热凝胶是一种由β-1,3-糖苷键连接而成的细菌胞外多糖[1-2],主要由土壤杆菌在氮源受限条件下合成。因其卓越的流变特性、冻融稳定性和持水性,被广泛应用于食品行业中[3],并于1996年在美国获批作为食品添加剂使用[4]。此外,热凝胶凭借其良好的生物相容性、安全性以及独特的凝胶结构,在生物医学和制药领域展现出广阔的应用前景,尤其作为药物载体,可通过调控药物释放速率以提高治疗效果[5-6]。因此,通过发酵过程优化提高热凝胶合成效率,已成为相关研究的重要方向。
热凝胶的生物合成通常表现为非生长偶联型产物合成模式[7],即在菌体生长受到氮源限制时,碳源逐渐转向胞外多糖的合成与积累。近年来,研究者通过菌种选育、遗传改造[8-9]以及发酵过程优化构建[10]等策略,在一定程度上提高了热凝胶的发酵产量。在众多影响因素中,氮源作为微生物生长与代谢调控的重要营养因子,对热凝胶的合成过程具有关键作用[11]。适宜的氮源浓度有利于促进菌体生长并为后续多糖合成提供代谢基础,而氮源过量则可能导致代谢流偏向菌体增殖,从而抑制多糖积累[12]。因此,通过调控氮源种类、补加时间及供给方式实现氮源动态调控,被认为是提高热凝胶合成效率的重要发酵策略。然而,现有研究多集中于提高产量,对于氮源调控对热凝胶凝胶性能及结构特征的影响仍缺乏系统研究。
近年来,由多糖降解获得的功能性寡糖因其潜在的健康效益而受到广泛关注。热凝胶寡糖是一类由β-1,3-葡聚糖降解产生的低聚糖,具有良好的水溶性和生物活性,被认为具有潜在的益生元功能[13]。研究表明,β-葡聚糖类寡糖能够促进双歧杆菌和乳酸菌等有益菌的生长,并在调节肠道微生态、免疫调节和抗氧化等方面发挥积极作用[14]。目前,热凝胶寡糖的制备方法主要包括物理降解、化学水解和酶解等方式,其中酶解法因反应条件温和、选择性高和环境友好等优势,被认为是制备功能性寡糖的理想方法[15]。然而,热凝胶分子之间存在较强的氢键作用,其致密的三维网络结构在一定程度上限制了酶对底物的可及性,从而影响酶解效率及寡糖生成特性。值得注意的是,热凝胶的结构特性与其发酵合成过程密切相关。不同发酵条件下形成的热凝胶在分子间氢键作用强度、网络结构致密程度及微观形貌等方面可能存在差异,这些结构差异不仅影响其凝胶性能,还可能进一步改变酶分子对底物的可及性,从而影响酶解效率及寡糖生成特性。
尽管已有研究表明氮源调控对热凝胶合成具有重要影响,但其在结构构建及后续酶解行为中的作用机制仍不清晰。尤其是,不同氮源供给策略是否通过调控热凝胶的分子结构与网络构型,进而影响酶对底物的可及性及寡糖生成效率,尚缺乏系统性研究与机制性阐释。基于此,本研究以土壤杆菌ATCC 31749为研究对象,系统考察了不同氮源种类、补加时机及补加方式对热凝胶合成效率、凝胶性能及结构特征的影响,并进一步分析结构差异对热凝胶寡糖生成效率的影响。在此基础上,通过优化酶解工艺参数实现热凝胶寡糖的高效制备。本研究旨在从氮源动态调控角度,阐明其在热凝胶生物合成及结构构建过程中的作用机制,为发酵过程工艺优化、结构定向调控及功能性寡糖的高效制备提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌种
土壤杆菌ATCC 31749保藏于江南大学糖生物制造与生物反应器研究室。
1.1.2 培养基
平板培养基(g/L):葡萄糖 40.0,酵母膏 10.0,琼脂粉 20.0,pH 7.0。
种子培养基(g/L):葡萄糖 20.0,酵母膏 10.0,KH2PO4 3.0,MgSO4 0.6,pH 7.0。
发酵培养基(g/L):葡萄糖 50.0,酵母膏 1.5,KH2PO4 2.0,MgSO4 0.6,NH4Cl 2.0,CaCO3 3.0,10 mL无机盐浓缩液(含CaCl2,NaCl,FeCl3,MnCl2,各1.0 g/L),pH 7.0。
1.2 仪器与设备
BioFlo 120 7-L发酵罐,美国Eppendorf公司;SBA-40E生物传感分析仪,山东省科学院生物研究所;TA.XT plus质构分析仪,英国SMS公司;DAWN HELEOS Ⅱ多角度激光光散射凝胶色谱系统,美国Wyatt公司;UltrafleXtreme质谱仪,美国Bruker Daltonics公司;ICS-5000离子色谱仪,美国赛默飞世尔科技公司;NEXUS傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)仪,美国Thermo公司;Quanta 200扫描电子电镜,荷兰Fei公司。
1.3 实验方法
1.3.1 培养方法
