芝麻香型白酒作为新中国成立后两大创新香型之一,其工艺融合了浓、清、酱三大香型特点,并经过不断地实践与系统研究,形成了“高氮配料、高温堆积、高温发酵、多微共酵、分层蒸馏、长期贮存、科学勾兑”为核心的独特工艺特征[1]。其中,高温堆积作为连接制曲与窖池发酵的核心枢纽,是形成芝麻香风格的关键工序。在此过程中,酒醅从空气中富集微生物,促进淀粉、蛋白质等原料转化为丰富的香气及其前体物质,对原酒的出酒率、风味和品质具有决定性影响[2-3]。目前,堆积工艺研究多集中于温度、水分、翻堆时间等操作参数的调控。例如,李小东[4]系统研究了堆积温度对微生物演替及原酒品质的影响;廖博曦[5]则在固态模拟发酵中探讨了水分、时间等多因素的作用。这些研究证实,工艺参数的改变确实能显著影响发酵进程和质量。然而,一个更为基础且常被忽视的核心因素是酒醅堆积的物理结构,即堆积形状。在传统酿造实践中,通常也会通过调控堆积高度来实现堆积形状的改变。堆积形状通过决定堆体的比表面积与孔隙结构,从根本上影响着热量积累与散失、水分迁移及氧气扩散等关键物理过程,最终塑造了截然不同的微生态环境。另外,现有研究已有关于堆积高度的影响。例如,商海林等[6]与刘宏基等[2]的研究均表明,堆高的变化会显著改变酒醅的升温曲线、水分分布及微生物数量。这些现象本质上可归因于堆高改变所导致的堆积形状差异。然而,这些研究多侧重于对理化指标与微生物数量等表观现象的关联性描述,未能系统阐释不同堆积形状如何通过调控微环境,进而决定微生物群落结构与最终风味物质组成的内在联系。
因此,本研究以不同堆积形状高温堆积酒醅为研究对象,通过设计不同比表面积差异的堆型,采用高通量测序、顶空-固相微萃取-气质联用(headspace solid-phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)及多元统计分析方法,旨在阐明不同堆积形状下酒醅微环境的动态变化规律;揭示形状因素对微生物群落结构及关键功能菌群富集的影响;探究酒醅与基酒中挥发性风味物质的组成差异及其微生物学关联。研究结果将为芝麻香型白酒酿造工艺的精准调控提供新视角与理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酒醅样品:试验酒醅样品来自山东某芝麻香型白酒手工酿造车间。酒醅经蒸熟、摊晾至38 ℃加曲后,为研究堆积形状的作用,取等量酒醅设计了3种不同比表面积差异的堆型,即扁平形(A)、缓坡型(B)与陡峭形(C),具体设计见图1。在堆积发酵的0、8、16、24、32、40 h,分别从每个堆体的a、b、c、d四个位点等量取样。各时间点样品经混匀后,分装于无菌袋,标记后置于-80 ℃超低温冰箱保存备用。
图1 堆积酒醅取样点位置示意图
Fig.1 Schematic diagram of the sampling locations in the stacked Jiupei
原酒样品:为探究堆积形状的终极影响,不同堆型(A、B、C)的酒醅在堆积结束后,分别转入预先选定的、发酵性能稳定且条件相近的独立窖池中,进行后续的窖内发酵。待窖池发酵完成后,将各组酒醅取出,并分别进行蒸馏,不同堆积形状原酒样品分别记为堆A、堆B和堆C。
DNA提取试剂盒,美国QIAGEN公司;rTaq DNA聚合酶试剂盒、DNA Marker,北京全式金生物技术有限公司;引物合成,生工生物工程(上海)股份有限公司;乙酸戊酯、叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸(纯度均≥98.0%),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;乙醇(色谱纯),上海安谱实验科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
Illumina MiSeq 测序平台,上海美吉生物医药科技有限公司;AL204精密电子天平,梅特勒-托利多仪器;DH-20008 高速台式冷冻离心机,上海德洋意邦仪器有限公司;SPME 萃取头(DVB/CWR/PDMS)、GC色谱柱、TR-WAXMS毛细管色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm),美国赛默飞公司;多功能自动进样器,广州智达公司;Clarus 690/Clarus 5Q 8T GC-MS、Clarus 690 GC,美国 PerkinElmer 公司。DB-WAX(60 m×0.25 mm×0.25 μm)毛细管色谱柱,美国 Agilent 公司。
1.3 实验方法
