肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)是乳酸菌中的明串珠菌属的重要菌种,在发酵中可产生胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)[1]。EPS是由多种微生物分泌到细胞外的高分子质量碳水化合物[2]。肠膜明串珠菌具有诸多特性:其发酵工艺简易,发酵产物风味优良,因此常用于腌制泡菜和酿制果酒[3];EPS的热稳定性、增稠性、乳化性良好,还具有抗氧化[4]、抗毒[5]等功效,在食品与健康领域展现出广阔的应用前景。
微生物产生的多糖能够与肠道菌群相互作用,促进肠道有益菌的定植和生长以维持人体正常生理作用[6]。大多数多糖难以被消化液降解,在进入结肠后可被拟杆菌、双歧杆菌等核心菌属降解利用,作为其生长与代谢的能量来源[7]。多糖被肠道菌群发酵后可产出短链脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs),SCFAs为结肠细胞提供能量来源,通过降低结肠内pH防止病原菌生长,并在维持黏膜屏障功能中发挥作用[8]。此外,多糖经微生物代谢后产生的代谢物和信号分子能通过激活G蛋白偶联受体、调节黏液分泌或调控肠道免疫细胞,增强宿主免疫屏障、降低炎症反应,表现出潜在的免疫调节作用[9]。
肠膜明串珠菌具有显著的菌株多样性,不同菌株能合成在分子质量、单糖组成及糖苷键连接方式上具有明显差异的EPS[10]。尽管已有研究报道了肠膜明串珠菌EPS的多种微生物学活性,但EPS的结构与肠道菌群调节之间的构效关系缺乏系统研究。为填补这一空白,本研究拟通过分离纯化、结构鉴定的方法找出2株EPS在结构上差异最大的肠膜明串珠菌。并通过动物实验,建立抗生素相关性腹泻模型,研究不同结构的EPS对炎症反应的调节作用和对抗生素剥夺后菌群恢复的影响。以多糖作为唯一碳源进行体外发酵,探究不同结构及剂量的EPS对肠道菌群的体外调节差异。
1 材料与方法
1.1 菌株与材料
本研究使用的菌株均从乳品、发酵食品和蔬菜中分离得到,并贮存在微生物菌种库中。其中肠膜明串珠菌CCFM1516的原始编号为DQHXN_Q38M5,于2025年9月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC 66902。胰蛋白胨、酵母提取物,英国OXOID公司;DEAE-52、葡聚糖凝胶G-100、层析柱,索莱宝公司;qPCR引物,上海生工;微孔滤膜,比克曼公司;qPCR酶、RNA提取试剂盒,诺唯赞公司;2×Taq Master Mix,北京康为公司。
1.2 仪器与设备
Frac-920自动部分收集器,上海琪特分析仪器有限公司;iS50傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)仪,美国尼高力仪器公司;BenchTop Pro冷冻干燥机,美国Virtis公司;DAWN HELEOS-Ⅱ高效凝胶排阻色谱系统,美国怀雅特技术公司;C1000 Touch Thermal Cycler PCR仪,美国Bio-Rad公司;JXFSTPRP-24高通量组织研磨器,宁波新芝生物公司;ICS-5000+高压离子交换色谱仪,美国赛默飞世尔科技公司;IMS-20制冰机,沃拓莱公司;ME204/02电子分析天平,上海Mettler Toledo公司。
1.3 实验方法
1.3.1 EPS的分离纯化和结构鉴定
将-80 ℃保存的菌株解冻后,经三线划线法接种于MRS固体平板,30 ℃培养48 h。挑取单个菌落接种至5 mL MRS液体培养基,30 ℃培养8 h。取100 μL菌悬液传代至新培养基中,连续传代3次后备用[11]。将活化菌株按2%接种于含50 g/L蔗糖的MRS-S液体培养基中,25 ℃、60 r/min振荡培养48 h。发酵液经离心去除菌体,上清液依次经无水乙醇沉淀、三氯乙酸去蛋白、再次乙醇沉淀及透析处理,最终冻干得到粗多糖[12]。粗多糖经0.45 μm滤膜处理后上样至DEAE-52阴离子交换柱,以0、0.1、0.3 mol/L NaCl溶液梯度洗脱(1 mL/min),收集组分并用苯酚-硫酸法测定吸光度,绘制洗脱曲线,合并主峰组分并冻干。随后采用Sephadex G-100凝胶柱(超纯水,0.2 mL/min)进一步纯化,检测并收集主峰组分,冻干得到纯多糖[13]。
多糖经超纯水溶解、离心及0.22 μm 过滤后,用高效凝胶排阻色谱确定分子质量范围(进样100 μL,流速0.4 mL/min,柱温45 ℃)。取干燥样品与KBr混合压片,在400～4 000 cm-1范围内进行FT-IR检测。另取样品经4 mol/L三氟乙酸于121 ℃水解3 h,甲醇多次吹干除酸后重溶过滤,采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测(CarboPac MPA20柱,0.5 mL/min,30 ℃)分析单糖组成[14]。