将土壤杆菌于平板培养基中划线,30 ℃培养48 h。然后,挑取单菌落接种至50 mL种子培养基中,于30 ℃、200 r/min培养16 h。以10%(体积分数)接种量将种子液接种至50 mL发酵培养基中,于30 ℃、200 r/min条件下培养至72 h。为考察氮源种类及浓度对热凝胶合成的影响,分别选取浓度为1、2、3 g/L麦芽浸粉、NH4Cl、(NH4)2HPO4、(NH4)2SO4和KNO3作为发酵培养基中的氮源,在30 ℃、200 r/min下培养72 h,以热凝胶产量为评价指标筛选最适氮源。在此基础上,进一步开展氮源补加时机与浓度优化实验:分别于菌体生长期(12 h)或热凝胶合成初期(36 h)向发酵体系补加体积分数0.2%～1.2%的100 g/L NH4Cl溶液,继续培养至72 h。
7-L发酵罐培养:以10%(体积分数)接种量将种子液接种至初始装液量为3.5 L发酵培养基中,于菌体生长期(12 h)分别采用一次性投加(single-pulse,SP)、间歇式补加(intermittent feeding,IF)和恒速流加(constant-rate feeding,CF)3种方式补加体积分数0.6%的100 g/L NH4Cl溶液,发酵过程通气量为1.0 vvm,温度30 ℃。采用两阶段控制策略,用2 mol/L HCl和2 mol/L NaOH将菌体生长期(0～24 h)和热凝胶合成期(24～120 h)的pH值分别控制至7.0和5.6。同时,通过调节搅拌转速,将菌体生长期和热凝胶合成期的溶解氧分别控制至55%和45%。当发酵体系的残留葡萄糖浓度降至10 g/L以下时,补加适量500 g/L葡萄糖浓缩液。
氮源补加方式设置如下:a)SP:于补加时间点一次性补加体积分数0.6%的100 g/L NH4Cl溶液;b)IF:将体积分数0.6%的100 g/L NH4Cl溶液分3次补加,自补加时间点起,每次间隔1 h;c)CF:自补加时间点起,以28 mL/h的恒定流速连续补加体积分数0.6%的100 g/L NH4Cl溶液。
1.3.2 热凝胶寡糖的制备
采用碱中和法制备热凝胶悬浊液:称取2 g热凝胶样品,加入100 mL 1 mol/L NaOH溶液充分溶解,随后滴加1 mol/L HCl溶液调节至中性。离心后弃去上清液,用去离子水洗涤2～3次以去除残余盐分。最终使用pH 5.5、50 mmol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液配制成质量浓度为10 g/L的热凝胶悬浊液,作为葡聚糖酶水解反应的底物,葡聚糖酶购自源叶生物科技有限公司。
为比较不同结构热凝胶的酶解行为差异,分别以SP、IF、CF三种自制热凝胶及商品热凝胶(curdlan,CUR)为底物,分别配制成质量浓度为10 g/L的悬浊液,加入0.1 g葡聚糖酶,在50 ℃水解1 h;反应结束后经沸水浴中处理10 min终止反应,离心取上清液测定热凝胶寡糖含量,以评价不同底物的酶解效果。
在此基础上,以酶解效果最佳的底物为对象优化水解条件。通过改变底物浓度筛选最适底物浓度;随后在最优底物浓度条件下,延长至5 h,每隔0.5 h取样,取样测定寡糖生成量以确定最适水解时间;最后在最优底物浓度和水解时间条件下,考察不同加酶量对寡糖产量的影响,从而确定最佳酶添加量。
1.3.3 热凝胶的分离提取
通过碱中和处理提取发酵液中热凝胶,步骤如下:发酵液于8 000 r/min离心15 min,弃上清液,补加等量1 mol/L NaOH并振荡以溶解热凝胶。然后于8 000 r/min离心10 min,取上清液,并加入2 mol/L HCl调节pH值至7.0,于8 000 r/min离心15 min以沉淀热凝胶样品。用超纯水洗涤样品3～4次后,冷冻干燥即可得到热凝胶样品。
1.3.4 热凝胶寡糖的分离纯化
发酵液经8 000 r/min离心15 min去除菌体沉淀后,取上清液,采用醇沉分离热凝胶寡糖。首先向上清液中加入1.5倍体积无水乙醇,在4 ℃静置5 h,以去除大分子多糖;8 000 r/min离心10 min弃去沉淀,随后向上清液中加入7.5倍体积无水乙醇,8 000 r/min离心20 min收集沉淀。所得沉淀以超纯水复溶后,采用Sevage试剂[V(三氯甲烷)∶V(正丁醇)=4∶1]进行脱蛋白处理,重复操作直至大部分蛋白质被去除。随后通过Sep-Pak C18小柱进一步除蛋白,样品溶液经浓缩后,采用透析袋除去盐离子及小分子杂质,最终冷冻干燥,获得热凝胶寡糖样品。
1.3.5 分析方法
1.3.5.1 生物量和热凝胶产量测定
通过干重法测定土壤杆菌的生物量和热凝胶产量[16]。首先,10 mL发酵液以8 000 r/min离心15 min,弃上清液。将含有菌体和热凝胶的沉淀物重悬于等量1 mol/L NaOH中,并振荡以完全溶解热凝胶。然后,以8 000 r/min离心10 min,分离上清液和菌体沉淀物。随后,用0.1 mol/L HCl和超纯水依次洗涤菌体沉淀物。用2 mol/L HCl将上清液的pH值调节至7.0,以8 000 r/min离心15 min以沉淀热凝胶,然后用超纯水洗涤样品3～4次。最后,将菌体和热凝胶在60 ℃下烘干至恒重。
1.3.5.2 葡萄糖浓度测定