1.3.1 理化指标的检测
为保障测温数据的代表性与准确性,监测点设于受环境干扰较小且能反映堆体整体热状态的堆体中心即堆高一半处,该选点原则与企业生产实践中的监控要求保持一致。具体测量采用“五点法”,通过在4个代表性边缘点及一个中心点使用车间专用温度计进行测定;酒醅水分、酸度、淀粉、还原糖的检测均参照沈怡方编著《白酒生产技术全书》[7]。水分的测定采用恒温烘干法;酸度的测定采用酸碱中和滴定法;还原糖的测定采用斐林试剂法;淀粉的测定采用酸水解法。
1.3.2 酒醅挥发性成分
参考LI等[8]的方法并稍作修改,用HS-SPME-GC-MS测定挥发性物质。HS-SPME条件:均匀称取1.0 g样品,置于20 mL顶空瓶中,加入1 mL 5%乙醇(体积分数),加50 μL 200 mg/L乙酸正戊酯内标。在50 ℃振荡孵育10 min。萃取吸附30 min,240 ℃解析5 min。GC条件:初始40 ℃保持5 min,4 ℃/min升温至100 ℃,6 ℃/min升温至230 ℃,保持10 min;进样口温度为250 ℃,离子源温度为230 ℃;载气为氦气,流速为1 mL/min,不分流进样,溶剂延迟时间5 min。MS条件:EI电离方式,电子能量为70 eV,离子源温度为230 ℃,传输线温度为230 ℃。采用全离子扫描(SCAN)方式,扫描范围为35～450 amu。根据NIST 20标准谱库定性,筛选相似指数(similarity index,SI)>80的挥发性化合物。根据内标含量及峰面积进行半定量分析。
1.3.3 高通量测序及数据处理
称取20 g酒醅样品,用无菌自封袋密封后,将样品委托上海美吉生物医药科技有限公司分别采用338F/806R和ITS1F/ITS2R通用引物扩增细菌16S rDNA V3V4可变区和真菌ITS1区,构建高通量测序文库及进行 Illumina MiSeq 双端测序。
1.3.4 基酒感官评价
基酒感官评价参考GB/T 33404—2016《白酒感官品评导则》。由7名专业品评人员采用编号暗评法,按照外观10分、香气30分、口味口感50分、风格10分,总分100分进行综合评定,各评委所打分数求平均值,即为该样品所得分数。
1.3.5 基酒挥发性成分
采用GC测定原酒的挥发性风味成分。分别取各参数酒样10 mL置于储备瓶,加入一定量混合内标配制液(加入后内标含量分别为叔戊醇:200 mg/L、乙酸正戊酯:200 mg/L、2-乙基丁酸:200 mg/L),混匀,取1 mL分装至进样瓶。GC条件:DB-WAX色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm);进样口温度250 ℃;进样量1 μL;分流比20∶1 载气:氮气(纯度≥99.999%);柱流量1 mL/min;升温程序:起始35 ℃,保持3 min,3.5 ℃/min升温至230 ℃,保持15 min;氢火焰离子化检测器(flame ionization detector,FID)温度250 ℃。定性定量分析:内标标准曲线定量分析以50 %vol酒精水溶液作为标准溶剂,加入已知浓度待测物标准储备液,并进行梯度稀释,配制成系列标准化合物溶液。加入同样品一致的内标溶液,进行GC-FID检测分析,检测条件与相应的前述方法一致。以待测物与相应内标物质的峰面积比为纵坐标,质量浓度比为横坐标,绘制标准曲线并对样品中各检出化合物进行精确定量。
1.4 统计和分析
微生物群落结构分析基于上海美吉生信云平台(https://cloud.majorbio.com)进行,通过R语言进行相关性网络构建,采用Gephi 0.10.1进行可视化表达。用Excel 2016、IBM Spass26.0进行数据分析,通过单因素方差分析(ANOVA)确定数据间差异显著性(P<0.05)。使用Origin 2022 Pro绘制折线图、Tbtools绘制热图、SIMCA 14.1进行主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘回归分析(orthogonal partial least-squares discrimination analysis,OPLS-DA)。
2 结果与分析
2.1 堆积形状对酒醅理化性质的影响
