在浓香型白酒传统酿造体系中,“千年糟”通过持续投料与陈糟循环的使用,实现了微生物菌群的代际延续。窖池内酒糟依空间位置自然分化为上、中、下3个功能层区,呈现梯度演化特征。白酒酿造环境微生物的群落结构与白酒品质密切相关,白酒的味觉特性主要来源于各种原料、发酵、蒸馏和陈酿过程中的微生物代谢的多种风味化合物的相互作用[1],涉及蛋白质和氨基酸、碳水化合物、木质素和纤维素,以及氢气、酸和甲烷等[2]。陈慧颖等[3]对河南的浓香型酒糟微生物发酵前后的丰度比较,发酵后节杆菌属(Arthrobacter)、短波单胞菌属(Brevundimonas)等相对丰度下降,乳杆菌属(Lactobacillus)成为优势菌属。肖辰等[4]解析泸型酒糟优势菌属为乳杆菌属、芽孢杆菌属(Bacillus)、魏斯氏菌属(Weissella)、丁酸梭菌属(Dysgonomonas)、丛毛单胞菌属(Comamonas)以及瘤胃球菌属(Ruminococcus)。翟磊等[5]解析四川宜宾地区浓香型酒糟优势菌属为乳杆菌属、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、梭菌属(Clostridium)和埃希氏菌属(Escherichia)。酒糟微生物群落因地域生态环境差异而各不同,尤其是优势微生物群[6],但乳杆菌属均是其优势菌群之一。

酒糟源微生物展现出多优良的发酵特性。吴雨甍等[7]从酱香型白酒酒糟中分离的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)拥有耐酸和耐盐,强疏水、自凝聚和抗氧化等多优良特性;李霄霄[8]从酱香型白酒大曲、酒糟中分离出可高产乳酸的植物乳植杆菌和戊糖乳植杆菌(Lactiplantibacillus pentosus),L-乳酸光学纯度近74%,SUN等[9]从葡萄酒产区分离的戊糖乳植杆菌在高乙醇、高SO2浓度和低pH环境中展现出优异抗性,李宁等[10]从葡萄醪和自然苹乳发酵的葡萄酒中分离的戊糖乳植杆菌在16%乙醇和70 mg/L SO2条件下发酵产率仍高于商业菌株。本研究解析浓香型白酒酒糟不同层的细菌群落结构与潜能,从酒糟中分离筛选具有优良发酵性能的细菌菌株,并评价其耐酸、耐乙醇、产酸、抗氧化等关键特性,以期为酒糟源功能微生物的开发利用及白酒酿造微生态研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

浓香型白酒糟分别从自然堆积上层(U)、中层(M)和下层(L)3个部位酒糟取样,如图1所示,样品取自四川泸州某酒厂浓香型白酒酿造车间。

ABTS 试剂盒,北京百奥莱博科技有限公司;细菌基因组DNA快速抽提试剂盒(Genesy-96T)、乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)活性测定试剂盒,生工生物工程股份有限公司;Qubit dsDNA HS 分析试剂盒(Q32854),赛默飞世尔科技公司。

MRS肉汤培养基(g/L):蛋白胨10、牛肉膏浸粉10、酵母提取物5、磷酸氢二钾2、柠檬酸三铵2、无水乙酸钠5、葡萄糖20、七水合硫酸镁0.1、一水合硫酸锰0.05。吐温-80 1 mL,去离子水定容到1 000 mL,调pH约6,115 ℃灭菌20 min。MRS固体培养基:向MRS肉汤培养基中加入2%的琼脂。筛选MRS固体培养基:向MRS固体培养基中加入2%碳酸钙。

1.2 仪器与设备

JW-3021HR全波长酶标仪,上海闪谱生物科技有限公司;PHS-3C智能酸度计,成都世纪方舟科技有限公司;K5800T超微量分光光度计,凯奥科技设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 酒糟样品DNA提取检测

