小米糠,又称小米麸,是小米加工过程中产生的副产品,富含纤维素、蛋白质、脂肪、矿物质等营养成分,其中,纤维素占比超小米糠总量的18%,是一种优质膳食纤维(dietary fiber,DF)来源[1]。然而,目前小米糠主要被用作动物饲料或被直接丢弃,利用率低,造成了资源浪费。
DF是指天然存在于食物中的可食用碳水化合物,其在人体小肠耐消化吸收,可在大肠被部分或全部微生物发酵利用[2]。DF根据溶解度差异,可被分为可溶性膳食纤维(soluble dietary fiber,SDF)、不可溶性膳食纤维(insoluble dietary fiber,IDF)两类,相比IDF,SDF的黏度高、持水力优异,在机体胃肠道内可与淀粉分子相互交织,能有效延缓淀粉消化进程,不仅可调控血糖水平、提升机体胰岛素敏感性,还具有降低胆固醇、预防糖尿病及肥胖症发生的重要生理功能[3]。但是,小米糠膳食纤维(millet bran dietary fiber,MBDF)中SDF含量较低(1.04 g/100 g),限制了其应用范围。
膳食纤维改性是有效优化其结构、改变IDF与SDF比例与拓展应用范围的关键手段,改性膳食纤维在降血脂、降血糖药物研发中具有良好的应用前景[4-6]。当前,MBDF改性方式主要包括物理改性、生物酶改性、化学改性及多技术复合改性:MBDF经超声、微波、高压均质等物理改性改性,可显著改变膳食纤维微观形貌,使其表面疏松多孔、相对分子质量降低,同时增强SDF含量[7-8];生物酶改性方式主要包括单一纤维素酶及双酶水解,改性后 MBDF 多呈现多孔网络结构,结晶度与吸附性能提升,SDF得率与含量显著增加[9];化学改性涉及羟丙基化、交联化、乙酰化、羧甲基化等单一[10]及复合改性方法[11],从化学组成、微观结构、理化性质等多维度调控 MBDF 性能。化学改性技术因涉及化学试剂的使用,存在不容忽视的安全隐患。相比之下,生物酶改性膳食纤维效果显著且环境条件温和[12],物理联合生物法对膳食纤维进行改性,会使膳食纤维的结构更加松散,表现出更强的持水力、膨胀力,且对α-淀粉酶的抑制作用显著提高[13-14],这间接证明物理联合生物法改性会提高膳食纤维的降血糖活性。
然而,目前关于通过热压结合生物酶法对MBDF进行改性,进一步提高其体外降血糖活性的研究鲜有报道。为最大限度地发挥和挖掘MBDF的降血糖活性,本实验分别采用双酶(纤维素酶,半纤维素酶)、热压处理以及热压结合双酶改性方法对MBDF进行改性,通过分析不同改性方式对MBDF的化学组成、理化性质及体外降血糖活性变化的影响,以期提高其降血糖活性,进而为实现小米加工副产物的高值化开发利用、延伸小米产业链提供理论支撑与实践参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
小米糠(市售,2025年新鲜小米脱粒产生);α-淀粉酶(1.0×105 U/g)、碱性蛋白酶(1.0×105 U/g)、风味蛋白酶(1.0×104 U/g)、纤维素酶(6.0×104 U/g)、半纤维素酶(3000 U/g)、糖化酶(1.0×104 U/g)、对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG,5 mmol/L)、α-葡萄糖苷酶(0.1 UN),上海源叶生物科技有限公司;高温α-淀粉酶(2.0×104 U/mL),如吉生物科技有限公司;无水葡萄糖、苯酚、可溶性淀粉分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;透析袋,北京瑞达恒辉科技发展有限公司。实验所用分离有机溶剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