不同堆积形状下酒醅的理化指标变化如图2所示。各组酒醅均达到收堆温度要求,但升温趋势存在显著差异。其中,堆C升温最快,终点温度最高为53.4 ℃,堆A次之,由31.3 ℃升至52.6 ℃,堆B升温最为平稳,由30.3 ℃升至48.9 ℃。水分变化方面,仅堆B符合芝麻香型酒醅水分通常增加1%～2%的规律[9],增幅为1.24%;堆A和堆C则分别下降0.54%和2.61%。酸度随堆积形状由扁平向陡峭逐渐升高,堆C最高为2.73～3.12 g/L,堆B次之为2.52～2.93 g/L,堆A最低为2.02～2.49 g/L。淀粉消耗情况复杂,堆B消耗合理,下降0.92%,堆A消耗较多,下降2.25%,而堆C反而增加2.79%。还原糖在各组中均显著积累,堆A、堆B和堆C最终分别上升1.76%、2.39%、2.03%,其中堆B的积累过程最为稳定。以上结果表明,堆C因形状陡峭、比表面积小,热量更易积累,导致升温快、水分偏低、酸度升高,进而抑制淀粉分解;堆A形状扁平、比表面积大,热量散失快、水分挥发强,促使淀粉快速消耗与酸度上升;堆B则在各项指标中表现出更为合理和稳定的变化趋势。
A-温度;B-水分;C-酸度;D-淀粉;E-还原糖
图2 不同堆积形状对酒醅理化指标的影响
Fig.2 Effect of different stacking shapes on the physicochemical indices of Jiupei
注:不同小写字母代表同一堆积形状不同发酵时间间存在显著差异(P<0.05)。
2.2 不同堆积形状酒醅风味物质的分析
2.2.1 不同堆积形状酒醅风味物质的组成及含量分析
不同堆积形状酒醅中挥发性风味物质的组成与含量变化如图3所示。所有样品中共检出47种风味物质,包括酯类27种、醇类6种、醛酮类4种、酸类3种及其他类7种。随着堆积形状由扁平形向陡峭形变化,风味物质种类与总量均呈递增趋势,其中堆A检出39种,总量为42 419.30 mg/L;堆B检出40种,总量为68 048.03 mg/L;堆C检出44种,总量为75 082.62 mg/L。随着发酵的进行,不同形状酒醅的风味物质动态差异显著,表明堆积形状对风味物质的合成具有重要影响。
A-各类挥发性风味物质比例;B-各类挥发性风味物质大类总量;C-不同挥发性风味物质含量分布
图3 不同堆积形状下酒醅中挥发性风味物质的组成与含量变化
Fig.3 Changes in the composition and content of volatile flavor compounds in Jiupei under different stacking shapes
进一步分析发现,酯类物质的合成受堆积形状影响显著。堆A总酯含量波动下降,发酵结束时减少35.21%;堆B呈波动上升,增加3.2倍;堆C亦波动增加,增幅为1.6倍。具体而言,堆B中四大酯类均显著上升,而堆A和堆C除乙酸乙酯上升外其他酯类均下降;发酵结束时,堆B的己酸乙酯、丁酸乙酯和乳酸乙酯含量均显著高于其他组别,表明其堆积形状更有利于酯类合成与积累。醇类物质方面,各组均检出6种醇类,其含量随发酵进行显著增加,但变化趋势存在差异。异戊醇在堆A和堆C中波动上升,堆B则先升后降;糠醇在堆B中持续积累;苯乙醇在各组中均呈上升趋势。至发酵结束时,堆B的异戊醇、糠醇和苯乙醇含量均显著高于其他组。已有研究指出,异戊醇具发酵香与果香,过量则产生杂醇油味;糠醇呈焦糖甜香,积累不足可能影响酒体风味;苯乙醇具玫瑰花香,对酒体品质至关重要[10]。因此,堆B有利于醇类物质的合理积累,既为酯类合成提供前体,亦赋予酒体醇甜与焦香特征。酸类物质中,乙酸作为多种酯类的合成前体,在堆B和堆C中波动上升,在堆A中则下降;堆C的乙酸含量最高,堆B次之,堆A最低。此外,作为芝麻香型白酒典型“焦香”来源的4-乙烯基-2-甲氧基苯酚和愈创木酚[11],在堆B中的积累量显著高于堆A和堆C,说明堆B更有利于焦香特征物质的形成。
2.2.2 不同堆积形状酒醅风味物质差异性分析
对不同堆积形状酒醅的风味物质进行OPLS-DA与聚类分析,结果见图4。模型拟合结果显示(图4-A),自变量拟合指数(R2X)为0.741,模型预测指数(Q2)为0.807,2项数值均>0.5,表明模型可靠。OPLS-DA图中,不同堆积形状的样品分布于不同象限,彼此明显分离,说明其香气组成存在显著差异。另外置换检验(n=200)结果显示(图4-B),Q2回归线的截距为负值,表明该模型未过拟合。基于重要性投影(variable importance in projection,VIP)值(图4-C)>1和P<0.05为筛选条件,共筛选出16种关键差异风味物质。其中酯类7种,包括3-苯丙酸乙酯、戊酸乙酯、乙烯二乙酯、正己酸乙酯、丁二酸二乙酯、丁酸己酯和丁酸乙酯;醛类2种为苯甲醛、苯乙醛;醇类2种为糠醇、异戊醇;酸类2种为乙酸、己酸;以及其他类3种为愈创木酚、苯酚、苯乙烯。HONG等[12]指出3-苯丙酸乙酯、丁酸己酯、戊酸乙酯、苯甲醛和愈创木酚等风味物质对芝麻香型白酒具有重要贡献,而这些物质正是不同堆积形状之间的主要差异物质。因此,进一步证实堆积形状对酒醅风味物质组成的显著影响。