发酵液离心后取上清并用适量超纯水稀释,通过生物传感分析仪测定葡萄糖浓度。
1.3.5.3 热凝胶寡糖产量测定
热凝胶寡糖产量由总糖含量减去葡萄糖浓度得到,其中总糖含量由硫酸蒽酮法进行测定。
1.3.5.4 NH4Cl浓度的测定
发酵液离心后取上清并用适量超纯水稀释,通过苯酚-次氯酸盐分光光度法测定NH4Cl浓度。
1.3.5.5 持水性的测定
取2 g热凝胶溶于100 mL去离子水,使用均质机将悬浮液以13 000 r/min均质5 min后置于95 ℃水浴锅中加热10 min,冷却后离心弃去上清液,称取凝胶样品的总质量。持水性以单位干燥样品在煮沸处理后所能保持的凝胶总质量表示[17]。
1.3.5.6 凝胶强度测定与质构分析
分别配制质量浓度为20、60 g/L的热凝胶溶液,先置于60 ℃水浴中加热4 h,使样品充分溶胀。随后采用均质机以6 000 r/min转速均质3 min,均质后的悬浮液继续置于95 ℃水浴中加热30 min,并静置冷却30 min以形成热不可逆凝胶。所得20、60 g/L的凝胶分别用于后续凝胶强度与质构测定[18,19]。采用质构分析仪进行测试,探头型号为P/0.5用于凝胶强度测定、P/0.5R用于质构测定,测试前速度、测试速度及测试后速度均设定为2 mm/s;目标模式为应变控制,压缩形变量为50%,触发力为10 g,测试时间为5 s。
1.3.5.7 分子质量测定
热凝胶寡糖的分子质量通过高效凝胶过滤色谱法(high performance gel filtration chromatography,HPGFC)测定。将样品溶于0.1 mol/L NaNO3溶液中配置成浓度为5 mg/mL,经膜过滤后进行上机测试。测试条件如下:色谱柱为Ultrahydrogel TM Linear(7.8 mm×300 mm,Waters),流动相为0.1 mol/L NaNO3,流速为0.5 mL/min,柱温为45 ℃。
1.3.5.8 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析
取适量样品,配制成浓度为1 g/L的溶液,吸取1.2 μL样品,点涂于靶板上,再吸取等量2,5-二羟基苯甲酸(2,5-dihydroxybenzoic acid,DHB)基质溶液与样品混合,将靶板置于真空泵中进行干燥,随后将靶板放入质谱仪中,采用正离子反射法模式进行分析。
1.3.5.9 单糖组成分析
使用离子色谱仪测定样品的单糖组成。称取5 mg样品,溶解于2 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液中,置于120 ℃金属浴中反应6 h,使样品完全水解。反应后,冷却样品,加入甲醇并用氮气吹干,重复3～4次以完全去除三氟乙酸。然后,加入超纯水溶解水解产物,制备约50 mg/L的待测溶液,经过膜过滤后进行离子色谱分析。测试条件如下:使用配备CarboPac PA10色谱柱的离子色谱系统,流动相为200 mmol/L NaOH和1 mmol/L NaAc,流速为0.45 mL/min,柱温为30 ℃,进样体积为10 μL。
1.3.5.10 FTIR分析
FTIR仪以0.5 cm-1的分辨率在波数500～4 000 cm-1扫描32次采集样品的红外光谱数据。
1.3.5.11 扫描电镜观察(scanning electron microscope,SEM)
通过扫描电镜观察热凝胶样品的表观形貌。将冷冻干燥的热凝胶样品切片固定在金属圆台上,并对样品进行喷金处理。随后,采用扫描电镜在5 kV的加速电压下观察样品。
1.4 数据处理
采用Origin 2025软件进行数据处理与绘图。所有实验均独立重复进行3次,结果以“平均值±标准差”表示。采用SPSS软件进行统计分析,运用单因素方差分析(analysis of Variance,ANOVA)检验组间差异,显著性水平设定为P<0.05。
2 结果与分析
2.1 氮源种类对热凝胶合成的影响
氮源类型在热凝胶生产过程中具有关键作用,已有研究表明,其种类和供给形式可显著影响产物合成效率[20]。为系统考察不同氮源种类及其浓度对热凝胶产量的影响,并筛选适宜的氮源条件,本研究分别选取麦芽浸粉、NH4Cl、(NH4)2HPO4、(NH4)2SO4和KNO3作为培养基中的氮源进行对比分析。如图1所示,当以NH4Cl作为氮源且质量浓度为1 g/L时,热凝胶产量达到最高值,显著高于其他氮源条件。此外,以
形式存在的氮源可能更有利于热凝胶合成与积累,表明不同无机氮源在离子组成、解离特性及细胞可利用性方面存在差异,从而对热凝胶合成产生不同影响。因此,NH4Cl在本研究条件下表现出作为热凝胶合成最优氮源的潜力,为后续氮源供给策略的优化与发酵过程调控提供了重要依据。
图1 氮源种类及浓度对热凝胶产量的影响
Fig.1 The Effect of nitrogen source type and concentration on curdlan yield