1.3.2 动物实验方案
本研究所有动物实验操作均经实验动物伦理委员会批准,伦理编号为JN.No20250215b0400407[018]。40只雄性无特定病原体级Balb/C小鼠[8周龄,(20±2)g]由维通利华提供。如表1所示,将雄鼠随机分为5组,每组8只,分别为健康组、对照组、模型组和2个多糖组。实验开始前适应环境7 d,实验时间为18 d。实验第1～3天,健康组灌胃0.2 mL PBS,其余组灌胃盐酸林可霉素(3 g/kg,1天2次);第4天,健康组和对照组灌胃PBS,模型组和多糖组灌胃人源粪便菌悬液[16名健康成年志愿者各取0.5 g粪便,用生理盐水稀释10倍,混匀后以2%接种到肠道微生物(gut microbiota medium,GMM)培养基后扩培2代];第5～11天,健康组、对照组和模型组灌胃PBS,多糖组灌胃EPS(300 mg/kg)[15];第12～18天,所有组不进行灌胃,自然恢复1周。实验期间每4 d测1次体质量和摄食量,第4、11、18天收集粪便,并对所有小鼠进行腹泻状态评估:没有腹泻,精神状态正常记0分;肛周大便疏松无黏性,一般精神状态记1分;肛门黏连、食欲减退、体重减轻、精神状态低落记2分。处死时收集小鼠的结肠、盲肠,迅速放入液氮中淬灭,收集的粪便进行肠道菌群分析[16]。
表1 实验分组及给药方案
Table 1 Experimental grouping and dosing scheme
组别造模期人源菌定植期治疗期自然恢复期健康PBSPBSPBS—对照盐酸林可霉素PBSPBS—模型盐酸林可霉素菌悬液PBS—Q37M5盐酸林可霉素菌悬液Q37M5 EPS—Q38M5盐酸林可霉素菌悬液Q38M5 EPS—
注:“—”表示不灌胃。
1.3.3 盲肠指数、结肠组织中特定基因表达量的测定
取出小鼠盲肠,去除血渍及脂肪后,使用电子天平称量盲肠质量,盲肠指数的计算如公式(1)所示[17]:
盲肠指数
(1)
取小鼠结肠组织25 mg,按FastPure® Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2上的方法提取RNA。RNA反转录按照反转录试剂盒说明书进行,以cDNA为模板,使用iTaqTM universal SYBR® Green supermix和特异性引物(表2)进行扩增反应,通过荧光信号积累进行定量分析。数据采用2-ΔΔCt方法处理[18]。
表2 引物及双链DNA序列
Table 2 Primers and double-stranded DNA sequences
基因名称引物序列(5′→3′)β-actin正向:CCTAAGAGGAGGATGGTCGC反向:CTCAACACCTCAACCCCCTCIL-6正向:CACTTCACAAGTCGGAGGCT反向:TCTGACAGTGCATCATCGCTIL-10正向:TGAGGTCAATCTGCCCAAGT反向:GGATCATTTCCGATAAGGCTTIL-1β正向:CACTACAGGCTCCGAGATGAACAAC反向:TGTCGTTGCTTGGTTCTCCTTGTACClaudin-1正向:CGCTCTTCTGTCTACTGAACTTCGG反向:GTGGTTTGTGAGTGTGAGGGTCTGZO-1正向:AACCCGAAACTGATGCTGTGGATAG反向:CGCCCTTGGAATGTATGTGGAGAGMucin-2正向:CGAGCACATCACCTACCACATCATC反向:TCCAGAATCCAGCCAGCCAGTCOccludin正向:TTGGCTACGGAGGTGGCTATGG反向:CCTTTGGCTGCTCTTGGGTCTG
1.3.4 肠道菌群分析
使用MP DNA Spin kit for Faces试剂盒提取粪便DNA。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性,使用NanoDrop检测DNA浓度和纯度。以提取的基因组DNA为模板,利用引物(341F:5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′;806R:5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)对细菌模板DNA进行16s rDNA的V3-V4区扩增。PCR产物通过2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果,纯化后使用Qubit dsDNA BR胶回收试剂盒进行回收。将PCR产物定量后进行混合,构建基因文库,并上机测序[16]。
1.3.5 生物信息学分析
