L-氨基酸脱氨酶(L-amino acid deaminase,L-AAD,EC 1.4.3.2)是一类以黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)为辅因子的氧化还原酶,能催化L-氨基酸脱氨生成相应的α-酮酸。该类酶已在多种微生物中被发现,包括变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)及普罗威登斯菌属(Providencia)等。L-AAD通常为膜结合型蛋白,其N端跨膜螺旋可将酶锚定于细胞膜表面,具有较宽的底物特异性,可对多种脂肪族或芳香族L-氨基酸进行立体选择性氧化脱氨反应生成α-酮酸,对L-苯丙氨酸(L-Phe)表现出较高的催化活性。该酶不仅在氨基酸代谢中发挥关键作用,也在手性氨基酸及其衍生物的生物合成中具有重要应用价值。L-AAD可用于外消旋混合物中L-氨基酸的选择性脱氨,从而获得高纯度的D-氨基酸,同时生成多种具有生理和工业意义的α-酮酸,如α-酮戊二酸、α-酮异戊酸酯、α-酮-γ-甲基硫代丁酸和苯丙酮酸(phenylpyruvic acid,PPA)等。这些α-酮酸可作为进一步生产手性醇和手性氨基酸的前体[1-4]。
PPA作为一种多功能α-酮酸,在农业、食品和医药工业中均有重要应用[5-6]。L-Phe到PPA的生物催化转化可通过多种酶实现,包括氨基转移酶(aminotransferase,AAT,EC 2.6.1.X)、L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase,L-AAO,EC 1.4.3.3)和L-AAD。与AAT相比,L-AAD不依赖外源氨基受体;与L-AAO相比,L-AAD反应过程中不生成过氧化氢,因此具有更高的反应安全性与底物兼容性[7]。此外,PPA可被乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)进一步还原生成苯基乳酸(phenyllactic acid,PLA)。PLA作为一种天然防腐剂,具有良好的生物相容性与广谱抗菌活性,被认为是替代化学防腐剂的理想候选物;其中D-PLA还可作为手性砌块用于药物合成,同时在饲料、化妆品及高分子材料领域展现出广泛应用潜力[8-9]。由于L-Phe来源丰富、价格低廉且在水相中稳定,因此以L-Phe为底物经PPA中间体生产PLA是一种绿色高效的生物合成路径[10]。然而,天然L-AAD通常催化效率有限,难以满足工业化生产需求,这限制了其在生物制造中的进一步应用。
蛋白质工程方法是改造酶分子结构,提升酶催化性能的有效途径,已在多种工业酶中得到成功应用。在L-AAD催化活性改造方面,研究者也已开展了一系列探索。HOSSAIN等[11]采用易错聚合酶链式反应(error-prone polymerase chain reaction,error-prone PCR)与基因重排(DNA shuffling)相结合的定向进化策略,对L-AAD pm1进行改造,获得含34个氨基酸残基突变的突变酶pm1338 g4,该突变酶的反应速率与底物亲和力显著提升,催化谷氨酸钠合成α-酮戊二酸的最高产物质量浓度达89.11 g/L。相比传统依赖随机突变的定向进化方法,理性设计可显著缩小突变筛选范围,进而提升酶分子的改造效率。石选平等[12]通过半理性设计获得L-AAD三突变体V437I/S93C/E417A,使酶的催化活力较野生型提升35%,其重组菌在5-l发酵罐补料转化中以88%的转化率合成44.13 g/L PPA。SONG等[1]对L-AAD膜结合疏水插入序列(INS,第325～375位氨基酸残基)进行重新设计,筛选获得突变体D340 N催化L-亮氨酸合成α-酮异己酸的产量达81.21 g/L,生物转化率为89.06%,较野生型提高17.57%。LIU等[13]通过构象动力学工程改造,获得L-AAD突变体E145A/E341A,对产物抑制作用降低3.84倍、催化效率提升1.35倍,最终在5 L生物反应器中实现81.2 g/L PPA合成,转化率达99.6%。理性设计不仅能有效提高酶的催化活性,还能显著改善其热稳定性、专一性、对底物的耐受性、可溶性等,在增强酶的工业适用性方面展现出显著优势[14-17]。