注:不同小写字母为差异显著(P<0.05)(下同)。
2.2 氮源补加时机与浓度优化对热凝胶合成的影响
热凝胶的生物合成过程是典型的非生长偶联型代谢[7]。为考察不同氮源补加时间对热凝胶产量及菌体生物量的影响,本研究以1 g/L NH4Cl为初始氮源,并分别在菌体生长期(12 h)与产胶阶段(36 h)定量补加体积分数0.4% NH4Cl。由图2-a可知,在12 h补加氮源可显著提高热凝胶产量及菌体生物量,而在36 h补加氮源对两者的提升效果不显著。前期研究表明适宜的菌体浓度是实现热凝胶高效合成的重要前提[21]。结果表明,氮源主要通过调控菌体生长及其代谢潜力,进而影响后续产胶能力,当发酵体系进入产胶阶段后,再次补加氮源已难以有效改变代谢流向。因此,在菌体生长期补加氮源以提高热凝胶产量在工艺上具有可行性和必要性。
a-补加氮源时间;b-氮源补加量
图2 氮源补加时机与浓度优化对热凝胶合成的影响
Fig.2 The effect of nitrogen source addition timing and concentration optimization on curdlan synthesis
基于上述结果,进一步对菌体生长阶段的氮源补加量进行优化。图2-b显示,当在12 h补加体积分数0.6% NH4Cl后,热凝胶产量达到最高值,为26.6 g/L,较未补加组提高了18.1%。然而,随着氮源补加量的进一步增加,热凝胶产量反而呈现下降趋势,而生物量并未同步提高,表明过量氮源并未进一步促进菌体生长。推测在较高氮水平下,体系C/N比失衡可能扰乱菌体代谢稳态,抑制产胶相关代谢通路的有效运行,从而降低代谢底物流向热凝胶合成途径的效率[22]。因此,合理控制氮源补加时机与补加水平,是协调菌体代谢状态与产物合成、实现热凝胶高效生产的关键调控策略。
2.3 氮源补加方式对热凝胶合成的影响
在7 L发酵罐中开展放大试验,以进一步评估不同氮源补加方式对热凝胶合成及葡萄糖摄取行为的影响。图3显示了不同补加方式对热凝胶产量和葡萄糖消耗的情况。结果表明,氮源完全消耗后,热凝胶开始合成。在发酵104 h后,SP组的热凝胶产量稳定在33.64 g/L;与此同时,IF组和CF组热凝胶的产量分别为27.45、37.68 g/L。随后,IF组和CF组的热凝胶产量持续增加,在发酵120 h时,IF组和CF组的产量分别达到了31.1、43.4 g/L。由此可见,CF组的热凝胶产量始终保持在较高水平,最终达到实验中的最高产量。相比之下,LIU等[23]构建了通过补加内切β-1,3-葡聚糖酶实时降解菌体表面多糖包裹层,以强化热凝胶合成的土壤杆菌发酵耦合酶解体系,但其热凝胶终产量仅为34.53 g/L。在发酵120 h后,3组的葡萄糖消耗量表现出显著差异。SP组消耗的葡萄糖为59.25 g/L,IF组为44.75 g/L,而CF组则为95 g/L,葡萄糖转化率分别为56.78%、69.5%、45.68%。这些结果表明,CF组虽然能够保持较高的热凝胶产量,但其葡萄糖转化率较低,这可能与稳定的氮源供应和持续的碳源吸收机制有关。姚博伟等[24]研究发现,在发酵中期放料后采用连续流加培养基的发酵工艺,可通过维持菌体较高的生理活性,使体系长期处于高效合成热凝胶的状态,从而显著提高产量。研究结果与本实验中CF条件下热凝胶产量显著提高的现象具有一致性。稳定的氮源供应能够避免一次性补加造成氮源瞬时过高引起的代谢抑制,从而更有利于热凝胶生物合成代谢途径的持续运行。此外,稳定的氮源供应还可能促进碳源的持续摄取与高效利用,使碳流更多地分配至热凝胶合成途径,进一步提升产物积累水平。
a-SP组;b-IF组;c-CF组
图3 不同氮源补加方式对土壤杆菌发酵特性的影响
Fig.3 Effects of different nitrogen source supplementation strategies on the fermentation characteristics of Agrobacterium fabrum
因此,不同氮源补加方式对热凝胶的生物合成产生了显著影响。CF补加方式能够获得最高的热凝胶产量,但其葡萄糖转化率较低,这表明连续流加培养基在维持菌体生理活性和促进热凝胶合成方面具有明显优势。相对而言,IF组表现出较高的的葡萄糖转化率,但其热凝胶产量较低,进一步验证了氮源补加方式在调节代谢途径中的关键作用。基于这些实验结果,CF补加方式在实现高效热凝胶生产方面具有较大的潜力。
2.4 氮源补加方式对热凝胶凝胶性能及质构性质的影响