下机得到的原始序列使用QIIME 2平台进行生物信息学分析。首先,使用DADA2插件对双端序列进行质量过滤、去噪、合并,并去除嵌合体,从而获得高质量的扩增子序列变体(amplicon sequence variant,ASVs)。随后,基于ASV表绘制稀疏曲线,以评估测序深度并确定后续分析的均匀化抽平深度。α多样性通过计算Shannon指数和Simpson指数进行评估,并使用Kruskal-Wallis检验比较组间差异。β多样性则基于Bray-Curtis距离矩阵,采用主坐标分析(principal coordinate analysis,PCoA)进行可视化。在属水平上,对第4天和第11天的菌群进行分类与功能谱的统计分析(statistical analysis of taxonomic and functional profiles,STAMP),采用Welch’s t-test进行统计检验,P值经错误发现率(false discovery rate,FDR)校正。菌属相对丰度与小鼠生理指标的相关性通过Spearman相关分析进行计算,并在chiplot网站中完成可视化[16]。
1.3.6 体外发酵实验设计
招募16名的健康成年志愿者,每人各取粪便样品1 g,按1∶7(g∶mL)与无菌PBS均质,涡旋混匀。2 000 r/min离心10 min,取上清液得到发酵接种物。GMM作为培养基,分别加入葡萄糖(阳性对照),Q37M5和Q38M5作为唯一碳源,每种碳源分为低中高(0.2、1、5 g/L)3个剂量组,共9组。每管接种0.5 mL上清液至4.5 mL培养基中,于厌氧条件下进行发酵。24 h后每组拿出3管立即冰浴终止反应,8 000 r/min离心15 min,取沉淀进行菌群测序[19]。
1.4 数据处理及统计分析
实验数据以“平均值±标准差”表示,使用GraphPad Prism软件进行单因素方差分析,P<0.05时视为差异具有统计学显著性。如果数据分布不符合正态分布,则采用Kruskal-Wallis检验进行统计学分析。以符号数目区分显著性等级,其中*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1。
2 结果与分析
2.1 EPS的基本结构鉴定
通过高效凝胶排阻色谱法对13株肠膜明串珠菌EPS的分子质量进行测定,如电子版增强出版附图1所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044818,下同),获得EPS的数均分子质量(number-average molecular weight,Mn)、重均分子质量(weight-average molecular weight,Mw)、峰值分子质量(peak molecular weight,Mp)(附表1)。通过FT-IR分析,发现EPS均在840 cm-1处附近产生特征吸收峰,表明有α-糖苷键的吸收(附图2)。通过与单糖标准品比对和计算(附图3),推断出13株EPS的单糖组成(附表2)。
图1 EPS的PCA图
Fig.1 PCA plot of EPS
A-腹泻评分;B-体重变化率;C-粪便含水率;D-盲肠指数;E-炎症因子的表达;F-紧密连接蛋白和黏蛋白的表达
图2 小鼠表型、结肠中炎症因子、紧密连接蛋白和黏蛋白的表达
Fig.2 Expression of mouse phenotypes,inflammatory factors in the colon,tight junction proteins,and mucins
注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1(下同)。
A-α多样性;B-β多样性;C-STAMP分析;D-Q37M5组特异性增殖的菌属;E-Q38M5组特异性增殖的菌属;F-多糖组相关性分析
图3 糖干预和粪便菌悬液对抗生素剥夺后菌群恢复的影响
Fig.3 Effects of polysaccharide intervention combined with fecal bacterial suspension on the restoration of gut microbiota after antibiotic depletion
2.2 结构差异最大的EPS的选择
将分子质量、单糖组成和糖苷键做降维分析,即将各个单糖的权重降为0.1,分子质量和糖苷键的权重为1,并进行主成分分析(principal components analysis,PCA)分析。其计算如公式(2)所示:
(2)
式中:D,2点之间的距离;X、Y,样本在第1、2主成分上的坐标。
将PCA图中的各点之间的距离进行计算,推断出DQHXN_Q37M5和DQHXN_Q38M5 EPS在结构上差异最大(图1)。
2.3 结构差异最大的2株EPS的结构特征对比分析