A-不同堆积形状酒醅偏最小二乘-判别分析;B-OPLS-DA200次置换检验结果;C-OPLS-DA重要性投影值(VIP)
图4 不同堆积形状酒醅挥发性风味物质差异性分析
Fig.4 Comparative analysis of volatile flavor compounds in Jiupei under differents tacking shapes
2.3 不同堆积形状酒醅微生物群落结构分析
2.3.1 不同堆积形状酒醅微生物α-多样性分析
经过高通量测序,共得到4 086 536条有效细菌序列,生成4 248个ASV;真菌获得5 430 826条有效序列,生成123个ASV。分别采用Chao 1指数和Shannon指数评估微生物物种丰富度和群落多样性。由表1可知,堆B细菌Chao 1指数和Shannon指数随发酵进行呈显著上升趋势(P<0.05),表明细菌可在其中稳定富集,其中8～24 h为主要富集期,24 h后因温度升高,富集趋于平缓。其真菌的Chao 1指数和Shannon指数随发酵推进呈显著下降趋势(P<0.05),说明高温堆积有效筛选了不耐热真菌,促进了耐热细菌的富集,这与王欢等[13]提出的细菌在白酒风味形成及酿造发酵中发挥重要作用的结论相契合。堆A细菌Chao 1指数和Shannon指数在发酵过程中均无显著差异(P>0.05),说明该形状难以有效改变细菌群落结构或实现环境微生物的富集;真菌Chao 1指数先降后升,最终低于起始水平,Shannon指数呈波动上升,表明该堆形使真菌微生物群落多样性下降、丰富度有所升高,但未达到筛选真菌的目的。堆C细菌Chao 1和Shannon指数呈先上升后回落的趋势,发酵结束时与起始阶段无显著差异(P>0.05),说明该形状未能持续促进细菌富集;其真菌多样性显著下降(P<0.05),虽达到高温筛选的目的,但具体群落结构差异仍需进一步解析。
表1 不同堆积形状酒醅发酵过程中Chao 1、Shannon多样性指数分析
Table 1 Analysis of Chao 1 and Shannon diversity indices in Jiupei during fermentation under different stacking shapes
α多样性指数样本发酵时间/h0816243240细菌Chao1指数堆A134.60±25.51aA142.76±39.72aB157.99±32.38aA144.81±37.56aA143.85±35.18aA113.45±37.34aA堆B119.36±22.69bcA107.08±16.9cB128.60±23.56abcAB149.42±21.96aA143.75±26.47abA152.75±7.98aA堆C103.15±10.51bA211.09±30.67aA109.40±21.71bB116.35±28.97bA99.48±14.23bA133.79±44.69bAShannon指数堆A 2.46±0.66aA 2.30±0.27aB 2.11±0.46aA 2.33±0.69aA 2.34±0.71aA 1.67±0.47aB堆B2.51±0.15bcA2.37±0.24cB2.33±0.32cA2.78±0.26abA2.63±0.28abcA2.90±0.15aA堆C1.93±0.1bA2.88±0.16aA1.81±0.63bA1.62±0.36bB1.59±0.18bB1.88±0.68bB真菌Chao1指数堆A18.15±3.59aA 10±2bA 6±1cA 8.78±0.69bcA10.83±0.76bA 11.33±2.52bA堆B16.67±4.75aA12.47±3.14bA7.58±2.2cA7.33±2.16cA8.00±1.55cB11.10±3.44bcA堆C16.33±5.58aA15.14±8.06abA9.05±5.07abcA6.50±2.18bcA 5.67±1.53cB7.17±3.25abcAShannon指数堆A 0.63±0.07bAB0.38±0.14cB 0.60±0.15bA 0.38±0.01cB 0.71±0.08bA 1.20±0.02aA堆B0.72±0.06aA0.70±0.05aA0.62±0.17aA0.64±0.12aA0.61±0.11aA0.49±0.39aB堆C0.55±0.12aB0.61±0.04aA0.44±0.18aA0.41±0.23aAB0.51±0.2aA0.35±0.3aB