来源于奇异变形菌(Proteus mirabilis)的L-AAD(PmLAAD)具有较宽的底物谱,对芳香族氨基酸(如L-Phe、L-酪氨酸和L-色氨酸)表现出较高的催化效率。该酶属于典型的膜结合型脱氨酶,在细胞膜上通过FAD辅酶参与电子传递,其催化机制与非膜结合L-AAD存在显著差异[18]。目前,针对膜结合型L-AAD的结构与分子改造研究仍相对较少。为提高PmLAAD对L-Phe的催化活性,并实现与D-LDH的偶联催化,从而高效地将L-Phe经PPA转化为D-PLA,本研究基于理性设计策略对PmLAAD进行了分子改造研究,不仅为膜结合型L-AAD的活性提升与应用提供了新思路,也有助于深入揭示其独特的催化分子机制。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
胰蛋白胨、酵母粉,安诺伦(北京)生物科技有限公司;限制性内切酶、电泳Marker,宝生物工程(大连)有限公司;2×Phanta Flash Master Mix,Vazyme公司;DNA胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒、PCR产物清洁试剂盒、α-乳糖、SDS-PAGE试剂盒,生工生物科技有限公司;L-Phe、D-PLA、色谱纯乙腈,百灵威科技有限公司;实验中所用到的菌种和质粒均由本实验室保藏;如无其他说明,本实验中所用到的其他化学试剂均为市售分析纯。
1.2 仪器与设备
LC-20A高效液相色谱仪,岛津仪器(苏州)有限公司;HICO21小型高速离心机,生工生物工程(上海)股份有限公司;Avanti J-E高速冷冻离心机,贝克曼库尔特(美国)股份有限公司;SW-CJ-2D超净工作台,浙江苏净净化设备有限公司;TC1000-G PCR仪、SPX-100B-Z恒温培养箱,大龙兴创实验仪器(北京)股份公司;51119500C全波长酶标仪,上海闪谱生物科技有限公司;EPS640电泳仪,上海复日科技有限公司;QYC-200恒温摇床,上海新苗医疗器械制造有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌种培养
LB液体培养基(g/L):胰蛋白胨10.0,酵母粉5.0,氯化钠10.0用纯水溶解定容,121 ℃灭菌20 min,冷却后加入终质量浓度为50 μg/mL的卡那霉素。LB固体培养基为上述液体培养基中加入琼脂粉15 g/L灭菌制得。
含野生型和突变型pmlaad的各大肠杆菌(Escherichia coli)工程菌接种至含50 mL LB液体培养基的250 mL摇瓶中,置于37 ℃,200 r/min恒温振荡培养箱中培养12 h,获得的培养物接种至新鲜的LB液体培养基中(接种量2%),按上述条件培养至OD600值达到约0.8后,加入终质量浓度为8.0 g/L的乳糖,于28 ℃,150 r/min条件下继续培养12 h。
1.3.2 分子模拟与对接
PmLAAD(GenBank:AVK70349.1)的三维结构通过SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)进行同源建模。所得分子结构模型分别导入CASTpFold(https://cfold.bme.uic.edu/castpfold/compute)和ConSurf(https://consurf.tau.ac.il/consurf_index.php),分析底物活性口袋及序列保守位点。随后,利用AutoDock与L-Phe进行分子对接。
1.3.3 定点突变
以pET28a-pmlaad重组质粒为模板,进行PCR扩增,反应体系:2×Phanta Flash Master Mix 25 μL;上游和下游引物各1 μL;质粒1 μL;加去离子水至总体积为50 μL。PCR反应程序为:95 ℃预变性3 min;循环30次(95 ℃变性15 s;55 ℃,退火15 s;72 ℃复性35 s);72 ℃延伸5 min。PCR所用引物如表1所示。PCR产物用QuickCutTM NdeⅠ酶切,去除模版质粒后,转化E.coli(DE3)宿主细胞并用卡那霉素抗性平板进行筛选(LB固体培养基,37 ℃培养12 h)。平板阳性菌落接种至LB液体培养基培养(37 ℃,200 r/min,12 h),菌种用甘油管保藏并送生工生物工程(上海)股份有限公司测序确认。
表1 PmLAAD定点突变引物
Table 1 Site-directed mutagenesis primers of PmLAAD
