;BBS-DDC超净工作台,山东博科科学仪器有限公司;BSP-150恒温培养箱,上海博迅实业有限公司医疗设备厂;7890-5977B顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用仪、DB-Wax色谱柱,美国Agilent公司;Vanquish超高效液相、Orbitrap Exploris 120高分辨质谱,Thermo Fisher Scientific公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌种活化、菌悬液的制备
L.plantarum YH-17的活化:以8%的接种量接种于脱乳培养基中于28 ℃培养24 h,将凝乳试管按4%的接种量转接到MRS液体培养基中备用;
O.oeni S的活化:从甘油管中按8%的接种量接入改良的MRS液体培养基[添加20%(体积分数)苹果汁]中,28 ℃厌氧培养24 h。
菌悬液制备:将菌株在MRS液体培养基中活化3代,菌液在4 000 r/min,4 ℃的条件下离心10 min得到菌体,用0.85%(质量分数)的灭菌生理盐水洗涤菌体。重复离心、洗菌操作3次。将沉淀的菌泥与0.85%的灭菌生理盐水混匀制备成菌悬液。
1.3.2 不同方式接种乳酸菌进行苹果酸-乳酸发酵
以107 CFU/mL的接种量按1∶1的比例以不同接种顺序接入L.plantarum YH-17与O.oeni S,使活菌数为2×107 CFU/mL。具体接种方式及名称如表1所示。
表1 葡萄酒乳酸菌不同接种方式及分组名称
Table 1 Different inoculation methods and group names of lactic acid bacteria in wine
分组名称接种方式L酒精发酵结束后直接接入L.plantarum YH-17S酒精发酵结束后直接接入O.oeni SLS酒精发酵结束后同时接入L.plantarum YH-17与O.oeni SL48S酒精发酵结束后先接入L.plantarum YH-17,48 h后再接入O.oeni SS48L酒精发酵结束后先接入O.oeni S,48 h后再接入L.plantarum YH-17
1.3.3 葡萄酒理化指标分析
参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定酒精度、pH、总酸含量;参考赵宁等[10]用苯酚-硫酸法检测葡萄酒MLF前后总糖含量;用试剂盒法检测葡萄酒MLF过程前后苹果酸、乳酸、甘油、柠檬酸含量变化。
1.3.4 挥发性风味物质测定
样本前处理:取发酵结束后的葡萄酒样品200 μL置于20 mL顶空瓶中,加入10 μL内标溶液(2-辛醇,10 mg/L)。另取一瓶加入10 μL正构烷烃混标用于保留指数校准。所有样本采用气相色谱-质谱联用系统进行分析。
SPME条件:采用配有PAL3自动进样器的全自动分析系统进行SPME,50/30 μmDVB/CAR/PDMS萃取头。样品在60 ℃下加热振摇15 min以释放顶空气体,随后使用SPME1纤维在顶空瓶中以10 mm穿刺深度萃取30 min,期间保持振摇以增强传质。
GC-MS条件[11]:萃取完成后,纤维以100 mm/s的速度穿刺至40 mm深的GC进样口,进行4 min的热解吸;分析结束后,纤维在250 ℃的老化站中清洁1 min。整个GC分析循环时间为55 min。使用Agilent 7890B气相色谱仪与5977B质谱仪联用系统,配备DB-Wax色谱柱(30 m×250 μm×0.25 μm)。进样模式为不分流,载气为氦气,柱流速1 mL/min。升温程序:初始40 ℃保持4 min,以每min 5 ℃升至245 ℃,保持5 min。进样口、传输线、离子源和四级杆温度分别为250、250、230、150 ℃。电离能量为-70 eV,质量扫描范围m/z 20～400,溶剂延迟2.37 min。
定性方法:在分析序列中单独进样10 μL正构烷烃混标,用于计算目标化合物在色谱柱上的保留指数。化合物定性分析基于NIST质谱库与保留指数比对。
半定量方法:原始数据使用Chroma TOF软件(v4.3x,LECO)进行峰提取、基线校正、解卷积、峰对齐与积分。比较目标化合物与内标物(2-辛醇)的色谱峰面积比值,计算各化合物在样品中的相对含量。
1.3.5 非挥发性风味物质测定