注:a、b、c代表同一堆积形状不同发酵时间间存在显著差异(P<0.05);A、B代表相同时间酒醅在不同堆积形状间存在显著差异(P<0.05)。
2.3.2 不同堆积形状酒醅细菌微生物群落结构分析
不同堆积形状酒醅细菌群落组成如图5所示,所有样品共检出18个优势细菌,其中芽孢杆菌属(Bacillus)和unclassified_f_Enterobacteriaceae在全部样品中的平均含量均大于1%,为主要优势细菌属。不同堆积形状样品间细菌群落差异显著。堆A共检测出161个属,其中优势菌属13个,主要优势细菌属为芽孢杆菌属、unclassified_f__Enterobacteriaceae和魏斯氏菌属(Weissella);堆B检测到的菌属数量增至237个,优势菌属11个,主要优势细菌属为芽孢杆菌属、泛菌属(Pantoea)、魏斯氏菌属、unclassified_f__Enterobacteriaceae和克雷伯菌属(Klebsiella);堆C检出174细菌属,优势细菌属9个,主要优势细菌属为芽孢杆菌属、unclassified_f__Enterobacteriaceae和短杆菌属(Brevibacterium)。以上结果表明,堆积形状对细菌群落多样性影响显著,过于扁平或陡峭均不利于从环境中有效富集微生物。进一步分析发现,堆B中芽孢杆菌属的相对丰度(54.37%～63.70%)低于堆A(64.93%～85.23%)和堆C(61.86%～91.42%),而其他菌属的整体丰度则普遍高于后两者。推测由于堆积形状的改变引起酒醅温度、氧气等理化因子变化,进而影响细菌生长与分布。芽孢杆菌属作为嗜热性细菌,其具有耐高温、活性强等特点,在有氧和无氧条件下都能存活[14],因此在堆A和堆C中占据更高比例,但也导致其他菌属丰度下降,削弱了群落结构的稳定性。另外,在发酵过程中,泛菌属的相对丰度呈逐渐下降趋势,初始相对丰度在堆A、堆B和堆C中分别为18.53%、26.50%、4.41%,至发酵结束时分别降至0.73%、8.72%、1.68%。魏斯氏菌属在堆A和堆B中基本保持不变,但在堆C中则呈逐渐上升趋势,至发酵结束时分别为4.44%、1.77% 和1.45%。而unclassified_f__Enterobacteriaceae在各组中的变化趋势各不相同,堆A中呈逐渐下降趋势,尤其在24～40 h下降明显,至堆积结束时相对丰度为1.64%;堆B则保持稳定,相对丰度在1.89%～5.76%;堆C呈逐渐升高趋势,其中在发酵初期(0～8 h)变化明显,由1.64%上升至8.75%,至发酵结束时为4.19%。该结果进一步说明,堆积形状的改变会导致菌属组成及其动态演替的显著差异。
图5 基于属水平不同堆积形状酒醅样品细菌群落结构
Fig.5 Bacterial community structure of Jiupei samples at the genus level under different stacking shapes
注:others表示相对丰度<1%的其他菌属(下同)。
2.3.3 不同堆积形状酒醅真菌微生物群落结构分析
不同堆积形状酒醅真菌群落组成如图6所示。所有样品共检出4个优势真菌,其中曲霉属(Aspergillus)和维克汉姆酵母菌属(Wickerhamomyces)为主要优势真菌属。分析发现,不同堆积形状样品间真菌群落差异小于细菌。堆A中共检测22个真菌属,优势菌属4个;堆B共检测26个真菌属,优势菌属3个;而堆C共检测28个真菌属,优势细菌属2个,各组主要优势真菌属均为曲霉属和维克汉姆酵母菌属。进一步分析发现,曲霉属相对丰度整体呈下降趋势,其在堆B中虽在初期(0～24 h)丰度较低,但至发酵结束时达34.72%,高于其他组。曲霉属作为好氧菌,在发酵过程中起关键酶源作用,但耐温能力较弱[15]。因此其在高温阶段生长受限,而堆C因升温更高,对其抑制更为明显。相比之下,维克汉姆酵母菌属的相对丰度随着发酵进行显著上升,至堆积结束时以堆C最高,为84.62%,堆B次之,为60.85%,堆A最低为31.59%。研究发现,该菌属对环境适应性强,耐酸、耐低水分活度与高渗透压,并具备优良的生香产酯能力,对白酒风味形成至关重要[16-17]。发酵中后期温度与酸度上升可能更有利于其生长,尤其在堆C的微环境中。此外,嗜热真菌属(Thermomyces)仅在堆A和堆B的40 h样品中成为优势菌,其在堆A中的相对丰度(42.99%)显著高于堆B(3.96%),而堆C中未检出。以上结果表明,堆积形状对真菌群落的种类与相对丰度均具有一定调控作用,但其影响程度小于细菌。
图6 基于属水平不同堆积形状酒醅样品真菌群落结构