此前,ZHU等[25]研究发现,培养基的无机盐组成可显著影响凝胶类产物的产量、凝胶强度、分子质量及质构特性,其中CoCl2和FeSO4在适宜浓度范围内表现出提升热凝胶产量及改善其结构特性的潜力。且WAN等[26]研究发现培养基中的碳源影响热凝胶的合成及特性。在此基础上推测,除产量因素外,氮源补加方式同样可能对热凝胶的结构与理化特性产生影响。由图4-a可见,不同氮源补加方式对热凝胶的凝胶强度和持水性均具有显著影响。其中,采用CF方式所得样品表现出更高的凝胶强度和更优的持水性。进一步地,图4-b～图4-c展示了不同氮源补加方式对热凝胶质构性质的影响。结果表明,与SP和IF方式相比,CF条件下获得的热凝胶在各项质构参数上均显著提高,并达到最大值。综合来看,CF方式所产热凝胶具有更高的凝胶强度、优异的持水性及整体质构稳定性,可利用该性质将其应用于对结构支撑性和口感稳定性要求更高的产品中。
a-凝胶强度、持水性;b-强度、回复性、内聚性;c-弹性、咀嚼性、胶黏性
图4 不同氮源补加方式对热凝胶产物性能的影响
Fig.4 Effects of different nitrogen source supplementation strategies on the properties of curdlan
2.5 产物的结构表征及表观形貌观察
为阐明不同氮源补加方式导致热凝胶宏观性能差异的结构基础,对产物进行了FTIR与SEM分析。结果表明,氮源补加方式在不改变热凝胶主体化学结构的前提下,显著调控了其分子间相互作用强度及空间网络构筑方式。FTIR分析显示(图5),各样品在3 400 cm-1附近均呈现宽而强的—OH伸缩振动吸收峰,且在890 cm-1处保持明显特征吸收,表明产物主体结构均为β-1,3-葡聚糖[23]。然而,不同样品在特征峰强度及峰形上存在差异,其中CF样品在—OH区域及890 cm-1附近的峰强明显增强,说明其氢键作用更为充分、链段取向度及有序结构比例较高;相比之下,SP、IF样品相关峰强较弱,其分子间作用力较弱、无定形区比例较大[27]。图6扫描电镜结果进一步证实了上述结构差异。CF条件下形成的热凝胶呈现出孔径较小、分布均一且结构致密的三维网络,而SP、IF样品则表现为孔径较大、结构相对疏松。结合结构表征结果可推测,恒速流加氮源通过改善热凝胶分子间相互作用与网络致密度,从结构层面解释了其在凝胶强度、持水性及质构性能上的优势,并为氮源动态调控实现热凝胶高品质制备提供了结构学依据。
图5 不同氮源补加方式制得热凝胶的FTIR分析
Fig.5 FTIR analysis of curdlan prepared using different nitrogen source supplementation strategies
a1-可得然胶样品SP(40×);b1-可得然胶样品IF(40×);c1-可得然胶样品CF(40×) a2-可得然胶样品SP(80×);b2-可得然胶样品IF(80×);c2-可得然胶样品CF(80×)
图6 不同氮源补加方式制得热凝胶的扫描电镜表观形貌
Fig.6 Surface morphology of curdlan prepared using different nitrogen source supplementation strategies observed by SEM
2.6 热凝胶特性对水解效果影响
由上述结果可知,不同氮源补加方式显著调控了热凝胶的宏观结构与理化特性。热凝胶寡糖作为具有潜在益生功能和良好水溶性的功能性寡糖,其高效、可控的制备不仅有助于提升产物附加值,也为功能食品和肠道健康调控领域提供重要的物质基础[28]。因此,阐明热凝胶结构特征对酶解行为的影响机制,对于实现寡糖的精准制备与聚合度调控具有重要理论意义和应用价值。
为进一步明确结构差异对酶解行为的影响,采用葡聚糖酶对SP、IF、CF三种自制热凝胶进行水解,并以CUR为对照,通过测定热凝胶寡糖产量比较其水解效果。图7显示,在相同酶解条件下,各样品寡糖生成量存在显著差异。总体上,SP样品寡糖产量最高,其次为IF和CUR,CF样品最低。结果表明,氮源补加方式所构建的网络结构差异显著影响酶对底物的可及性及水解效率。结合结构表征结果分析,CF样品具有更高的凝胶强度和更致密均一的三维网络结构,分子间氢键作用更充分,β-1,3-葡聚糖链段排列更为有序。该高度交联的致密结构虽有利于提升力学性能和持水性,但在酶解过程中会限制酶分子向网络内部扩散,降低酶与糖苷键的有效接触,从而表现出较低的水解效率。相比之下,SP和IF样品孔径较大、结构较为疏松,无定形区比例较高,网络开放度更大,更有利于酶分子渗透和底物暴露,因此寡糖产量较高。总体而言,热凝胶的凝胶强度、网络致密度及分子有序程度与酶解效率呈负相关,即结构越致密,其酶解抗性越强。
图7 不同热凝胶的水解效果
Fig.7 The hydrolysis effect of different curdlan
2.7 水解条件优化