编号引物名称序列(5′-3′)编号引物名称序列(5′-3′)P1-FVal277-FACCCTGAACNNKTACCTGAGCCAGCAGCGP4-FPro315-FGCGGTTGCGNNKCGCATCTTCACTTCCTCTAP1-RVal277-RGCTCAGGTANNKGTTCAGGGTCGGGATATCP4-RPro315-RGAAGATGCGNNKCGCAACCGCGTAGGTACP2-FLeu279-FAACGTTTACNNKAGCCAGCAGCGTGTTAGCP5-FLeu344-FGAGCTGCCGNNKGAATTCTCCATCGGTGAAGP2-RLeu279-RCTGCTGGCTNNKGTAAACGTTCAGGGTCGGP5-RLeu344-RGGAGAATTCNNKCGGCAGCTCACCACCACP3-FHis302-FAACGGCATCNNKTTCCGTGAACAGGCGGATP6-FVal411-FTGGGGTGCGNNKGTGAGCCCGACCTTCGAP3-RHis302-RTTCACGGAANNKGATGCCGTTCGGCAGGTP6-RVal411-RCGGGCTCACNNKCGCACCCCAACGTTCAAC
注:下划线标注部分为突变碱基。
1.3.4 突变文库筛选
上述测序确定的含pmlaad野生型和突变型基因的E.coli菌种库(简称突变文库)采用1.3.1节所述方法进行培养,离心(8 000 r/min,4 ℃,5 min)培养物,并用生理盐水洗涤2次。称取获得的细胞0.2 g(干重)置于50 mL摇瓶中,加入10.0 mL底物溶液(0.10 g/L L-Phe溶于100 mmol/L,pH 7.0的磷酸缓冲液),充分悬浮,在30 ℃,200 r/min条件下振荡反应1 h,取样,12 000 r/min室温离心5 min。取25 μL离心上清液置于洁净的10 mL试管中,加入100 μL 2,4-二硝基苯肼溶液混匀,静置30 min后加入5 mL 0.8 mol/L NaOH溶液,混匀,在520 nm波长下测定吸光度(以未加细胞的底物溶液为空白对照)。用1.0～5.0 g/L PPA溶液(100 mmol/L,pH 7.0的磷酸缓冲液为溶剂)代替上述反应液,DNPH显色并测定OD520,以PPA浓度为横坐标,OD520为纵坐标绘制标准曲线。按标准曲线方程计算上述各菌种催化反应液中PPA的质量浓度,并按公式(1)计算比酶活。酶活力单位定义:在30 ℃,pH 7.0条件下,以每分钟催化生成1 μmol PPA所需的干细胞质量定义为1 U。
比酶活
(1)
式中:c,反应液中生成PPA的质量浓度,g/L。
1.3.5 动力学参数求取
以含野生型或突变型pmlaad基因的重组菌(E.coli/pET28a-pmlaad)细胞作为催化剂,按照1.3.3节方法,测定不同L-Phe浓度(0.1～0.6 mmol/L)下反应生成PPA的时序变化,经线性拟合得到直线方程的斜率,即为催化反应速率(v);随后,以L-Phe浓度为横坐标、v为纵坐标绘制散点图,采用Origin软件中的米氏方程进行非线性拟合,计算米氏常数(Km)和最大反应速率(vmax)。
1.3.6 细胞偶联催化合成D-PLA
将PmLAAD重组菌细胞与含E.coli/pET28a-ldh(M4)细胞混合,控制总干重分别为0.04、0.08、0.16、0.20、0.24 g,加入10 g/L L-Phe和葡萄糖,用10 mL,100 mmol/L磷酸缓冲液悬浮,置于50 mL锥形瓶中,在200 r/min转速的恒温振荡培养箱中反应30 min。分别对催化反应pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0),温度(20、25、30、35、40、45、50 ℃),E.coli/pET28a-laad和E.coli/pET28a-ldh(M4)细胞质量比(0.33、0.5、0.67、1.0、1.5、2.0、3.0),细胞总干重(0.04、0.08、0.16、0.20、0.24 g),葡萄糖与PPA摩尔浓度之比(0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5)进行优化。取100 mL圆底烧瓶,按优化结果加入15 g/L L-Phe、葡萄糖和混合细胞,控制最优条件进行50 mL体系催化反应,每20 min取样,HPLC检测D-PLA浓度。
1.3.7 液相检测方法