Fig.6 Fungal community structure of Jiupei samples at the genus level under different stacking shapes
2.4 不同堆积形状原酒感官及风味物质的分析
2.4.1 不同堆积形状原酒感官评价
发酵结束后,将不同堆积形状对应的酒醅分别蒸馏所得原酒进行感官评价,结果显示各组之间存在显著差异(P<0.05)(表2)。堆B原酒的综合评分最高,芝麻香、焦香与粮香协调,异杂味较少,酒体柔和度、饱满度与典型性表现良好,表明该堆积形状有利于主体香气成分的生成,并有效抑制了不良风味物质的积累。堆A评分最低,虽然芝麻香与焦香较为突出,但粮香不足,甜香与酸味等异杂味明显,口感与典型性较差。堆C原酒香气整体偏淡,芝麻香与焦香表现一般,且带有甜香与酸味等异杂味,口感协调性与典型性亦不理想。综上,堆B所形成的堆积形状最有利于芝麻香型白酒的风味形成,能够在维持香气强度的同时保障酒体纯净度,体现出更优的微生物代谢平衡能力。
表2 不同堆积形状下原酒感官品评
Table 2 Sensory evaluation of raw Baijiu under different stacking geometries
样品评语感官评分/分堆A酒体的芝麻香和焦香虽然较为突出,粮香不足,原酒甜香、酸味等异常味也较为明显,同时酒体的口感、持久性和典型性等表现较差。73.79±7.15b堆B具有芝麻香型白酒典型特征,芝麻香、焦香和梁香突出,异杂味较少,酒体的柔和度、饱满度、持久度典型性较高。82.92±5.51a堆C酒体香气较淡,具有芝麻香和焦香,但甜香、苦味和酸味等异常味明显,同时酒体的口感、持久性和典型性等表现较低。75.08±6.77b
注:a,b代表不同堆积形状间存在显著差异(P<0.05)。
2.4.2 不同堆积形状原酒风味物质组成
不同堆积形状下所得原酒中共检出42种风味物质,包括酯类18种、醇类10种、酸类8种、醛类5种及酮类1种。基于风味物质含量的聚类热图分析表明(图7),堆B和堆C原酒样品组成相似,而与堆A差距较大。进一步分析发现,酯类物质作为含量最丰富的香味物质,在堆B原酒中占比最高。乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯和丁酸乙酯四大酯类在各组中均有检出,但其比例和含量有所不同。乙酸乙酯、乳酸乙酯与丁酸乙酯在堆B中含量最高,己酸乙酯则以堆A最高,堆B次之,堆C最低。酯类物质通常赋予酒体花果香气,一般来说,酯类含量越高,酒质越好[18],因此这可能是堆B柔和度、饱满度花果香突出的原因。醇类物质总含量在各组间相近,主要成分为丁醇、丙醇、异戊醇、甲醇和异丁醇。堆A和堆C中甲醇、异丁醇、正戊醇和异戊醇含量较高,这些物质过量时会带来刺鼻酒精味、辛辣感与苦味[10],可能是其感官评价中异杂味明显的原因;堆B中醇类组成更为均衡,有助于与酯类协同提升酒体协调性。酸类物质中,堆A和堆C的乙酸与丁酸含量较高,两者分别呈现醋味与刺激酸臭味,导致酒体酸味突出。醛酮类物质在各组间差异较小,以乙醛、乙缩醛、糠醛和2-戊酮为主。堆B中这些物质含量略低于其他2组,规避了过量醛类可能带来的辛辣、焦苦与粗糙感,而堆A和堆C中醛类与较高含量的酸、醇共同加剧了酒体不协调。综上,不同堆积形状原酒的风味物质组成与感官评价结果一致,堆B通过优质酯类的高比例积累、醇类的均衡分布以及酸与醛酮类的协调配比,形成了香气典型、异杂味少的风格特征;堆A和堆C则因关键风味物质失衡,导致感官品质下降。该结果进一步表明,堆积形状可通过调控风味物质代谢直接影响基酒品质。
图7 不同堆积形状原酒样品风味物质聚类热图
Fig.7 Cluster heatmap of flavor compounds in base liquor samples under different stacking shapes
2.5 不同堆积形状酒醅潜在调控机制分析
2.5.1 环境因子对微生物群落关联分析