为提高热凝胶寡糖的产量,以最优底物SP为研究对象,对热凝胶的酶解工艺进行优化,系统考察了底物浓度、水解时间及加酶量对热凝胶寡糖生成的影响。图8-a显示底物浓度对酶解效率具有显著影响。在相同条件下,随底物浓度升高,寡糖产量呈先增加后趋于稳定的趋势,当底物质量浓度为10 g/L时达到较高水平。底物浓度过低限制了可水解链段数量,而浓度过高则可能引起体系黏度增加及底物分散性下降,影响酶的扩散与底物可及性,从而使转化率提升受限。水解时间对寡糖积累具有关键作用。此外,随反应时间延长,总糖含量持续增加,但寡糖产量在3 h达到峰值,随后下降(图8-b)。说明酶解过程中存在逐级水解现象,初期以主链断裂为主,寡糖迅速积累;后期寡糖进一步水解为葡萄糖,使葡萄糖比例上升,导致目标寡糖产量降低。加酶量同样显著影响产物组成(图8-c)。随着酶添加量增加,寡糖产量先升高,在2 g/L时达到最大值;继续提高酶用量虽可增强底物断裂速率,但会加快寡糖向葡萄糖的转化,降低目标产物的相对比例。因此,在底物质量浓度10 g/L、水解时间3 h、加酶量2 g/L条件下,热凝胶寡糖产量最高。
a-底物质量浓度优化;b-水解时长优化;c-加酶量优化
图8 葡聚糖酶制备热凝胶寡糖工艺优化
Fig.8 Optimization of curdlan oligosaccharides process for enzyme preparation
2.8 分子结构表征
为初步表征由商品酶水解产生的热凝胶寡糖分子结构,对上述最优水解条件制备的热凝胶寡糖进行了分子质量、聚合度分布、单糖组成、FTIR分析。图9-a～图9-b显示,在优化条件下,所生产的热凝胶寡糖的分子质量为2 498 Da,聚合度分布为8～14,表明该寡糖的聚合度较为均一,符合预期的结构特征。单糖组成分析通过离子色谱法显示(图9-c),其水解产物在离子色谱图中仅出现了单一的葡萄糖峰,表明该寡糖仅由葡萄糖单元组成。图9-d的FTIR光谱分析结果显示了以下特征吸收峰:3 287.61 cm-1(—OH拉伸振动)、2 894.67 cm-1(—CH2—拉伸振动)、1 366.82 cm-1(C—H弯曲振动)、1 157.58 cm-1(C—O—C拉伸振动),以及889.04 cm-1的β-糖苷键的特征峰。此外,FTIR谱图在840 cm-1附近未观察到显著的吸收峰,表明缺乏α构型的糖苷键,这与先前的研究结果一致[29]。这些光谱特征进一步支持了热凝胶寡糖为线性β-1,3-葡萄糖寡糖结构。因此,通过分子质量、聚合度分布、单糖组成和FTIR分析对热凝胶寡糖的结构进行了初步表征,结果表明该寡糖主要由葡萄糖单元构成,且为β-糖苷键连接的线性结构。
a-分子质量;b-聚合度分布;c-单糖组成分析(编号1～10分别代表:岩藻糖、氨基半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖);d-FTIR
图9 热凝胶寡糖的分子结构特征
Fig.9 Structural characterization of curdlan oligosaccharides
3 结论
本研究系统阐明了氮源种类及其补加策略对热凝胶合成行为的调控作用,并进一步揭示了结构特征与酶解性能之间的内在关联。结果表明,在所筛选氮源中,1 g/L NH4Cl对热凝胶合成的促进作用最为显著。氮源补加时机对产量具有决定性影响,在菌体生长期补加NH4Cl可显著提升热凝胶产量,其中补加量为0.6%(体积分数)时效果最佳;继续提高补加量可能打破体系C/N比平衡,抑制产胶相关代谢通路的有效运行。在7-L发酵罐放大条件下,对SP、IF与CF三种策略进行比较发现,CF组热凝胶产量最高,达43.4 g/L,但其葡萄糖转化率为45.68%;IF组产量为31.1 g/L,但葡萄糖转化率可达69.5%。此外,不同补充策略获得的热凝胶在凝胶性能及质构性质方面亦存在显著差异。CF条件下所得热凝胶表现出更高的凝胶强度、优异的持水性及更稳定的质构特性。结构分析表明,在不改变β-1,3-葡聚糖主体化学结构的前提下,不同补加方式显著调节分子间氢键作用强度及三维网络的致密程度。且网络结构差异显著影响酶对底物的可及性及水解效率,氢键增强与网络结构致密化降低了酶分子对底物的可及性,从而提高酶解抗性并降低寡糖生成效率。在此基础上,通过优化水解工艺参数,确定底物质量浓度10 g/L、水解时间3 h、加酶量2 g/L为最佳条件,可获得分子质量2 498 Da、聚合度分布为8～14的热凝胶寡糖。综上,氮源动态调控不仅直接影响热凝胶产量,还通过调节分子间相互作用与空间网络构型,进一步决定其结构稳定性及酶解行为。CF策略在实现高产量与高结构稳定性方面具有优势,IF有利于提高葡萄糖转化率,而SP获得的热凝胶更易被酶水解,表现出较高的寡糖生成效率。本研究为基于营养调控实现热凝胶品质与性能定向构建提供了理论依据。未来可从分子代谢调控与代谢流分配角度深入解析氮源影响结构构建的内在机制,并结合不同结构热凝胶及其寡糖的功能活性与消化发酵特性研究,系统阐明其结构与功能关系。