PLA的浓度采用Hypersil ODS C18分析柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,大连依利特分析仪器有限公司)检测,流动相为V(乙腈)∶V(0.1%甲酸水溶液)=1∶4,流速1.0 mL/min,进样量20 μL,检测波长210 nm,柱温40 ℃。
D-PLA的光学纯度采用Chiralcel OJ-RH分析柱(4.6 mm×150 mm,5 μm,株式会社大赛璐)检测,流动相为V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(三氟乙酸)∶V(水)=50∶50∶1.5∶898.5,流速0.6 mL/min,进样量20 μL,检测波长210 nm,柱温40 ℃。
2 结果与分析
2.1 突变位点选取
前期实验筛选得到一种L-AAD(EC 1.4.3.2),该酶能够催化L-Phe脱氨生成PPA。其基因pmlaad(GenBank:AVK70349.1)来源于Proteus mirabilis。以PDB数据库中的L-AAD晶体结构(PDB ID:5FJM)为模板,通过SWISS-MODEL进行同源建模,获得了PmLAAD的三维结构模型;随后将模型导入CASTpFold,预测并定位其底物结合口袋。
如图1-a所示,PmLAAD具有一个由86个氨基酸残基构成的超大底物口袋。底物口袋的残基不仅决定了酶的底物选择性,还直接影响底物结合、过渡态稳定及催化效率,因此对酶活力至关重要[19]。在酶分子中,高度保守的位点通常直接参与底物结合、催化或维持结构稳定,其突变往往导致活性丧失或结构不稳定;低保守位点对酶功能影响较小;而中等保守位点多位于“功能调控/通道/构象开关”区域,通常不会破坏整体折叠,却可能对活力产生可调性[20-21]。将PmLAAD三维结构导入ConSurf分析后,共获得24个中等保守度位点(评分4～7)。随后利用AutoDock对PmLAAD与Phe进行分子对接,得到对接模型(图1-b),并筛选出与底物距离小于12 Å的氨基酸残基(图1-c)。最终确定Val277、Leu279、His302、Pro315、Leu344和Val411作为突变位点。
a-底物结合口袋;b-分子模拟与对接;c-突变位点
图1 PmLAAD分子结构分析
Fig.1 Molecular structure analysis of PmLAAD
2.2 突变文库构建与筛选
以pET28a-pmlaad重组质粒为模板,通过PCR技术对上述选定位点依次进行定点饱和突变。将所得突变质粒转化至E.coli细胞,构建突变重组菌株。经测序验证,成功获得全部114个突变体,由此建立单点饱和突变文库。对含野生型或突变型pmlaad基因的重组菌进行培养及诱导产酶后,离心收集菌体,采用DNPH显色法测定酶活力并计算细胞比酶活力。结果如图2所示,含L279Y、L279 W、P315D、P315C、P315Y、P315 N、P315Q、P315 W突变酶的工程菌,其比酶活均高于野生酶重组菌,其中含L279 W突变酶菌株比酶活最高,达到27.65 U/g,是野生酶重组菌的2.14倍。
a-V277饱和突变;b-L279饱和突变;c-H302饱和突变;d-P315饱和突变;e-L344饱和突变;f-V411饱和突变
图2 PmLAAD单突变酶的筛选
Fig.2 Screening of PmLAAD single mutants
研究表明,酶分子底物口袋中与底物在空间上邻近的氨基酸残基,通常对催化活性具有更直接且显著的影响。这些残基可通过与底物形成氢键、疏水作用或静电相互作用,精确调控底物的结合构象与定向,进而影响催化反应的过渡态稳定性及反应能垒[19]。本研究中,有益突变集中于L279和P315两个位点,其他位点的突变均引起酶催化活性下降,这2个氨基酸残基的α碳原子与PHE的氨基间距较近,分别为5.5 Å 和4.5 Å(图1-c),对酶活力表现出更显著的影响,这与上述研究结论一致。