JSM-7500F扫描电子显微镜,日本Tokyo公司;HHM4恒温水浴锅,常州金坛精达仪器制造有限公司;BGX恒温干燥箱,上海仪电科技有限公司;BPH-7200型pH计,天津市泰斯特仪器有限公司;FS-Ⅱ实验型旋风式粉碎磨,蚂蚁源科学仪器(北京)有限公司;UV-1800PC紫外分光光度计,上海美谱达仪器有限公司;马弗炉,邦西仪器科技有限公司;RVA快速黏度分析仪,波通瑞华科学仪器(北京)有限公司;YXQ-50S立式压力蒸汽灭菌锅,上海博迅实业有限公司;SHA-B双功能数显恒温振荡器,常州天瑞仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 小米糠膳食纤维提取
参照吴鸿亿等[14]的实验方法并稍作修改。准确称取过60目筛筛分的小米糠粉30 g,加入0.1 mol/L磷酸缓冲溶液(pH 7.4)600 mL,充分振荡摇匀,随后添加α-淀粉酶2 g,于90 ℃恒温水浴条件下搅拌2 h,反应结束后冷却至50 ℃。用0.10 mol/L盐酸将体系pH值调至8.0,再分别加入碱性蛋白酶0.2 g、风味蛋白酶0.2 g,继续恒温搅拌酶解3 h。之后再次用0.10 mol/L盐酸调节pH值至2.0,加入糖化酶0.5 g,充分振荡摇匀,置于60 ℃恒温水浴中持续搅拌反应2 h;随即转入沸水浴加热15 min灭酶,冷却至室温后滤纸抽滤,收集滤渣并置于50 ℃烘箱干燥至恒重,制得MBDF。
1.3.2 小米糠膳食纤维改性
1.3.2.1 小米糠膳食纤维酶法改性
称取20 g MBDF置于300 mL去离子水中,以0.1 mol/L盐酸调节体系pH值至4.5,随后加入纤维素酶与半纤维素酶,于50 ℃恒温水浴条件下搅拌反应2.5 h。反应结束后,将体系置入沸水浴加热15 min灭酶,冷却至室温后经滤纸抽滤,收集滤渣于40 ℃烘箱中干燥至恒重,制得酶法改性小米糠膳食纤维[11](enzyme modified millet bran dietary fiber,MBDF-E)。
1.3.2.2 小米糠膳食纤维热压改性
称取20 g MBDF分散于300 mL蒸馏水中,转移至高压灭菌锅内,于121 ℃条件下热压处理45 min。处理完成后,将样品取出并置于45 ℃烘箱干燥8 h,制备出热压改性小米糠膳食纤维[15](hot-pressingmodified millet bran dietary fiber,MBDF-H)。
1.3.2.3 小米糠膳食纤维的热压-双酶复合改性
在热压处理的基础上进行双酶改性[16-17]。将30 g热压处理过的MBDF置于450 mL蒸馏水中并且调节pH值至4.5,随后加入纤维素酶0.3 g、半纤维素酶0.5 g,于50 ℃恒温条件下搅拌反应3 h;反应结束后,立即将体系置沸水浴加热10 min灭酶,待冷却至室温后过滤,将收集滤渣置于45 ℃烘干,制得热压-双酶复合改性膳食纤维(hot-pressing and enzyme modified millet bran dietary fiber,MBDF-HE)。
1.3.3 化学成分测定
分别测定对照组(MBDF)、热压组(MBDF-H)、酶解组(MBDF-E)和复合组(MBDF-HE)的基本化学成分[18-19]。各指标测定均参照国标方法执行:GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》采用直接干燥法,GB 5009.6—2025《食品安全国家标准 食品中脂肪测定》采用索氏抽提法,GB 5009.5—2025《食品安全国家标准 食品中蛋白质测定》采用凯氏定氮法,GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》采用马弗炉法,GB 5009.88—2023《食品安全国家标准 食品中膳食纤维的测定》采用酶-重量法。