样品前处理:取100 μL发酵结束后的葡萄酒样品,加入400 μL提取液,V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1,含氘代内标(吲哚-3-乙酸-2,2-d2 2.4 μmol/L,癸酸-D19 0.16 μmol/L,甘氨胆酸-d4 0.09 μmol/L,邻苯二甲酸二异丁酯-3,4,5,6-D4 3.5 μmol/L,L-亮氨酸-d3 8 μmol/L)。涡旋混匀30 s;冰水浴超声10 min,-40 ℃静置1 h;将样品于4 ℃,12 000 r/min(离心力13 800×g,半径8.6 cm)离心15 min;取上清液100 μL于进样小瓶;所有样品另取等量上清液混合成QC样品上机检测。
LC-MS条件:通过Phenomenex Kinetex C18(2.1 mm×50 mm,2.6 μm)液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离。液相色谱A相为水相,含0.01%(体积分数)乙酸,B相为V(异丙醇)∶V(乙腈)=1∶1。样品盘温度4 ℃,进样体积2 μL。Orbitrap Exploris 120 质谱仪能够在控制软件(Xcalibur,版本:4.4,Thermo)控制下进行一级、二级质谱数据采集。详细参数如下:护套气体流量50 Arb,辅助气体流量15 Arb,毛细管温度320 ℃,全质谱分辨率60 000,二次质谱分辨率15 000,碰撞能量:SNCE 20/30/40,喷射电压3.8 kV(正)或-3.4 kV(负)。
1.4 数据处理与分析
原始数据通过ProteoWizard软件(v3.0.24054)转换为mzXML格式,随后使用基于XCMS的自主开发R包进行峰提取、对齐与积分。代谢物鉴定依托BiotreeDB数据库(V3.0),结合保留时间、一级精确质荷比及二级质谱图谱进行匹配。代谢物鉴定级别参照代谢组学标准倡议进行注释,结果用“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析
2.1 不同接种方式对MLF赤霞珠红葡萄酒主要理化指标的影响
以同时接种和48 h间隔接种[9,12]进行葡萄酒的MLF,不同接种方式处理的MLF红葡萄酒基本理化指标见表2。与未处理组相比,乳酸菌的MLF显著改变了葡萄酒的基础理化指标。以苹果酸保持稳定不再下降为标准作为MLF终点,5种接种方式下处理后酒体的总糖、总酸含量均显著降低,乳酸含量显著积累,无明显差异。进一步分析接种方式对于理化指标的影响发现,单一接种组S与混菌发酵组S48L、LS呈现高酒精度(>13.5%vol)的特点,而单一接种组L与混菌发酵组L48S呈现酒精度骤降(≤11.8%vol)的特点。此外,混菌发酵组中LS和L48S则分别出现柠檬酸和甘油的部分降解。前期研究表明,柠檬酸和甘油的降解可能造成酒体甜感与醇厚度的损失。
表2 不同接种方式下MLF前后基本理化指标
Table 2 Basic physicochemical indicators before and after MLF with different inoculation methods
接种方式酒精度/%vol总酸含量/(g/L)总糖含量/(g/L)苹果酸含量/(g/L)乳酸含量/(g/L)柠檬酸含量/(g/L)甘油含量/(g/L)未处理组14.07±0.06a6.47±0.12a4.99±0.16a3.413±0.19a0.053±0.03c0.141±0.03a1.598±0.41aL11.67±0.29b5.66±0.12cd1.48±0.05b0.118±0.03b2.423±0.36ab0.152±0.09a1.848±0.08aS13.53±0.35a6.28±0.16ab1.61±0.13b0.131±0.01b2.347±0.09ab0.131±0.04a1.854±0.04aLS14.10±0.34a5.99±0.08bc1.64±0.03b0.137±0.01b2.110±0.02b0.112±0.03a1.748±0.3aL48S11.77±0.25b5.56±0.13d1.79±0.03b0.098±0.01b2.425±0.16ab0.223±0.09a1.583±0.07aS48L13.53±0.35a5.53±0.13d1.68±0.04b0.117±0.04b2.680±0.19a0.161±0.04a1.860±0.09a
注:不同小写字母表示具有显著性差异(P<0.05)。
2.2 不同接种方式对MLF赤霞珠红葡萄酒挥发性风味物质的影响