为了进一步探索不同位点突变之间的协同效应并组合有益突变,以pET28a-pmlaad(L279W)和pET28a-pmlaad(L279Y)为模板,采用引物P4-F和P4-R对第315位氨基酸残基进行了定点饱和突变。经测序验证后获得多种双突变体,结果如图3所示。与野生酶重组菌E.coli/pET28a-pmlaad相比,L279W/P315V、L279W/P315W、L279W/P315N、L279W/P315D、L279W/P315E、L279Y/P315L、L279Y/P315I、L279Y/P315Y、L279Y/P315W、L279Y/P315M、L279Y/P315Q、L279Y/P315D等均显示较高活力。其中,L279W/P315D、L279W/P315E和L279Y/P315Q重组菌株的比酶活进一步提高,分别达到34.27、30.67、27.94 U/g。279 W/P315D为最优突变酶,其重组菌比酶活为野生酶重组菌的2.66倍。与已报道的L-AAD改造结果相比[1,11-13],本研究在突变位点选取精准度和催化效率提升幅度2方面均具有明显优势,有利于进一步将L-AAD与D-LDH进行细胞偶联,构建了2步级联催化体系,实现了L-Phe 向D-PLA的高效转化。
a-PmLAAD(L279W)第315位氨基酸残基饱和突变;b-PmLAAD(L279Y)第315位氨基酸残基饱和突变
图3 PmLAAD双突变酶的筛选
Fig.3 Screening of double-mutant PmLAAD
值得注意的是,最优双突变体L279 W/P315D的比酶活为最优单突变体L279 W的1.24倍,表明两处位点突变之间存在良好的正向协同效应。这种协同效应可能源于突变导致底物口袋局部构象的重排,改善了底物结合与过渡态稳定,实现活性中心微环境的优化,获得超越单点突变累积效应的协同提升从而增强了催化效率[22-23]。
2.3 SDS-PAGE与动力学参数
将各PmLAAD重组菌细胞用磷酸缓冲液(20 mmol/L,pH 8.0)重悬,调整细胞质量浓度至50 g/L(以湿重计);在冰浴条件下进行超声破碎(200 W,10 min),离心(10 000×g,4 ℃,20 min)去除细胞碎片。所得上清液在变性条件下,通过SDS-PAGE(12%丙烯酰胺分离胶)检测目标蛋白的表达情况。结果如图4所示,除L279W/P315N、L279Y/P315W、L279Y/P315M外,其余突变均未显著改变酶的可溶性表达量。
M-蛋白Marker。
a-1为原始酶重组菌,2～7分别L279Y、L279W、P315D、P315C、P315Y和P315N突变酶重组菌;b-8～14分别为P315Q、P315W、L279W/P315D、L279W/P315W、L279W/P315V、L279W/P315N和L279W/P315E突变酶重组菌;c-15～21分别为L279Y/P315L、L279Y/P315I、L279Y/P315Y、L279Y/P315W、L279Y/P315M、L279Y/P315Q和L279Y/P315D突变酶重组菌。
图4 PmLAAD重组菌破碎上清液SDS-PAGE电泳图
Fig.4 SDS-PAGE electropherogram of crude lysate supernatant from PmLAAD recombinant bacteria
由于L-AAD为膜结合酶,失去细胞结构后,几乎丧失催化活性[6],因此,分别测定了E.coli/pET28a-pmlaad细胞和E.coli/pET28a-pmlaad(L279W/P315D)的表观动力学参数(图5),其Km和vmax分别为3 881.4 mmol/L,16.84 mmol/(L·min)和2 446.96 mmol/L,28.53 mmol/(L·min)。L279W/P315D突变使酶对底物的亲和力增加,催化反应速率增加。
a-E.coli/pET28a-pmlaad;b-E.coli/pET28a-pmlaad(L279W/P315D)
图5 PmLAAD重组菌细胞的表观动力学参数
Fig.5 Apparent kinetic parameters of PmLAAD recombinant bacterial cells
2.4 催化活性增强机制解析
为探究L279W/P315D双突变提高PmLAAD催化活性的分子机制,本研究以产黏变形菌(Proteus myxofaciens)来源的LAAD晶体结构(PDB ID:5FJM)为模板进行同源建模,构建了野生型PmLAAD及双突变体PmLAAD(L279W/P315D)的三维结构模型。通过将底物L-Phe分别与2种模型进行分子对接分析(图6-a、图6-b)。野生型酶中第279位亮氨酸(Leu,L)的异丁基侧链主要通过疏水力与底物L-Phe的苯环相互作用。
a-PmLAAD分子对接分析;b-PmLAAD底物口袋分析;c-PmLAAD(L279W/P315D)分子对接分析;d-PmLAAD(L279W/P315D)底物口袋分析
图6 野生型及突变型PmLAAD分子结构解析