按照细菌基因组DNA快速抽提试剂盒说明方法提取酒糟中微生物总DNA,选择扩增区域为16S rDNA(V3-V4),选用正向引物341F(CCTACGGGNGGCWGCAG)和反向引物805R(GACTACHVGGGTATCTAATCC)引物进行2轮扩增,扩增合格总DNA样品,纯化。构建测序文库,Qubit® 4.0荧光计进行文库定量与均一化,经样本条形码(Barcode)标记后,进行序列分选与质量过滤质检,在Illumina HiSeq 2500平台进行测序。

1.3.2 生物信息学分析

原始序列经 Trimmomatic(v0.39)质控后,通过 DIAMOND(v2.1.8)比对 NR 数据库进行物种注释。同时使用 MEGAHIT(v1.2.9)拼接、Prodigal(v2.6.3)预测基因、CD-HIT聚类构建非冗余基因集。基因表达量通过 Bowtie2(v2.5.4)比对量化,并利用 KEGG 和NR数据库完成功能注释。

1.3.3 目的菌株的分离与鉴定

取上中下各层酒糟以10%添加于无菌生理盐水中,35 ℃、180 r/min振荡培养24 h,梯度稀释后筛选MRS培养基平板涂布,37 ℃、有氧培养。挑选菌落形态不同的单菌落,革兰氏染色镜检记录,纯化3代,甘油保存,放置于-80 ℃冰箱备用。细菌基因组提取试剂盒提取菌株16S rDNA序列,以细菌通用引物对27F/1492R扩增后送至华大基因进行Sanger测序,测序结果结合GenBank数据库和Ezbiocloud数据库(www.ezbiocloud.net)进行比对,MEGA11.0软件构建系统发育树,确定属种关系。

1.3.4 分离菌株发酵特性分析

1.3.4.1 分离菌株耐酸性能测定

耐酸性测定参考张松[11]的方法并加以修改。以1 mol/L盐酸调节MRS肉汤培养基pH值为3.5和3.0,分离菌株菌悬液培养至OD600值=1.0后,1%(体积分数)接种于其中,37 ℃培养24 h,于MRS固体培养基梯度稀释涂布培养24 h后计算菌落数。

1.3.4.2 分离菌株耐乙醇性能测定

耐乙醇活性测定参考张天笑等[12]的方法并加以修改。分离菌株1%接种于含体积分数为2%、4%、5%、7.5%、10%的无水乙醇的MRS肉汤培养基培养基中,37 ℃培养后酶标仪测定其OD600绘制各浓度酒精胁迫下分离菌株耐受曲线。各菌株ADH活性,据ADH活性测定试剂盒中步骤测定。

1.3.4.3 分离株产酸能力测定

将活化后的菌悬液每100 mL MRS肉汤培养基以1%接种,摇瓶培养5 d,8 000 r/min离心1 min取样品上清液,超纯水稀释,以未接种培养基为空白组,以公式(1)计算每株菌株的产酸量(以乳酸计)。

产酸量

(1)

式中:V0,空白组消耗氢氧化钠的体积,L;V1,发酵液消耗氢氧化钠的体积;V2,样品的体积;A,稀释倍数;C,氢氧化钠浓度,mol/L;90,乳酸的摩尔质量。

1.3.4.4 分离菌株抗氧化性能测定

DPPH自由基清除能力测定参考许世浩等[13]的方法并加以修改,DPPH自由基粉末于无水乙醇配置0.3 mmol/L DPPH自由基工作液。各筛选菌株MRS肉汤培养基培养至对数期,菌悬液8 000 r/min离心1 min,实验组取上清液与等体积DPPH自由基工作液在酶标板中混匀,对照组取无水乙醇与DPPH溶液反应,等体积样品溶液与无水乙醇溶液混合为空白组,静置30 min后测定OD517。按照公式(2)计算DPPH自由基清除率:

DPPH自由基清除率

(2)

式中:A0,对照组吸光值;A1,样品吸光值:A2,空白组吸光值。

ABTS阳离子自由基清除能力按照试剂盒中的操作步骤进行测定。取对数期的菌悬液,8 000 r/min离心1 min,取上清液10 μL于酶标板中,补190 μL ABTS工作液为样品组,静置20 min后测定OD734。以去离子水为对照组。按公式(3)计算ABTS阳离子自由基清除率:

ABTS阳离子自由基清除率

(3)