本研究通过Mantel检验分析了不同堆积形状下酒醅微生物群落结构与环境因子之间的相关性。结果表明,堆积形状显著影响高温堆积过程中微生物群落结构,细菌和真菌群落对环境因子的响应呈现明显差异。在细菌群落方面(图8-A),温度是影响其结构的主要环境因子,而水分、酸度、淀粉和还原糖的影响相对较弱,且表现出形状特异性。在堆A中,细菌群落仅与温度呈显著正相关(r=0.20,P<0.05),表明该形状下较快的热量散失使温度成为驱动细菌演替的关键因子。堆B中细菌群落与温度的相关性进一步增强(r=0.21,P<0.01),说明该形状有利于维持稳定的生物热效应,塑造特定的细菌微环境。而在堆C中,细菌群落与环境因子无显著相关性,可能是由于其内部剧烈的高温、高酸变化破坏了微生物与环境因子的稳定关联。在真菌群落方面(图8-B),其与细菌存在较大差异。堆A中真菌群落不仅与温度显著相关(r=0.37,P<0.05),更与淀粉(r=0.56,P<0.05)和还原糖(r=0.64,P<0.05)呈现强正相关,表明淀粉和还原糖与温度共同成为驱动真菌群落的关键因素。堆B中真菌群落与各环境因子均无显著相关性,提示其群落构建可能主要受微生物互作等生物因素的影响。而在堆C中,尽管内部环境变化剧烈,真菌群落仍与温度(r=0.37,P<0.05)、淀粉(r=0.22,P<0.05)及还原糖(r=0.64,P<0.05)保持了显著的正相关关系,从而说明其比细菌具有更强的环境耐受性。综上所述,堆积形状通过调节微环境差异性地影响微生物群落构建。温度是细菌群落的主要驱动因子,而真菌群落同时受到温度和还原糖、淀粉的共同调控。
A-细菌;B-真菌
图8 环境因子对微生物群落结构演替的Mantel test分析
Fig.8 Mantel test of the effects of environmental factors on microbial community succession
2.5.2 酒醅微生物与风味物质相关性分析
在明确环境因子对微生物群落结构影响的基础之上,本研究进一步通过 Spearman 相关性分析探究了酒醅中微生物与风味物质之间的关联(图9)。结果显示,细菌群落在酯类、醇类、醛类等风味物质的形成发挥关键作用,并与芝麻香型白酒典型风味的形成密切相关。酯类是白酒风味的重要组成,本研究发现芽孢杆菌属、短杆菌属、枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)等10个细菌属与3-苯丙酸乙酯、丁酸己酯、乙烯二乙酯呈显著正相关,而魏斯氏菌属、泛菌属等7个菌属则与上述酯类呈负相关。戊酸乙酯与6个菌属相关,其中短杆菌属、克雷伯菌属、枝芽孢杆菌属呈正相关,芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、巨大球菌属(Macrococcus)呈负相关,表明这些菌群可能通过特定代谢途径参与酯类合成调控。苯甲醛、苯乙醛、苯酚、糠醇和愈创木酚等是芝麻香型白酒的关键特征物质,其含量直接影响香气典型性和风格。相关性分析显示,克雷伯菌属与糠醇、苯甲醛、苯乙醛呈显著正相关。结合微生物群落结构与风味物质含量的组间差异可知,在风味表现更优的堆B中,其相对丰度显著高于堆A和堆C,且该组中上述物质含量更高。尽管克雷伯菌属在某些领域不被视为有益菌,但现有研究发现了其在发酵体系中的积极作用,它不仅具备催化有机酸和高级醇合成的代谢潜力[19],还能转化柠檬烯等前体物质生成萜烯类香味物质[20]。因此,认为在芝麻香型白酒堆积的特定微环境中,克雷伯菌属是促进特征风味形成的关键功能菌之一,但其在白酒酿造中的具体代谢机制则有待进一步研究。短杆菌属与愈创木酚、糠醇、苯酚呈正相关,堆B中其相对丰度显著高于其他2组。目前,已有研究显示,其在酿造过程中可代谢产生某些酸类物质[21],但与愈创木酚等物质的关联机制仍需验证。短杆菌属与苯酚和苯乙醛呈正相关,在堆B中丰度较高,提示其可能参与这2种风味物质的形成。魏斯氏菌属与苯甲醛呈正相关,同样在堆B中表现突出。芽孢杆菌属与苯乙醛呈负相关,堆B中相对丰度低于其他组,但该组苯乙醛含量更高。芽孢杆菌属作为芝麻香型白酒酿造的典型功能菌,已有研究表明其具备强大的淀粉与蛋白质水解能力,可代谢产生吡嗪类、挥发性酸、芳香族化合物、酚类等多种风味物质,同时通过分泌抗菌脂肽调控群落结构,是影响白酒风味的核心功能菌[14,22]。例如,地衣芽孢杆菌已被报道与2,3-丁二醇、异丁酸、愈创木酚等物质呈显著正相关[23],印证了其在风味代谢中的积极作用。但与苯乙醛的负相关机制尚未见报道,有待进一步探究。真菌群落中,维克汉姆酵母菌属与苯乙醛、糠醇、戊酸乙酯均呈显著正相关。尽管其在堆C中最终丰度最高,但堆B中呈持续上升趋势,且上述物质含量最高,说明其代谢活性是造成风味差异的重要原因。维克汉姆酵母菌属作为重要的生香酵母属,具有高耐酸性、产酯能力强的特点,现有研究已证实其可分泌糖苷酶,高产乙酸乙酯、乳酸乙酯等物质,为酒体赋予花果香[16-17],这也进一步支持了本研究中其与戊酸乙酯等酯类物质的显著正相关,印证了其在风味合成中的核心作用。嗜热子囊菌属(Thermoascus)与愈创木酚呈负相关。而该菌属在堆A相对丰度最高,但堆B的愈创木酚含量最低。有研究显示该菌属能够产生热稳定的水解酶,降解原料中的淀粉或纤维素,是白酒酿造过程中不可或缺的重要菌属[24],但与愈创木酚的负相关机制尚未报道,有待进一步验证。综上所述,芽孢杆菌属、短杆菌属、魏斯氏菌属、泛菌属、克雷伯菌属、维克汉姆酵母菌属和嗜热子囊菌属等12个细菌属和2个真菌属,可能是导致不同堆积形状酒醅风味差异的核心功能微生物。