Fig.6 Structural analysis of wild and mutant PmLAAD
突变为色氨酸(Trp,W)后,虽然疏水性略微降低,但其侧链吲哚环与底物的苯环可形成π-π堆叠(图6-b)。已有研究指出,芳香族氨基酸与底物间的π-π相互作用可显著提高酶-底物复合物的结合能与稳定性[24]。因此,L279W突变引入新的π-π堆叠作用,强化了底物在活性口袋中的稳定结合,使酶的底物亲和力增加,这与实验中Km值下降的结果相符。第315位的脯氨酸(Pro,P)因侧链与主链形成吡咯烷环,通常限制局部主链的旋转自由度,导致该区域构象刚性较强[25]。当其被天冬氨酸(Asp,D)替换后,柔性的—CH2COOH侧链一方面释放了原有的构象约束,另一方面其羧基带负电荷,可能通过静电作用或氢键重排参与活性中心微环境的调节,使催化残基与底物反应基团实现最优对接[26]。因此,P315D突变可能增强局部构象灵活性,提高酶在底物结合后的构象适应性,从而促进催化速率。
野生型PmLAAD的活性口袋内壁与L-Phe的空间距离较近,导致底物分子呈未完全伸展状态(图6-c),这种拥挤构象可能阻碍了底物与辅酶FAD之间的电子传递效率,而FAD作为LAAD催化反应中的关键电子受体,其与底物的氧化还原偶联效率直接决定催化速率。双突变后,底物口袋的空间位阻显著降低,底物分子远离内壁并呈现更舒展的取向(图6-d),为电子传递、底物结合及产物分离提供了更通畅的通道,最终表现为酶催化活性的提升。
综上,L279W/P315D双突变引入π-π相互作用,增强了活性中心构象灵活性,改善了活性中心微环境,降低了底物通道的空间位阻,并强化了电子传递,因此能显著提高PmLAAD的催化活性。
2.5 D-PLA的催化合成
将E.coli/pET28a-pmlaad(L279W/P315D)与E.coli/pET28a-ldh(M4)细胞混合,并向反应体系中加入底物溶液(L-Phe和葡萄糖溶于100 mmol/L缓冲液),构建催化L-Phe经PPA合成D-PLA的级联反应体系。为提高反应效率,对影响催化性能的关键因素进行了系统优化,包括反应体系的pH、温度、2种细胞催化剂的干重比、总细胞用量以及葡萄糖与L-Phe 的质量比(葡萄糖/L-Phe)。其中,葡萄糖作为辅助底物,通过大肠杆菌的代谢体系提供氢供体以实现NADH(D-LDH辅酶)的循环再生。
优化结果表明,最适反应条件为:pH 6.5、反应温度45 ℃、总细胞用量20 g/L(以干重计),其中2种菌体的干重比为3∶2(即E.coli/pET28a-pmlaad(L279W/P315D)与E.coli/pET28a-ldh(M4)细胞分别为12和8 g/L),葡萄糖/L-Phe为1∶1(图7-a～图7-e)。在该最优条件下,以15 g/L L-Phe为底物,在50 mL 反应体系中进行催化反应。如图7-f所示,经过120 min反应基本终止,产物D-PLA终质量浓度达13.09 g/L,ee>99%,转化率87.26%。对比相关研究,ZHANG等[27]曾将L-Phe氧化酶基因(lpox)与L-LDH基因(ldh)在大肠杆菌中共表达,并以获得的共表达菌为催化剂,催化12 g/L L-Phe反应48 h 获得L-PLA 1.64 g/L。本研究通过理性设计改造PmLAAD提升其对L-Phe的催化活性,使其在级联催化合成D-PLA方面表现出显著的催化效率,充分展示了该策略在生物合成领域的潜力与优势。
a-pH;b-温度;c-E.coli/pET28a-pmlaad与E.coli/pET28a-ldh细胞干重比;d-总细胞用量;e-葡萄糖与L-葡萄糖质量比;f-反应时间进程
图7 级联生物催化合成D-PLA
Fig.7 Catalytic synthesis of D-PLA via cascade reaction
3 结论与讨论
本研究基于蛋白质工程的理性设计策略,对D-PLA 合成过程中的关键酶——L-ADD(PmLAAD)进行了同源建模与分子对接分析,解析了其结构特征及序列同源性。据此筛选关键位点并实施定点饱和突变,获得突变酶PmLAAD(L279W/P315D),其重组菌的比酶活力提升至野生型酶重组菌的2.66倍。通过对分子对接及表观动力学参数的综合分析,揭示了突变导致PmLAAD对L-Phe催化活性提高的分子机制。研究结果表明,该突变在活性中心引入了新的π-π相互作用,增强了活性位点的构象柔性,优化了其微环境特征,降低了底物通道的空间位阻,并促进了电子的高效传递,从而整体提升了酶的催化效率。最后,将E.coli/pET28a-pmlaad(L279 W/P315D)与D-LDH重组菌E.coli/pET28a-ldh进行细胞偶联,构建了以两步催化为核心的级联反应体系,实现了L-Phe 经PPA转化为D-PLA的高效生物催化。经反应条件优化,在15.00 g/L底物质量浓度下获得D-PLA 13.09 g/L。