式中:A1,对照组吸光度值;A2,样品组吸光度值。

1.3.4.5 分离菌株固态发酵酒糟产蛋白

按照毕静等[14]研究方法,固态发酵培养基每50 g含90%酒糟(含水量:60%),10%麦麸,添加1.2%(质量分数,下同)尿素和2%的小苏打。5种酒糟源菌种以及黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)各菌株培养至对数期,按液料比0.05∶1(mL∶g)加入到发酵培养基搅拌混匀,恒温培养5 d后,测定蛋白含量。

发酵物蛋白质含量测定参考姜惠萍等[15]考马斯亮蓝法改良,以牛血清蛋白溶液梯度浓度标准液构建蛋白标准曲线。乙醇浸提法处理发酵前后的酒糟,测定OD595计算样品蛋白含量。按照公式(4)计算酒糟中的可溶性蛋白含量:

可溶性蛋白含量

(4)

式中:C,可溶性蛋白提取液中蛋白质质量浓度,mg/mL;M,酒糟质量,g;V,可溶性蛋白提取液体积,mL。

2 结果与分析

2.1 浓香型白酒糟16S rDNA高通量测序

2.1.1 高通量测序文库构建结果与数据丰度有效性分析

各层酒糟样本碱基数平均值均近460 bp,各样品峰主要在425 bp左右,测序长度与凝胶电泳检查相符。如图2所示稀释曲线平缓,测序深度较好,测序数据量合理。

2.1.2 不同部位浓香型白酒糟细菌α多样性分析

表1所示中下层的Shannon指数低(0.27～0.35),而Simpson指数高(0.92～0.94),中、下层酒糟细菌的多样性较低、由少数优势菌种主导的高度特异化微生物群落特征,而上层较高的Shannon指数和较低Simpson指数,上层微生物群落多样性较高、群落结构相对均衡。所有样本覆盖率值均为100%,测序数据能准确表征实际菌群特征。

2.1.3 不同部位浓香型白酒糟样本的距离分析

样本的距离分析信息见图3,所有样本间的Bray-Curtis与UniFrac距离均处于相对较低水平,整体群落结构较为相似,中层与下层样本聚集紧密,其微生物组成高度相似,而上层样本与中、下层样本虽存在一定差异,但距离值仍处于较低区间,组间差异有限。不同层次样本的群落结构存在细微分化,但整体上保持了较高的组成相似性。

2.1.4 不同部位浓香型白酒糟的相似性分析

ANOSIM分析如表2所示,尽管上层与中层(U vs M)、上层与下层(U vs L)的群落差异极大(R>0.88),且中层与下层(M vs L)间也存在一定差异(R=0.37),但两两比较在统计均不显著(P=0.1)。然而,当将所有样本纳入整体分析时(Between),3个组别间呈现出极显著的群落结构差异(R=0.59,P=0.003)。此结果表明,上层、中层、下层作为一个整体分组是有效的,但各样本分组之间未见显著性差异。

2.1.5 不同部位浓香型白酒糟细菌物种组成分析

图4-a酒糟各层物种分布Venn图所示,各组间独有的属较少,各层样本之间细菌微生物多样性差异不显著。图4-b、图4-c结果显示,中层和下层组间细菌组成差异不大,乳酸杆菌属在上层相对丰度较其他两层有较高占比,乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)平均丰度达97.29%,为样本核心菌科,属级层面存在较高比例的未分类的乳杆菌,平均丰度为89.50%,乳酸杆菌属的平均丰度为7.77%,而产己酸菌属(Caproiciproducens)平均丰度仅0.26%。

2.1.6 不同部位浓香型白酒糟细菌物种差异分析

图5利用TAMP分析法对比组间生物特征丰度差异。未分类柄杆菌科(Caulobacteraceae)在上层丰度远高于中层(P=0.003 91)、下层(P=0.014),而严格厌氧菌的未分类厌氧绳菌科(Anaerolineaceae)在下层丰度均高于其他层,不同菌株在上层或下层高丰度可作为有氧或无氧的指示。未分类的乳杆菌,上层的丰度显著高于中层和下层(P=0.044),而中、下层之间则无显著差异,表现出其在有氧条件下更强的竞争与定殖能力。乳酸杆菌属在不同层次样本中存在显著的丰度梯度差异,中层的丰度显著高于下层(P=0.009 33),而在上层的丰度又显著高于中层(P=0.036)和下层(P=0.035),分布模式与其兼性厌氧的特性相符,表明其在有氧与厌氧过渡区及有氧区表现出良好的适应性。除此外,白酒生产堆发酵中微生物演替的关键驱动因素有还原糖,而酸度、酒精度和温度等[16]。