A-细菌;B-真菌
图9 微生物群落与风味物质互作网络图
Fig.9 Correlation network between microbial community and flavor compounds
2.5.3 潜在调控机制分析
堆积形状对芝麻香型白酒风味品质的潜在机制研究结果表明,堆积形状作为初始驱动因素,通过改变堆体比表面积调控酒醅微环境,进而筛选并塑造特定的微生物群落结构,最终通过微生物代谢活动决定特征风味物质的合成与积累。3种堆积形状通过比表面积的差异直接决定了酒醅微环境特性。堆A堆体扁平,比表面积大,水热散失快、微环境波动剧烈,表现为升温后劲不足、水分显著下降;堆C堆体陡峭,比表面积小,内部积热严重,形成高温、高酸的胁迫环境。而堆B在表面积与体积间达到平衡,构建了升温平稳、水分保持良好、酸度变化合理的微环境。微环境差异对微生物群落产生了定向筛选作用。细菌群落结构受堆积形状影响显著大于真菌。堆B的稳定微环境促使细菌群落与温度呈极显著相关,推动了克雷伯菌属、魏斯氏菌属、短杆菌属和Brachybacterium等多功能菌的协同富集。相比之下,堆A和堆C的不稳定或极端微环境导致芽孢杆菌属占比过高,显著抑制了其他功能微生物的富集,降低了群落多样性和稳定性。真菌群落方面,堆B中真菌群落与环境因子无显著相关性,表明其群落构建更依赖于微生物种间互作等生物因素,结构趋于稳定。微生物群落结构的差异直接决定了风味物质的代谢特征。相关性分析表明,堆B中富集的功能菌群与芝麻香型白酒的关键特征风味物质呈显著正相关。其中,克雷伯菌属与糠醇、苯乙醛呈正相关;短杆菌属与愈创木酚、糠醇呈正相关;维克汉姆酵母菌属与苯乙醛、戊酸乙酯呈正相关。这些关联性解释了堆B酒醅中糠醇、苯甲醛、苯乙醛、愈创木酚等核心风味物质含量最高的原因。相比之下,堆A因微生物群落失衡,导致风味物质总量最低,己酸乙酯、乙酸、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚等重要香气成分不足;堆C虽然总含量最高,但酯类代谢失衡,醇类与酚类积累不足。综上,堆积形状通过“物理形态-微环境-微生物群落”这一核心路径,自上而下地调控微生物群落结构与功能,直接决定了酒醅风味物质的组成与含量,对酒体香气特征的形成具有决定性作用。
3 结论
本研究通过多组学联合分析,系统探究了不同堆积形状对芝麻香型白酒堆积工艺及原酒品质的影响,结果表明,堆积形状通过改变堆体比表面积,显著影响热量传递、水分及酸度等的变化,进而影响微生物群落结构及其代谢功能。其中,缓坡形(B)综合表现最佳,堆体升温平稳、水分变化合理、酸度适中,微生物多样性高且结构稳定,促进了克雷伯菌属、魏斯氏菌属、短杆菌属、Brachybacterium等功能菌富集,同时维持了芽孢杆菌属和维克汉姆酵母菌属等核心微生物的合理比例。该微生物群落结构有效地推动了酒醅中糠醇、苯乙醛、愈创木酚等芝麻香型特征风味物质的合成与积累,使得原酒在感官上呈现出芝麻香、焦香与粮香协调、异杂味少的典型风格,感官评分最高。相比之下,扁平形(A)由于比表面积过大,水热散失过快,微环境波动剧烈,导致微生物多样性低且芽孢杆菌属相对丰度过高,抑制了其他功能菌的生长,造成己酸乙酯、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚等风味物质积累不足,原酒粮香较弱且酸味突出;陡峭形(C)则因比表面积过小,内部积热严重、酸度过高,同样导致微生物群落结构失衡,芽孢杆菌属相对丰度过高,抑制了其他的微生物代谢,造成酯类合成失衡及醇类、酚类物质积累不足,原酒香气淡薄且异杂味明显。Mantel检验结果显示,堆积形状通过调节微环境差异性地影响微生物群落构建。温度是细菌群落的主要驱动因子,而真菌群落同时受到温度和还原糖、淀粉的共同调控。相关性分析进一步明确了芽孢杆菌属、克雷伯菌属、魏斯氏菌属、短杆菌属、维克汉姆酵母菌属等12个细菌属和2个真菌属与关键风味物质的形成密切相关。本研究系统揭示了堆积形状通过“物理形态-微环境-微生物代谢”这一路径影响白酒品质的内在机制,确认缓坡形为芝麻香型白酒较优的堆积工艺形状,为该传统工艺的精准调控与优化提供了重要的理论依据和数据支撑。
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