[1] SONG Y,WANG R,ZHANG Z X,et al.Semi-rational engineering membrane binding domain of L-amino acid deaminase from Proteus vulgaris for enhanced α-ketoisocaproate[J].Frontiers in Microbiology,2022,13:1025845.
[2] CHANG J Z,ZHANG Y X,LI Z W,et al.Biosynthesis of α-keto acids and resolution of chiral amino acids by L-amino acid deaminases from Proteus mirabilis[J].Protein Expression and Purification,2024,221:106518.
[3] LIU K,YU H R,SUN G Y,et al.Semi-rational design of L-amino acid deaminase for production of pyruvate and d-alanine by Escherichia coli whole-cell biocatalyst[J].Amino Acids,2021,53(9):1361-1371.
[4] MOTTA P,MOLLA G,POLLEGIONI L,et al.Structure-function relationships in L-amino acid deaminase,a flavoprotein belonging to a novel class of biotechnologically relevant enzymes[J].Journal of Biological Chemistry,2016,291(20):10457-10475.
[5] XIONG T Z,GAO Q Y,ZHANG J T,et al.Engineering Escherichia coli with a symbiotic plasmid for the production of phenylpyruvic acid[J].RSC Advances,2024,14(36):26580-26584.
[6] XIONG T Z,BAI Y J,FAN T P,et al.Biosynthesis of phenylpyruvic acid from L-phenylalanine using chromosomally engineered Escherichia coli[J].Biotechnology and Applied Biochemistry,2022,69(5):1909-1916.
[7] HOU Y,HOSSAIN G S,LI J H,et al.Combination of phenylpyruvic acid(PPA)pathway engineering and molecular engineering of L-amino acid deaminase improves PPA production with an Escherichia coli whole-cell biocatalyst[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2016,100(5):2183-2191.
[8] LI T L,QIN Z,WANG D,et al.Coenzyme self-sufficiency system-recent advances in microbial production of high-value chemical phenyllactic acid[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2022,39(1):36.