2.1.7 不同部位浓香型白酒糟细菌功能预测

基于16S rDNA基因测序数据利用 PICRUSt2对菌群代谢功能进行预测,如图6所示,各层酒糟的微生物功能预测大致相同,酶活性主要集中在蔗糖-6-磷酸酶、磷酸甘油酸变位酶、碱性氨基酸/多胺逆向转运蛋白(APA 家族)、L-乳酸脱氢酶等功能酶。功能预测中蔗糖-6-磷酸酶、磷酸甘油酸变位酶作为碳代谢的枢纽为酒体发酵微生物的提供能量和还原力[17-18],碱性氨基酸/多胺逆向转运蛋白(APA家族)在帮助维持pH稳态和抵抗酸应激中发挥核心作用,乳酸是构成白酒独特风味和口感(如醇厚、绵甜)的关键骨架成分[19],高丰度的L-乳酸脱氢酶编码基因与优势菌乳酸菌的乳酸代谢活动直接相关,后续据乳酸这一代谢物筛选产酸菌种进行探究。

2.2 目的菌株的分离与鉴定

实验共筛选分离得到18株菌株,革兰氏染色镜检观察细胞形态主要有杆状和球状2种,单个或短链状排列,革兰氏染色均阳性。Sanger测序与数据库中已有的16S rDNA序列进行对比结果如表3所示。

其中7株与阿根图拉特乳植杆菌相似,1株与戊糖乳植杆菌相似,4株与地衣芽孢杆菌相似,2株与粪海恩德里克斯氏菌和4株与凝结海恩德里克斯氏菌相似,表中18株菌株分别与5种菌株同源,其中乳酸菌的占比超过1/3,虽占比最高,但与高通量测序结果有一定的差异性,可能与所选择的培养筛选条件有关。分别选取这5株菌株同源性最高菌株构建系统发育树(图7),所示均属厚壁菌门,杆菌纲,A0001与A0008,A0013与A0015间具有较近的亲缘关系,A0009与4株菌株的进化距离均较远。

2.3 分离菌株发酵特性分析

2.3.1 分离菌株耐酸性能比较

发酵酒糟菌株需对酸性环境具有较强的耐酸性,所以分离菌株耐酸性检测环境pH值设为3.5和3.0。如表4所示,A0001、A0008菌株对酸性环境适应能力较强。乳植杆菌属对环境有广泛适应能力,可耐高温、低pH以及高渗透压[20],其防御策略与高H+-ATPase活性和胞内ATP水平,以及细胞膜脂肪酸不饱和度和单不饱和脂肪酸的含量的变动有关[21]。

2.3.2 分离菌株耐乙醇性比较

如图8-a所示,在酒精浓度较低时,A0001与A0008的生长活性较高,在高于5%乙醇浓度后,A0001和A0008的活性极速下降。图8-b所示,酒糟源分离菌株均有较强ADH活性,A0001菌株的ADH活性最佳,为0.041 U/104 CFU,A0008的ADH活性次之。ADH活性越高在酒糟的高乙醇胁迫环境发酵潜力越大,综合A0001和A0008的低浓度乙醇耐受性和耐酸性,以及其耐受酒体功能基因的研究[22-23],A0001和A0008在酒糟环境发酵有较大潜力。

2.3.3 分离菌株产酸量比较

5种菌株发酵5 d后以乳酸计的产酸量见图9,A0001和A0008的产酸量最高,分别为24.09、23.18 g/L,A0009、A0013、A0015,产酸量均低于8 g/L。乳植杆菌属的乳酸高产特性可能与三羧酸循环、糖酵解、ABC转运体、D-氨基酸代谢、丙酸代谢等生长代谢途径有关[24]。