[1] 姚博伟,武世强,高红亮,等.glnA基因敲除对土壤杆菌产可得然胶的影响[J].食品安全质量检测学报,2025,16(9):33-39.YAO B W,WU S Q,GAO H L,et al.Effects of glnA gene knockout on the production of available curdlan by Agrobacterium[J].Journal of Food Safety &Quality,2025,16(9):33-39.
[2] YUAN M,FU G,SUN Y M,et al.Biosynthesis and applications of curdlan[J].Carbohydrate Polymers,2021,273:118597.
[3] AQUINAS N,BHAT M R,SELVARAJ S.A review presenting production,characterization,and applications of biopolymer curdlan in food and pharmaceutical sectors[J].Polymer Bulletin,2022,79(9):6905-6927.
[4] MANGOLIM C S,SILVA T T,FENELON V C,et al.Description of recovery method used for curdlan produced by Agrobacterium sp.IFO 13140 and its relation to the morphology and physicochemical and technological properties of the polysaccharide[J].PLoS One,2017,12(2):e0171469.
[5] VERMA D K,NIAMAH A K,PATEL A R,et al.Chemistry and microbial sources of curdlan with potential application and safety regulations as prebiotic in food and health[J].Food Research International,2020,133:109136.
[6] SUFLET D M,POPESCU I,PRISACARU A I,et al.Synthesis and characterization of curdlan-phosphorylated curdlan based hydrogels for drug release[J].International Journal of Polymeric Materials and Polymeric Biomaterials,2021,70(12):870-879.
[7] WU D,LI A,MA F,et al.Genetic control and regulatory mechanisms of succinoglycan and curdlan biosynthesis in genus Agrobacterium[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2016,100(14):6183-6192.
[8] GAO H L,XIE F R,ZHANG W,et al.Characterization and improvement of curdlan produced by a high-yield mutant of Agrobacterium sp.ATCC 31749 based on whole-genome analysis[J].Carbohydrate Polymers,2020,245:116486.
[9] 付雅欣.热凝胶多糖产生菌株的诱变选育[D].上海:东华大学,2017.
[10] LEE J H,PARK Y H.Optimal production of curdlan by Agrobacterium sp.With feedback inferential control of optimal pH profile[J].Biotechnology Letters,2001,23(7):525-530.
[11] YANG H,LI W Q,CHEN S C,et al.Optimization and modeling of curdlan production under multi-physiological-parameters process control by Agrobacterium radiobacter mutant A-15 at high initial glucose[J].Biotechnology and Bioprocess Engineering,2021,26(6):1012-1022.