[9] RAJANIKAR R V,NATARAJ B H,NAITHANI H,et al.Phenyllactic acid:A green compound for food biopreservation[J].Food Control,2021,128:108184.[10] ZHENG Z J,XIA M J,FANG X C,et al.Enhanced biosynthesis of chiral phenyllactic acid from L-phenylalanine through a new whole-cell biocatalyst[J].Bioprocess and Biosystems Engineering,2018,41(8):1205-1212.
[11] HOSSAIN G S,SHIN H D,LI J H,et al.Integrating error-prone PCR and DNA shuffling as an effective molecular evolution strategy for the production of α-ketoglutaric acid by L-amino acid deaminase[J].RSC Advances,2016,6(52):46149-46158.
[12] 石选平,王玥,乔郅钠,等.蛋白质工程改造L-氨基酸脱氨酶高效合成苯丙酮酸[J].生物工程学报,2025,41(9):3521-3536.SHI X P,WANG Y,QIAO Z N,et al.Protein engineering for the modification of a L-amino acid deaminase for efficient synthesis of phenylpyruvic acid[J].Chinese Journal of Biotechnology,2025,41(9):3521-3536.
[13] LIU J,LIU J M,YANG B,et al.Production of phenylpyruvic acid by engineered L-amino acid deaminase from Proteus mirabilis[J].Biotechnology Letters,2022,44(5):635-642.
[14] WEI B,KANG Y L,ZHAO Y X,et al.Rational design of spontaneous self-cyclization enzymes in vivo and in vitro with improved thermal tolerance and activity[J].ACS Catalysis,2024,14(7):5469-5480.
[15] LI Z L,PEI S X,CHEN Z Y,et al.Machine learning-assisted amidase-catalytic enantioselectivity prediction and rational design of variants for improving enantioselectivity[J].Nature Communications,2024,15:8778.
[16] WANG Z Q,LI C H,LIU J,et al.Random mutagenesis and semi-rational design enhance the tolerance of Metabacillus litoralis C44 α-L-rhamnosidase[J].International Journal of Biological Macromolecules,2025,309:142971.
[17] HU M,SONG J X,MIAO S T,et al.Rational design of soluble expressed human aldehyde dehydrogenase 2 with high stability and activity in pepsin and trypsin[J].International Journal of Biological Macromolecules,2024,265:131091.
[18] FAN A W,WANG Z Y,QU H J,et al.Semi-rational design of Proteus mirabilis l-amino acid deaminase for expanding its substrate specificity in α-keto acid synthesis from L-amino acids[J].Catalysts,2022,12(2):175.
[19] ZHOU J H,HUANG M L.Navigating the landscape of enzyme design:From molecular simulations to machine learning[J].Chemical Society Reviews,2024,53(16):8202-8239.
[20] LUTZ S.Beyond directed evolution:Semi-rational protein engineering and design[J].Current Opinion in Biotechnology,2010,21(6):734-743.
[21] ZABALA A O,CACHO R A,TANG Y.Protein engineering towards natural product synthesis and diversification[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,2012,39(2):227-241.
[22] ZHU Y M,CHEN P,DONG Q Z,et al.Protein engineering of transaminase facilitating enzyme cascade reaction for the biosynthesis of azasugars[J].iScience,2024,27(3):109034.
[23] HOSSACK E J,HARDY F J,GREEN A P.Building enzymes through design and evolution[J].ACS Catalysis,2023,13(19):12436-12444.
[24] SUN B Y,SUI H L,LIU Z W,et al.Structure-guided engineering of a flavin-containing monooxygenase for the efficient production of indirubin[J].Bioresources and Bioprocessing,2022,9(1):70.
[25] MACARTHUR M W,THORNTON J M.Influence of proline residues on protein conformation[J].Journal of Molecular Biology,1991,218(2):397-412.
[26] NESTL B M,HAUER B.Engineering of flexible loops in enzymes[J].ACS Catalysis,2014,4(9):3201-3211.
[27] ZHANG J Z,LI X.Novel strategy for phenyllactic acid biosynthesis from phenylalanine by whole cell recombinant Escherichia coli coexpressing L-phenylalanine oxidase and L-lactate dehydrogenase[J].Biotechnology Letters,2018,40(1):165-171.