2.3.4 分离菌株抗氧化性能比较

分离菌株抗氧化性能如图10所示,DPPH自由基的清除率均高于50%,其中A0001最高(78.58%),其次为A0008、A0013、A0015,A0009最低(60.65%)。ABTS阳离子自由基的清除率均高于30%,其中A0001、A0008、A0013较高(46%～49%),A0009与A0015较低(约35%～37%)。研究表明乳植杆菌属可清除DPPH自由基、ABTS阳离子自由基和超氧阴离子自由基,对高浓度过氧化氢和羟自由基具有独特抗性,这与其所产生的超氧化物歧化酶[25]和分泌的胞外多糖[26]有关,在调节肠道菌群减缓衰老方面有较大的益生潜力[27]。

2.3.5 分离菌株酒糟发酵蛋白产量比较

各菌株固态发酵可溶性蛋白产量如图11所示,发酵5 d后A0001和A0008产量较高,比黑曲霉等常用的商业菌株发酵效果更好,酒糟中的可溶性蛋白的含量从25.04 mg/g分别提高到48.06 mg/g和47.00 mg/g,产率提升近90%。这预示酒糟源菌株对高胁迫复杂环境的预适应潜力,开发基微生物发酵调控技术,有望为经济可行且可持续的工业发酵提供潜在支持[28]。

3 结论与讨论

高通量测序结果表明,上、中、下各层的浓香型白酒糟物种丰富度相似,优势科都是乳杆菌科,与陈慧颖等[3]的结果相似,而徐相辉等[29]新窖和老窖不同深度窖泥的有机酸和微生物群落结构分析当中,新窖泥中浅层和深层窖泥中占据主导的均是乳杆菌属,则本次所取样品的窖池窖龄可能较小,菌落组成还不够成熟,后续可以向其中加入己酸菌、梭酸菌等功能菌改善窖池微生物群落组成使得白酒的风味更加丰富[30]。

本研究从酒糟分离出18株菌,其中分离株A0001(阿根图拉特乳植杆菌)和分离株A0008(戊糖乳植杆菌)综合能力较强,A0001与A0008的耐酸活性与赵皓静等[31]在浓香型白酒酒糟中筛选分离的耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)相似,均具备耐受pH 3.0的胃酸环境能力,而李金梅等[32]研究中人源植物乳植杆菌HLPL03在pH 2.0～2.5的胃液存活率可达100%,乳杆菌在不同环境下的可塑性优异,后续可通过适应性驯化或基因改造继续增强其耐受性。2株分离株的抗氧化活性与吴雨甍等[7]从酱香型酒糟中和曾诚等[33]从恩施泡菜中分离的的植物乳植杆菌一致,DPPH自由基的清除率均大于70%,与刘辉等[34]从发酵蔬菜中分离的植物乳植杆菌HNLJJ-2相似,对ABTS阳离子自由基清除率均大于48%,不同来源的乳杆菌在抗氧化性能上可能存在共性机制,如胞外多糖的分泌或抗氧化酶系统防御[25-26]。A0001与A0008摇瓶培养产酸量较高于李霄霄[8]从酱香型白酒酒糟筛选植物乳植杆菌,但乳酸产量均大于20 g/L,野生菌株所具备的安全性和自然属性,使其可作为发酵剂,SHEN 等[35]所设计的植物乳植杆工程菌用于葡萄渣发酵生产的L-乳酸纯度可达99.61%,对固料预处理后乳酸产率高达96.26%。乳酸与酒体口感、香味等密切相关,可调节发酵环境pH值,保证白酒发酵质量,植物乳植杆菌是发酵环境酸碱度调控的关键微生物,产酸能力受季节影响[36],酒糟源微生物耐受性能差异可能与地域气候有关。