DQHXN_Q37M5 EPS的Mn为2.84×104 Da,Mw为5.87×104 Da,Mp为3.57×104 Da(附图1-L)。DQHXN_Q38M5 EPS的Mn为6.283×103 Da,Mw为1.337 8×104 Da,Mp为9.391×103 Da(附图1-A)。从整体趋势看,DQHXN_Q37M5 EPS的各项分子质量指标均明显高于DQHXN_Q38M5 EPS,说明其多糖链更长、聚合度更高[20]。2种EPS的多分散系数(polymer dispersity index,PDI)约大于2,表明2种多糖为天然杂多糖,分子质量分布较宽。
FT-IR被用于鉴定EPS的主要官能团(附图2-A和附图2-L)。2株多糖均显示出典型多糖结构特征。DQHXN_Q37M5 EPS的FT-IR谱图显示3 301 cm-1(—OH)[21]、2 917 cm-1(C—H)[22]、1 644 cm-1(C
O)[21]及1 000～1 200 cm-1(C—O—C、C—O—H)[23]等典型多糖吸收峰,并在1 010 cm-1与844 cm-1处出现吡喃型主链和α-糖苷键信号。DQHXN_Q38M5 EPS 在3 288、2 925、1 644 cm-1等处呈现相似官能团吸收,1 000～1 200 cm-1区域均呈现出多重吸收峰,同样表现出α-构型特征,未见明显差异。
通过与单糖标准品比对和计算(附图3-A),推断出DQHXN_Q37M5 EPS的单糖组成为氨基半乳糖、葡萄糖、木糖、葡萄糖醛酸,摩尔比为2.34∶2.61∶2∶1(附图3-M),其中葡萄糖、木糖和氨基半乳糖占比较高,可能形成相对规则的骨架结构。DQHXN_Q38M5 EPS的单糖组成为氨基半乳糖、氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸,摩尔比为1.56∶1∶1.09∶19.61∶3.04∶1∶1.14(附图3-B),葡萄糖占据绝对优势,其他糖类比例分散,提示该多糖可能以葡萄糖为主链,其余单糖作为分支或修饰,构成高度支链化的杂多糖结构。
2.4 不同多糖对小鼠表型、结肠中细胞因子的表达和结肠屏障通透性的影响
造模结束后,与健康组相比,其他组小鼠体质量显著下降,腹泻状态评分均达到最高,表示抗生素相关性腹泻小鼠模型成功建立(图2-A和图2-B)。恢复期后,模型组小鼠腹泻评分、粪便含水率和盲肠指数显著高于多糖组,体质量增长低于多糖组,且与Q37M5组相比,Q38M5组表现出更显著的恢复效果(图2-C和图2-D)。
对照组小鼠的IL-6显著高于健康组,IL-10、Occludin、Claudin-1、Mucin-2显著低于健康组,说明抗生素的灌胃引起了小鼠的炎症反应、肠道通透性增加和紧密连接蛋白表达异常(图2-E和图2-F)。与模型组相比,Q38M5组的IL-6显著降低,IL-10显著上升,Q37M5组虽有改善趋势,但无显著差异。同时多糖组Occludin、Claudin-1、Mucin-2表达均显著升高,且Q38M5组Occludin、Claudin-1的表达显著高于Q37M5组。
以上结果表明2种多糖均能改善抗生素引起的小鼠腹泻和肠道损伤,但Q38M5组的恢复效果显著优于Q37M5组。
2.5 不同多糖对小鼠肠道菌群的影响
在α多样性方面,灌胃人类粪便菌悬液后,模型组和多糖组的Shannon和Simpson指数显著高于对照组,说明肠道菌群多样性和均匀度均有所恢复(图3-A)。在灌胃EPS后,多糖组的Shannon和Simpson指数保持稳定,Simpson指数接近健康组水平,而模型组2项指标显著降低,显示菌群逐渐向低多样性、低均匀度方向发展。此外,Q38M5组的Shannon和Simpson指数显著高于Q37M5组。结果表明DQHXN_Q38M5 EPS更能有效维持肠道菌群的稳定性,缓解抗生素冲击后的菌群失衡。
基于Bray-Curtis距离的PCoA结果显示,主成分PC1与PC2分别解释了群落结构差异的53.1%和29.5%(图3-B)。在二维空间中,健康组、模型组与多糖组分别形成独立聚类,区分清晰,说明与模型组相比,2株多糖能重塑肠道微生物群结构,使其向区别于健康组的新的稳态方向调节。
在属水平上,对第4天(粪菌移植后)与第11天(多糖干预后)的菌群进行STAMP差异分析(图3-C),结果表明2种EPS对菌群具有靶向性调节作用。2种多糖均能增殖拟杆菌属(Bacteroides),抑制埃希-志贺菌属(Escherichia-Shigella)的生长。Q37M5组特异性增殖瘤胃梭菌属-5(Ruminiclostridium 5)、另枝菌属(Alistipes)、肠球菌属(Enterococcus)、艰难梭菌属(Clostridioides)(图3-D),Q38M5组特异性增殖毛螺菌梭菌属(Lachnoclostridium)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、副萨特氏菌属(Parasutterella)(图3-E),且被富集的菌属在灌胃结束后的自然恢复过程中逐渐回落,表明菌属的丰度变化主要受多糖驱动,具有一定的可逆性。这种干预后菌群随宿主稳态机制逐步恢复的现象,该现象进一步说明,多糖主要通过动态调节肠道菌群组成及其短期生态位重塑发挥作用。