1.3.4 结构分析
1.3.4.1 表面微观结构分析
参照曹家玮等[18]的实验方法,采用扫描电子显微镜观察并分析对照组、热压组、酶解组和复合组的表面微观结构,测试参数为放大倍数5 000倍,额定电压10 kV,电镜标尺1 μm。
1.3.4.2 傅里叶红外光谱分析
参照田海龙[11]的实验方法,充分混合后压制成1～2 cm规格薄片,使用红外光谱仪,扫描范围4 000～500 cm-1、分辨率4 cm-1条件下完成样品扫描。
1.3.4.3 X-射线衍射
参照田海龙[11]实验方法,准确称取0.1 g样品,均匀铺于样品板凹槽内,覆以洁净玻璃板并适度压实,将制备好的样品台放入X射线衍射仪,启动扫描程序。
1.3.5 理化性质分析
1.3.5.1 持水力测定
参照曹家玮等[18]的方法,准确称取样品0.5 g置于15 mL离心管中,称量离心管与样品总质量,缓加10 mL 去离子水,充分搅拌均匀,室温静置12 h。随后以4 000 r/min速度离心25 min,弃去上清液,再次称量离心管与残余样品的总质量。持水力计算按公式(1):
持水力
(1)
式中:X1,纤维样品与离心管总质量,g;X2,离心后纤维样品与离心管总质量,g。
1.3.5.2 膨胀力测定
参照曹家玮等[18]的方法,准确称取0.25 g小米糠膳食纤维样品于10 mL量筒中,充分搅拌使其分散均匀,记录样品的初始体积;随后加入去离子水5 mL,再次搅拌振荡以彻底排出体系内的气泡,置于室温下水合18 h,测量膨胀后体积。按公式(2)计算膨胀力:
膨胀力
(2)
式中:Va,原样品体积,mL;Vb,膨胀样品体积,mL。
1.3.5.3 黏度测定
参照田海龙[11]的方法,将小米糠膳食纤维样品0.3 g分散于25 mL去离子水中,以1 000 r/min持续充分混合30 s,随后用RVA黏度计测定样品溶液的黏度,设置试验时间为15 min,转速为160 r/min。首先将试验温度以14 ℃/min提高到95 ℃,然后在95 ℃下维持4 min,再以14 ℃/min的速度将温度降至50 ℃,并在50 ℃下保温至试验结束。
1.3.6 体外降血糖活性分析
在体外降血糖活性测试之前,对照组、热压组、酶解组和复合组均使用80%(体积分数)乙醇洗涤,直到滤液不含糖,然后将残留物在45 ℃下干燥10 h,获得无糖MBDF。
1.3.6.1 抑制葡萄糖扩散能力测定
参照季佳琪等[13]的方法,将0.5 g无糖样品与15 mL 0.2 g/100 mL葡萄糖液充分混合均匀,随后将混合液转移至软化的透析袋中,封口后置于盛有200 mL蒸馏水的烧杯中,升温至37 ℃振荡1 h;透析过程中,每间隔10 min移取透析液2 mL至试管中,依次加入6%(质量分数)苯酚1 mL,缓慢滴加浓硫酸5 mL,混合均匀后静置30 min,随后在490 nm波长下进行比色测定,计算葡萄糖含量。为排除背景对检测结果干扰,实验设置不添加纤维样品体系为对照组。根据公式(3)计算葡萄糖阻滞系数:
葡萄糖阻滞系数
(3)
式中:C1,纤维样品的透析液中葡萄糖浓度,g/100 mL;C2,对照组透析液中葡萄糖浓度,g/100 mL;C3,空白组透析液中葡萄糖浓度,g/100 mL。
1.3.6.2 α-淀粉酶抑制能力测定