[12] 吴剑荣,詹晓北,刘惠,等.氨水流加用于粪产碱杆菌热凝胶发酵[J].生物工程学报,2008,24(6):1035-1039.WU J R,ZHAN X B,LIU H,et al.Enhanced production of curdlan by Alcaligenes faecalis by selective feeding with ammonia water during the cell growth phase of fermentation[J].Chinese Journal of Biotechnology,2008,24(6):1035-1039.
[13] CHEN Y J,SUI X,WANG Y,et al.Preparation,structural characterization,biological activity,and nutritional applications of oligosaccharides[J].Food Chemistry:X,2024,22:101289.
[14] SHI Y Q,LIU J,YAN Q J,et al.In vitro digestibility and prebiotic potential of curdlan(1→3)-β-D-glucan oligosaccharides in Lactobacillus species[J].Carbohydrate Polymers,2018,188:17-26.
[15] LIU Z H,XIONG Y J,YI L,et al.Endo-β-1,3-glucanase digestion combined with the HPAEC-PAD-MS/MS analysis reveals the structural differences between two laminarins with different bioactivities[J].Carbohydrate Polymers,2018,194:339-349.
[16] BALASUBRAMANI A,KOUNDINYA E,AQUINAS N,et al.Biopolymer curdlan production from rhizospheric bacteria Priestia aryabhattai BMS3 from Vigna radiata(mung bean)[J].Preparative Biochemistry &Biotechnology,2026,56(5):660-674.
[17] PEYRANO F,DE LAMBALLERIE M,AVANZA M V,et al.Gelation of cowpea proteins induced by high hydrostatic pressure[J].Food Hydrocolloids,2021,111:106191.
[18] HU W M,QIN X L,HUANG K,et al.Encapsulation of curcumin using curdlan-whey protein isolate composite gels:Gel properties,stability and in vitro release performance[J].Food Biophysics,2025,20(4):191.
[19] CUI B,MAO Y Y,LIANG H S,et al.Properties of soybean protein isolate/curdlan based emulsion gel for fat analogue:Comparison with pork backfat[J].International Journal of Biological Macromolecules,2022,206:481-488.
[20] L
PEZ-ORTEGA M A,RODR
GUEZ-HERN
NDEZ A I,CAMACHO-RUZ R M,et al.Physicochemical characterization and emulsifying properties of a novel exopolysaccharide produced by haloarchaeon Haloferax mucosum[J].International Journal of Biological Macromolecules,2020,142:152-162.
[21] 刘惠,詹晓北,吴剑荣.不同的底物流加方式对Alcaligenes faecalis发酵生产热凝胶的影响[J].生物技术,2008,18(4):78-81.LIU H,ZHAN X B,WU J R.Curdlan production by Alcaligenes faecalis with varied feeding strategy[J].Biotechnology,2008,18(4):78-81.
[22] WANG X Y Z,DONG J J,XU G C,et al.Enhanced curdlan production with nitrogen feeding during polysaccharide synthesis by Rhizobium radiobacter[J].Carbohydrate Polymers,2016,150:385-391.
[23] LIU Z L,XU Y,WANG Z C,et al.Promoting substrates uptake and curdlan synthesis of Agrobacterium sp.By attenuating the exopolysaccharide encapsulation[J].Carbohydrate Polymers,2023,315:120941.
[24] 姚博伟,陶鹏,常忠义,等.补料分批发酵优化土壤杆菌A02产可得然胶工艺[J].食品安全质量检测学报,2026,17(7):93-100.YAO B W,TAO P,CHANG Z Y,et al.Optimization of fed-batch fermentation process for curdlan production by Agrobacterium sp.A02[J].Journal of Food Safety &Quality,2026,17(7):93-100.
[25] ZHU X Y,YAO B W,YUE S Y,et al.Effects of inorganic salts on curdlan production and structural properties[J].Gels,2025,11(5):313.
[26] WAN J,WANG Y F,JIANG D M,et al.Effects of carbon sources on production and properties of curdlan using Agrobaterium sp.DH-2[J].Preparative Biochemistry &Biotechnology,2020,50(9):857-864.
[27] MANGOLIM C S,DA SILVA T T,FENELON V C,et al.Use of FT-IR,FT-Raman and thermal analysis to evaluate the gel formation of curdlan produced by Agrobacterium sp.IFO 13140 and determination of its rheological properties with food applicability[J].Food Chemistry,2017,232:369-378.
[28] ZENG M J,VAN PIJKEREN J P,PAN X J.Gluco-oligosaccharides as potential prebiotics:Synthesis,purification,structural characterization,and evaluation of prebiotic effect[J].Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety,2023,22(4):2611-2651.
[29] ZHOU M L,DAN M L,ZHAO G H,et al.Efficient preparation of β-1,3-glucooligosaccharides by microwave-assisted hydrothermal degradation of curdlan and preliminary exploration of its antibacterial activity[J].Food Chemistry:X,2024,24:101796.