采用L.plantarum YH-17与O.oeni S对酒精发酵后的葡萄酒进行MLF,研究不同接种方式对酒体挥发性风味物质的影响。MLF结束后进行挥发性风味物质的检测,5组样品共检出87种挥发性风味物质,包括酯类(25种)、醇类(15种)、醛类(6种)、酸类(4种)、萜烯类(3种)及酮类(2种)、其他(32种)。5组样品中分别检出的物质种类如下:LS(83种)、S(83种)、L48S(82种)、S48L(82种)、L(81种)。不同接种方式下各种类挥发性风味物质相对含量占比情况见表3。混菌发酵组中S48L组醇类物质的相对含量占比最高,其中苯乙醇在5组间相对含量最高。苯乙醇通常被认为对葡萄酒香气的影响最大[13]。酯类物质往往赋予酒体更丰富的水果风味[14]。与ZHANG等[15]的研究结果相似,本实验中混合发酵组(L48S、LS)较单一接种组(L、S)酯类相对含量更高,尤其是L48S组在混合发酵组中酯类相对含量占比最高。此外,S48L组的酮类、醛类物质的相对含量均高于其他组。综合来看,S48L组虽然不是5组中检出物质种类最多的组,但其较其他混合发酵组具有更高占比的醇、酮、醛类物质。
表3 五种不同接种方式下各种类挥发性风味物质相对含量 单位:%
Table 3 Relative content of various volatile flavor compounds with five different inoculation methods
挥发性风味物质接种方式LSLSL48SS48L醇类 97.472 7097.260 6096.873 2096.849 9097.068 40酯类 2.166 702.344 702.676 802.743 202.312 56醛类 0.189 100.184 600.140 300.079 800.224 27酸类 0.000 200.000 300.000 510.000 610.000 61萜烯类0.000 190.000 200.000 200.000 200.000 20酮类 0.007 850.012 700.028 160.026 600.125 28
为整体展示不同接种方式下香气物质的分布情况,对5种接种方式下葡萄酒检出的所有香气物质进行主成分分析(principal components analysis,PCA),见图1。第一象限集中分布着酮、酯、醇、醚类物质,第二象限集中分布着醇、酯和少部分醛酮类物质;第三象限主要分布醇、酯和少部分酸类物质,第四象限主要分布醇、酯类和少部分酚类物质。从组别来看,L组分布于PC1的负半轴端,S组则位于PC1的正半轴端,这表明由L.plantarum YH-17和O.oeni S单独接种发酵的酒样在香气物质的组成上具有明显差异。而混菌发酵3组酒样则靠近原点分布在L、S组的中间,表明混菌发酵较单一发酵组在整体香气上更为均衡。同时可以发现LS组全部分布在第一象限,以酯类物质为主,如丁酸乙酯(可以为该组酒体带来热带水果的香气)[16]。L48S组分布在第二、三象限,与醛酮和酸类物质分布更近,如对甲基苯甲醛(可以为酒体苦杏仁香气,使酒体更具辨识度)。S48L组酒样分布在第二象限且靠近原点,醇类物质占比更高,如2,3-丁二醇(可以增强酒体的甜味、圆润感与稳定性)。
图1 五种接种方式挥发性风味物质的PCA得分散点图
Fig.1 PCA scatter plot of volatile flavor compounds for five inoculation methods
进一步研究不同接种方式下葡萄酒中香气物质的差别,对所有检出代谢物进行差异分析,以变量投影重要性(variable importance in projection,VIP)值>1,且P<0.05为标准(电子版增强出版附表1,https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044649,下同),图2展示了不同接种方式下挥发性差异代谢物的绘制聚类情况。5种不同接种方式下共筛选出30种差异代谢物,其中共有醇类物质11种、酯类物质8种、醛酮类物质6种、酸类物质1种、其他类物质4种。由图2可知,单一接种组L中醇类物质(3-庚醇和3-癸醇)显著高于平均水平(标准化得分等于0),3-乙基-2-戊醇、甲醇、丙酸乙酯、2-羟基硬脂酸酯4种物质则显著低于平均水平。其中,3-庚醇能够提供酒体青草、草本和树叶的风味,丙酸乙酯能够增强酒体果味的表现力。因此我们可以推测单一接种L.plantarum YH-17能突出葡萄酒酒体的“清新草本”香气而削弱“果香”的特征。单一接种组S组中2-异丁基降冰片烷显著高于平均值。该物质为葡萄酒中植物类香气的主要来源,可为赤霞珠酒体带来明显的青椒风味[14,17]。可见,2种菌单独发酵下的酒体挥发性风味物质表现迥异。混合发酵的3组样本的差异代谢物则更为复杂。L48S组中丁酸乙酯和丙酸乙酯表现较为突出,丰富了酒体水果的香气[16]。与刘辉等[9]先接种O.oeni S后接种L.plantarum YH-17对风味的影响最优相似,S48L组样品与其他4组相较出现了更多高于平均水平的醇(6种)、酯(5种)、醛酮(3种)类,使得酒体香气的呈现更为复杂。除苯甲醛外,该样本中丰富的1-壬醇是葡萄酒中常见的脂肪醇,通常能够与其他香气物质协同作用,增加酒体香气的复杂度和圆润感。此外,该组中3-庚醇显著低于平均水平,削弱了“青草”风味的表达,表明该接种方式下的酒体更为成熟。值得注意的是,LS组中甲醇的相对含量明显高于平均值。该物质质量浓度过高(>400 mg/L)时常被认为易对人体神经系统、肝脏构成危害。此外,能够呈现典型肉桂味道的(E)-2-丁烯-1-酮,在LS组中明显低于平均水平。