参照祖齐欣等[20]的方法,将1 g无糖样品、0.05 g α-淀粉酶与25 mL淀粉液(0.5 g/100 mL,pH 6.5),装入提前软化好的透析袋中,封口后置于盛有100 mL蒸馏水的烧杯中,于37 ℃振荡透析1 h,期间每隔10 min移取透析液2 mL,加入苯酚(质量分数6%)1 mL,缓加浓硫酸5 mL,静置反应30 min后,在490 nm处比色测定葡萄糖含量;实验设置不添加纤维样品与不添加酶的样品为对照组。根据公式(4)计算α-淀粉酶抑制能力:
淀粉水解抑制力
(4)
式中:Nc,对照组透析液中葡萄糖浓度,g/100 m;Ns,样品透析液中葡萄糖浓度,g/100 mL。
1.3.6.3 α-葡萄糖苷酶抑制能力
参照熊敏[21]的方法稍作修改,称取25 mg干燥样品,加入1 mL磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L,pH 6.8)和2 mL α-葡萄糖苷酶(0.1 UN)后混合均匀,并在37 ℃水浴中振荡反应15 min,然后加入50 μL在37 ℃预反应过的对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(5 mmol/L),轻轻混匀,在37 ℃下继续反应30 min,然后通过加入2 mL Na2CO3(0.1 mol/L)终止反应,于400 nm处波长测定其吸光度值。通过公式(5)计算α-葡萄糖苷酶的抑制能力:
α-葡萄糖苷酶的抑制力
(5)
式中:Ac,空白样品吸光度;As,样品吸光度;Ab,不含α-葡萄糖苷酶对照组吸光度。
1.4 数据处理
所有实验数据均经不少于3次平行测定获得,结果以“平均值±标准差”的形式呈现。运用Origin 2021软件进行数据可视化绘图,运用 SPSS 27.0 统计软件开展单因素方差分析,并进行组间差异比较及显著性差异检验。
2 结果与分析
2.1 不同改性方式对小米糠膳食纤维化学组成的影响
本实验分别测得对照组、热压组、酶解组和复合组膳食纤维的化学组成,结果如表1所示。
表1 改性前后小米糠膳食纤维的化学组成 单位:g/100 g
Table 1 Chemical composition of MBDF before and after modification
项目MBDFMBDF-EMBDF-HMBFD-HE水分2.45±0.07a2.26±0.05a3.04±0.08a2.86±0.07a脂肪4.49±0.37a3.97±0.72a0.84±0.10a2.63±0.44b蛋白质2.81±0.08a1.95±0.02a1.82±0.06a2.04±0.03a灰分5.20±0.11a2.91±1.61b4.30±0.64a2.89±0.22b总膳食纤维88.13±2.34a87.72±3.59a88.88±1.23a89.99±2.41a可溶性膳食纤维1.04±0.43e2.48±0.17d6.11±1.00c7.93±0.59b不溶性膳食纤维87.10±1.97a85.24±0.22a82.77±0.33a82.06±0.28a
注:同行不同小写字母代表显著性差异(P<0.05)。
由表1可知,3种改性方式均可提高MBDF的可溶性膳食纤维含量(P<0.05)。其中,酶解组SDF含量提高2倍,热压组提高6倍,复合改性组的提升幅度最为突出,提高7倍。酶解组中SDF含量提高的原因可能是纤维素酶将纤维素分解为小片段,使其更易溶解[11]。热压处理后,膳食纤维结构中的化学键断裂,分子质量降低,暴露出更多的亲水基团,结构多孔增加与水的接触,使得SDF的含量增加。将小米糠膳食纤维通过热压改性后,再用双酶进行水解,可以引起多糖链的降解,暴露了其中更多的亲水基团,如可溶性寡糖和游离羟基等,是引起SDF含量较高的主要原因[17]。此外,双酶改性、热压与双酶复合改性显著降低了MBDF中脂肪和灰分的含量。