酒源环境的长期乙醇胁迫易提升菌体的乙醇耐受性[37],A0001与A0008在乙醇耐受性能与肖健等[38]筛选的植物乳植杆菌J6和陈曼曼[39]从酸菜筛选分离的Lnj11-植物乳植杆菌相近,都可在5%乙醇浓度环境稳定生长,而有研究表明植物乳植杆菌P101可通过AMPK激活减弱酒精诱导的小鼠肝脂积累延缓酒精性肝病[40],WANG等[41]从中国白酒发酵谷物中分离出的戊糖乳植杆菌LTJ12、植物乳植杆菌LTJ30也验证能防止醉酒,有改善酒精性肝损伤等益生机制。从酒糟中筛选分离的A0001与A0008菌株所具备的类似卓越特性,预示它们在醒酒护肝类益生菌产品开发中应具有独特的应用前景。

利用筛选分离的酒糟源菌株对酒糟进行固态发酵,编号A0001菌株发酵后酒糟中可溶性蛋白的含量最高,相比常用商业菌株产率提升近90%。童文华等[42]从浓香型白酒大曲中筛选假单胞菌(Pseudomonas)通过优化液态发酵培养基使得产酶活性提升约3倍,宋善丹等[43]通过不同菌株组合发酵白酒糟,显著提高粗蛋白的发酵产量,后续可继续优化酒糟源菌株在固态发酵中的应用工艺,对酒糟中的其他营养物质高效利用,以实现酿酒副产物的绿色、高值化循环。

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Analysis of bacterial community structure in strong-flavor Baijiu distiller’s grains and screening and identification of functional strains

LI Jian1,2,HUANG Chuanyao1,CHEN Xiaoxiao1,YU Shiyu1,YANG Lei3,CHEN Yongmei1*

1(College of Chemical Engineering,Sichuan University of Light Chemical Technology,Zigong 643000,China)2(Liquor-Making Science and Technology Key Laboratory of Sichuan Province,Yibin 644000,China)3(Sichuan Mingchuang Technology Co.,Ltd.,Luzhou 646000,China)

ABSTRACT The traditional brewing of strong-flavor Baijiu uses the “millennium pit mud” method.The fermented grains in the pit naturally form three functional zones(upper,middle,and lower)with gradient characteristics.This study analyzed the microbiota in fermented grains from a Luzhou distillery using 16S rDNA high-throughput sequencing.The results showed no significant differences in bacterial alpha diversity across the three layers.Lactobacillaceae was the absolutely dominant family,with a relative abundance of 97.29%.At the genus level,Lactobacillus had a higher relative abundance in the upper layer than in the others.Unclassified Lactobacillus species accounted for a high proportion in all layers.Based on community structure analysis and KEGG functional predictions,this study isolated 18 acid-producing strains.These strains showed high similarity(≥98%)to Lactiplantibacillus argentoratensis,L.pentosus,Bacillus licheniformis,Heyndrickxia faecalis,and Heyndrickxia coagulans.Among them,strains A0001 and A0008 exhibited strong comprehensive capabilities in acid tolerance,ethanol tolerance,acid production,and antioxidant activity.When applied to solid-state fermented grains,their soluble protein yield significantly exceeded that of commonly used commercial strains,such as Aspergillus niger.This study provides a reference for the high-value application of functional strains derived from fermented grains.It also offers microbial strain support for the resource utilization of strong-flavor Baijiu fermented grains.

Key words distiller’s grains; high-throughput sequencing; bacterial community structure; KEGG function; screening and isolation

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.046073

引用格式：李健,黄传耀,陈潇潇,等.浓香型白酒糟细菌群落结构解析及功能菌株的筛选鉴定[J].食品与发酵工业,2026,52(16):181-190.LI Jian,HUANG Chuanyao,CHEN Xiaoxiao,et al.Analysis of bacterial community structure in strong-flavor Baijiu distiller’s grains and screening and identification of functional strains[J].Food and Fermentation Industries,2026,52(16):181-190.

第一作者：硕士研究生(陈咏梅讲师为通信作者,E-mail:chenyongmei@suse.edu.cn)

基金项目：泸州老窖研究生创新基金项目(LJCX2025-7);四川省自然科学基金项目(2025ZNSFSC0975);四川轻化工大学横向项目(HX2024037,HX2023131);五粮液-四川轻化工大学研究项目(CXY2021ZR005);教育部产学合作协同育人项目(2409124437)

收稿日期：2026-01-31,改回日期：2026-04-03