图2 五种接种方式下挥发性差异代谢物聚类热图
Fig.2 Cluster heatmap of volatile metabolites with five inoculation methods
注:标准化得分等于0为物质相对含量的平均水平,红色为该物质相对含量显著高于平均水平,绿色为该物质相对含量显著低于平均水平。
2.3 不同接种方式对MLF赤霞珠红葡萄酒非挥发性风味物质的影响
5种接种方式下葡萄酒中非挥发性化合物共检出471种物质,其中莽草酸及苯丙酸类186种、脂肪酸86种、萜类85种、聚酮类47种、生物碱43种、氨基酸及短肽类14种、碳水化合物10种。PCA(图3)结果显示,MLF后的非挥发性化合物能够区分L.plantarumYH-17与O.oeni S不同接种方式下的样本,其中PC1和PC2分别占34.19%和19.76%。
图3 五种接种方式下非挥发性物质的PCA
Fig.3 PCA of non-volatile compounds with five inoculation methods
以VIP值>1,且P<0.05为标准对所有检出代谢物进行差异分析,共筛选出207种差异代谢物。图4展示了不同接种方式下(VIP值前30,附表2)非挥发性差异代谢物的绘制聚类情况,以探究不同接种方式对葡萄酒非挥发性风味物质的影响。由图4可知,L.plantarumYH-17单独发酵的L组中,戊二酸、2-羟基辛酸和甲基琥珀酸显著高于平均水平,它们能使酒体口感更为柔和顺滑并为酒体带来一些咸鲜感[14]。丙酸则显著低于平均水平,较低水平的丙酸往往不容易造成葡萄酒酸度失衡[14,18]。可推测出单一接种L.plantarum YH-17后葡萄酒的咸鲜口感突出,尖酸口感削弱。由O.oeni S单独发酵的S组中,阿夫儿茶精和辣椒酰胺显著高于平均水平。其中阿夫儿茶精作为单宁单体来自于葡萄本身,能够提供轻微的苦涩感和收敛性[19]。辣椒酰胺则为酒体带来辛辣口感。综上可见,单一接种下的2组酒体其非挥发性风味物质的表现上仍存在明显差异。与挥发性风味化合物类似,混合发酵下3组样本的非挥发性差异代谢物也更为复杂。L48S组与单一接种L组存在丙酸低于平均水平的相同表达情况,说明该接种方式对于非挥发性风味物质形成的影响保留了L.plantarum YH-17的发酵特征。与其他样品相比,S48L组样品中则出现了更多高于平均水平的物质,特别是香豆雌酚、月桂胺氧化物、2-苯乙基-β-D-葡萄糖苷。其中香豆雌酚和2-苯乙基-β-D-葡萄糖苷均来源于葡萄本身,香豆雌酚为酒体贡献苦味避免果香丰富而过于甜腻,2-苯乙基-β-D-葡萄糖苷则作为香气前体物质在陈酿过程中缓慢水解,释放出带有玫瑰香气的2-苯乙醇[17,20]。此外,对比分析发现聚类热图中S48L组和S组非挥发性风味物质组成结构相似,说明S48L这一接种方式下的酒体保留了O.oeni S的发酵特征。LS组的非挥发性差异代谢物的表达则最为均衡,没有突出的代谢物。
图4 五种不同接种方式非挥发性风味物质差异代谢物的层次聚类热图
Fig.4 Hierarchical clustering heatmap of metabolite differences in non-volatile aroma compounds with 5 different inoculation methods
3 结论
本研究探讨了L.plantarum YH-17和O.oeni S不同接种方式下对赤霞珠葡萄酒品质的影响。5组发酵方式均可完成MLF(苹果酸<0.2 g/L)。与单一接种发酵相比,L.plantarum YH-17和O.oeni S混菌发酵呈现更为复杂的风味特征,不同接种方式呈现的风味迥然不同。选择合适共发酵接种策略,可以充分发挥2种菌株各自的优势,既保留了酒体的“风土”特征也提高了酒体的风味复杂性。其中,S48L组显著增加了更多醇(6种)、酯(5种)、醛酮(3种)类物质;特别是苯甲醛、1-壬醇、香豆雌酚明显高于平均水平,3-庚醇含量则显著低于平均水平,这些物质为酒体提供了更丰富的苦杏仁香气与苦味口感,削弱了“青草”风味的表达。
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