2.2 不同改性方式对小米糠膳食纤维表面微观结构的影响
由图1中不同改性方式下小米糠膳食纤维表面微观结构可知,不同改性方式前后MBDF的表面结构变化显著。对照组表面的微观结构致密、无规则且相对平滑。与对照组相比,酶解组表面粗糙,呈现出复杂的凹凸状结构,推测原因是纤维素酶水解导致其多糖链中部分糖苷键发生断裂,显示出更为粗糙的表面微观结构[19];复合组显示出具有大量微孔的蜂窝和多孔状表面结构,可能是热压处理使得MBDF晶体结构遭到破坏,也可能是改性中大量蛋白质和脂肪流失所致[20]。
a-MBDF;b-MBDF-E;c-MBDF-HE
图1 电子显微镜扫描图
Fig.1 Electron microscope scans
2.3 不同改性方式对小米糠膳食纤维理化性质的影响
2.3.1 持水性分析
不同改性方式对MBDF持水性的影响如图2-a所示。双酶水解、热压以及热压与双酶复合处理都提高了MBDF的持水性,热压组持水性提高显著,推测原因是粒径减小、孔隙率增加促使其包裹水分,使小米糠膳食纤维易与水结合[21]。双酶水解和热压处理期间暴露了更多的亲水基团和水结合位点,是酶解组、复合组具有较高持水性的主要原因。此外,多孔表面结构、高比表面积和较低的结晶度也有助于MBDF的持水性[22]。
a-持水性;b-膨胀力;c-黏度
图2 不同改性方法对MBDF理化性质的影响
Fig.2 Effect of different modification methods on the physicochemical properties of MBDF
注:不同小写字母表示显著性差异(P<0.05)(下同)。
2.3.2 膨胀力分析
膳食纤维的膨胀力受亲水基团含量、粒径、糖链构象与表面结构等多因素影响[17]。由图2-b可知,酶解组膨胀性较低,可能是双酶水解导致纤维粒度减小,改性过程中部分亲水基团遭到破坏,致使分子间的化学键与氢键等作用力断裂或强度减弱,膳食纤维的空间结构遭到破坏,进而引起膨胀力下降[23];热压组的膨胀性显著提高,可能是由于多孔表面结构、高比表面积,使得MBDF更容易吸水膨胀;复合组的较高膨胀性的主要原因为热压处理结合双酶水解过程中,暴露出更多的亲水基团和水结合位点,SDF的含量显著提高。此外,复合改性后形成的多孔的表面结构,赋予膳食纤维更高的比表面积与更低的结晶度,这一结构特性可显著增强其水合能力,进而提高其膨胀力[7]。
2.3.3 黏度分析
分析图2-c可知,不同改性方式均能增加 MBDF黏度。其中,酶解组黏度略增长,可能由于双酶处理会使纤维素分子间氢键打开,纤维素表面出现凹痕并变得松散,其颗粒直径及其表面积增大,溶解度也发生变化,SDF在搅拌作用下易进入导致黏度增加[24]。热压组黏度显著提高,主要归因于其可溶性膳食纤维含量较高。复合组对MBDF的黏度影响位于双酶、热压改性方式之间,可能是由于酶水解增加了其表面积和SDF含量,但也降低了其粒度。
2.4 不同改性方式对小米糠膳食纤维体外降血糖活性的影响
2.4.1 葡萄糖扩散力分析
葡萄糖扩散抑制力是体外评价膳食纤维延缓葡萄糖在胃肠道内吸收速率的关键指标。葡萄糖在肠胃被延迟吸收,能降低机体血液中葡萄糖浓度,改善胰岛素分泌不足的症状,减缓糖尿病的发生[25]。该抑制能力越高,表明纤维样品对葡萄糖透析延迟作用越显著,对餐后血糖水平上升的抑制效果也越突出[26]。