多糖干预组属水平菌群相对丰度与小鼠生理指标的相关性分析结果显示:不同多糖组塑造的肠道菌群与生理指标之间的互作关系存在差异(图3-F)。比如,在Q38M5组中,Parasutterella与Occludin、IL-10、Mucin-2显著正相关,与粪便含水率显著负相关。在Q37M5组中,Enterococcus与粪便含水率显著负相关,与IL-10显著正相关。值得关注的是,Clostridioides与粪便含水率和IL-6显著正相关,而与Claudin-1显著负相关,提示该菌属的增殖可能与肠道屏障破坏及炎症水平升高密切相关,反映出其潜在的致病作用。
2.6 不同结构及剂量的EPS对肠道菌群的体外调节差异
在α多样性方面,同一剂量下,Q38M5组的Shannon和Simpson指数均高于Q37M5组,说明DQHXN_Q38M5 EPS干预在提升肠道微生物群落的丰富度与均匀度方面具有更显著的促进作用(图4-A)。随着剂量的增加,2个多糖组的Shannon和Simpson指数呈上升趋势,表现出明显的剂量依赖效应,表明其对优势菌群筛选和群落结构重塑的能力增强。
A-α多样性;B-β多样性;C-PLSDA;D-Q37M5组具有剂量依赖效应的菌属;E-Q38M5组具有剂量依赖效应的菌属
图4 不同结构及剂量的EPS的肠道菌群调节差异
Fig.4 Differences in gut microbiota regulation by EPS with different structures and dosages
在β多样性方面,基于bray_curtis_distance的PCoA表明各样本组内聚类良好,各组之间明显分离(图4-B)。G与Q37M5、Q38M5的F值以及Q37M5和Q38M5的F值分别为3.084 8、6.683 6和4.394 6。结果表明2种EPS均能显著重塑肠道菌群结构,其中Q38M5组的调节效应更为强烈,与G组的差异程度更大,而Q37M5组与Q38M5组的差异则提示其作用机制和菌群调节方向可能存在差异。
属水平上,通过偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLSDA)找出Q37M5组和Q38M5组中对物种群落差异贡献最大的5个菌属(图4-C)。对于Q37M5组,贡献排名前5的菌属为巨球形菌属(Megasphaera)、毛螺菌科UCG-004分支(Lachnospiraceae UCG-004)、Alistipes、霍尔德曼氏菌属(Holdemanella)、Enterococcus。对于Q38M5组,贡献排名前5的菌属为摩根氏菌属(Morganella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、Lachnoclostridium、Parasutterella、Parabacteroides。除了Lachnoclostridium,其余9个驱动菌属均存在显著的剂量依赖效应(图4-D和图4-E)。
值得注意的是,动物实验中Q37M5组中的Alistipes、Enterococcus,Q38M5组中的Parasutterella、Parabacteroides在多糖灌胃期间靶向增殖,在体外实验中亦得到了验证,这些菌属在EPS干预下显著富集,且其相对丰度随多糖作用时间的延长或浓度的增加而逐步上升。综上结果表明,EPS对这些关键菌属具有稳定且一致的调控作用,是多糖干预后宿主肠道菌群结构变化的关键响应菌,在多糖介导的肠道稳态调节过程中发挥核心作用。
3 结论
本研究系统比较了13株肠膜明串珠菌EPS的结构差异及其对肠道菌群的调节作用。首先筛选出结构差异最大的DQHXN_Q37M5和DQHXN_Q38M5 EPS。并发现抗生素相关性腹泻小鼠模型和体外发酵中,两者均能提升菌群多样性,有效改善肠道菌群结构,缓解腹泻症状,增强肠道屏障功能,且DQHXN_Q38M5 EPS的生理活性更佳。同时DQHXN_Q37M5 EPS能定向富集Alistipes、Enterococcus,DQHXN_Q38M5 EPS能定向富集Parabacteroides、Parasutterella,体现出结构及剂量依赖的菌群调节特性,为基于微生态靶向的功能性多糖开发提供了实验基础与理论支持。尽管本研究明确了EPS对特定菌属的定向富集作用,但EPS被特定菌种识别与利用所依赖的关键酶系仍待阐明,后续可结合宏基因组学、宏转录组学进行研究。
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