不同改性方式对MBDF葡萄糖扩散抑制力的影响结果如图3-a所示。酶解组显示出了比对照组更高的抑制葡萄糖扩散性,可能是双酶水解后,其表面多孔且暴露出更多对葡萄糖有很强亲和力的官能团,如糖醛酸、醛和酚酸,可复合符合组的表面多碎片的结构,更易于吸附葡萄糖而延迟其扩散,提升了葡萄糖吸附性。因热压组相对较高的黏度与持水性,理论上具有更高的葡萄糖吸附性,更能抑制葡萄糖扩散;然而,实验显示热压组具有较低的抑制葡萄糖扩散力,可能由于热压处理使其结构更加紧密,从而降低其与葡萄糖的可及性。
a-葡萄糖扩散抑制力;b-α淀粉酶抑制力;c-α葡萄糖苷酶抑制力
图3 不同改性MBDF体外降血糖活性的影响
Fig.3 Effects of different modifications on the in vitro hypoglycemic activity of MBDF
2.4.2 α-淀粉酶抑制力分析
α-淀粉酶可特异性水解淀粉分子内部的α-1,4-糖苷键,进而生成糊精、低聚糖及单糖等产物。当α-淀粉酶活性受到抑制时,淀粉的水解进程会随之减缓,葡萄糖的生成量也相应减少,从而实现调控餐后血糖水平、降低糖尿病发病风险的作用[24]。膳食纤维作为一种重要的体外功能性食品基料,其对α-淀粉酶的抑制活性,是评价其抑制葡萄糖能力的核心指标[12]。
分析图3-b可知,经改性处理后的MBDF对α-淀粉酶的抑制活性显著优于未改性的MBDF。已有研究表明,诸如微观结构、表面积、黏度和持水力等因素可以影响DF的α-淀粉酶抑制力[27]。酶解组的蜂窝状结构以及高黏度使α-淀粉酶吸附在其表面,加大了抑制α-淀粉酶的作用,减弱了α-淀粉酶水解淀粉的能力,减缓消化速度。多孔表面结构、高比表面积表明,复合组可以通过在淀粉上的物理吸附和延迟淀粉降解产生的葡萄糖的扩散,有效地降低α-淀粉酶和淀粉之间的可及性[28]。
2.4.3 抑制α-葡萄糖苷酶活性分析
通过抑制机体内α-葡萄糖苷酶的活性,可有效减缓碳水化合物消化吸收,进而控制餐后血糖升高[29]。不同改性MBDF对α-葡萄糖苷酶的抑制力如图3-c所示。酶解组、复合组的α-葡萄糖苷酶抑制活性显著提高,可能是由于SDF含量、持水性和黏度增加,以及多孔表面结构引起的。由于可溶性纤维可以提高介质的黏度,使具有高吸水膨胀体积的纤维分子可相互作用形成黏性网络状结构,导致α-葡萄糖苷酶与底物(pNPG)之间的可及性较低[19]。此外,多孔表面结构促进pNPG和α-葡萄糖苷酶在膳食纤维上的吸附。热压组具有较高α-葡萄糖苷酶抑制力的原因可能是热压处理过程中,膳食纤维的结构更加紧密,提高与α-葡萄糖苷酶的结合能力,进而抑制其活性[30]。
3 结论
本实验以未改性小米糠膳食纤维为对照,探究了双酶改性、热压改性及热压-双酶复合改性3种处理方式对其化学组成、表面微观结构、理化性质及降血糖活性的影响。结果表明,3种改性方式均可不同程度提高小米糠膳食纤维中可溶性膳食纤维的含量,其中热压-双酶复合改性提升效果最为显著。双酶改性和热压-双酶复合改性,可使膳食纤维表面呈现出更为粗糙,具有大量微孔的蜂窝和多孔状表面结构,其比表面积、孔隙率得到明显改善,进而优化了吸水膨胀性能,显著增强了对葡萄糖的吸附能力与延缓吸附效果。此外,热压改性、热压-双酶复合改性可显著提高小米糠膳食的持水力、膨胀力及黏度。检测证实,热压改性组(MBDF-H)、双酶改性组(MBDF-E)及复合改性组(MBDF-HE)均具备抑制葡萄糖扩散、α-淀粉酶活性、α-葡萄糖苷酶活性的功能特性。改性前后膳食纤维均具有降血糖潜能,但其在体内功能作用和机制还需进一步研究。
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