当前常用的微球壁材,例如天然高分子材料如蛋白质和多糖,虽生物相容性较好,但在复杂环境如模拟胃肠液中易发生结构破裂,稳定性较差[1-3],且通过化学交联固化时,交联剂残留可能对生物活性物质造成损伤[4-5];合成高分子材料如聚乳酸、聚己内酯等,虽能通过调控聚合度优化力学性能与降解速率,但其生物相容性与细胞亲和性不及天然材料,且合成过程中有机溶剂的使用可能引入毒性风险,难以满足生物医学领域对“绿色制备”与“高生物安全性”的双重需求[6]。为突破传统壁材的瓶颈,科研人员将目光转向工程活性材料[7-8],其中由木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)合成的细菌纤维素(bacterial cellulose,BC)展现出作为微球壁材的显著潜力[9]。从制备角度看,BC可在温和条件下由微生物原位合成[10],无需高温高压或强化学试剂,易于通过培养条件调控其合成与结构。在材料性能方面,BC 具有天然纳米纤维三维网络结构,不仅赋予微球优异的机械强度与弹性,还具备良好的透气性与保水性,可为微球内部负载的活性物质如益生菌提供适宜的微环境,同时其卓越的生物相容性与无毒性,能有效降低载体与生物组织的排斥反应,显著提升微球在生物医学领域的应用安全性[11]。
尽管BC作为微球壁材优势显著,但如何实现其可控制备仍是关键挑战。传统方法如振荡培养、机械后处理等往往难以兼顾产物的均一性与结构完整性[12]。例如,袁海彬等[13]采用“后处理转化”思路,将 BC膜纯化、均质后再转化为微胶囊,虽实现微尺度成型,却脱离了BC原位合成的生物学特性。SUN等[14]通过振荡培养法制备BC水凝胶球体,但该工艺对发酵参数极为敏感,易导致球体黏连与形貌不均,且后续分散困难。BIRNBAUM等[15]提出“固相传质孵育”策略,利用超疏水粉末床辅助BC微胶囊成型,虽具有一定创新性,却受限于过程可控性。此外,油包水(W/O)乳液模板法虽可在液滴内实现BC原位合成,但其液滴质量严重依赖搅拌速率和乳化剂浓度,难以对微球尺寸与形貌实现精准调控[16]。相比之下,微流控技术[17-18]凭借对微尺度流体的精确操控能力,可与 W/O 乳液模板法[19-20]高效结合:一方面,微流控系统能通过调控油相、水相流速比及通道结构,生成单分散性极佳的水相液滴,从源头保证 BC 微球的尺寸均一性;另一方面,微流控的可控环境可稳定液滴形态,避免传统乳液制备中液滴融合或破裂的问题,为木醋杆菌在液滴内原位合成 BC 提供稳定微环境,最终实现“尺寸精准可控、结构稳定均一”的 BC 微球制备[21]。因此,微流控辅助 W/O 乳液模板法,成为充分发挥 BC 材料优势、突破微球可控制备瓶颈的重要技术路径。
基于此,本研究选用微流控W/O乳液模板法制备BC微球。通过系统研究微流控参数和乳液体系参数对微球成型质量的影响,结合激光共聚焦显微镜等表征手段,验证木醋杆菌在液滴限域空间内合成BC的可行性。本研究不仅为单分散BC微球的高效制备提供了可靠方案,也为微生物合成功能材料的形貌调控技术发展提供了有益参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
木醋杆菌(ATCC 700178),北京商城北纳创联生物科技有限公司;葡萄糖、酵母、癸烷,上海泰坦科技有限公司;司盘80、吐温80、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)600,上海国药集团化学试剂有限公司;超低凝胶温度琼脂糖、卡尔科弗卢尔荧光增白剂(calcofluor white stain,CFW),美国Sigma化学公司。
1.2 仪器与设备
LHS-24B立式自动压力蒸汽灭菌锅,致微(厦门)仪器有限公司;VD-850超净工作台,苏州净化设备有限公司;LSP01-3A注射泵,保定兰格恒流泵有限公司;JM-DG-10-30 PMDS芯片,武汉简米智控科技有限公司;ZWYC-2931振荡培养箱,上海知楚仪器有限公司;DM500光学显微镜,徕卡显微系统(上海)贸易有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 W/O乳液液滴的制备
采用微流控PDMS液滴生成芯片制备W/O型乳液液滴(结构如图1所示)。芯片通道经选择性亲水和疏水预处理,以调控界面浸润性。通过注射泵分别驱动内、外相流体,使其在十字交叉聚焦处汇合,利用剪切力促使内水相断裂形成单分散液滴。实验外油相为质量分数3%司盘80的癸烷溶液,内水相为木醋杆菌菌液。在内水相中分别添加不同质量分数的吐温80和PEG600(质量分数分别为1%、3%、5%),系统探究其对液滴形成稳定性与均一性的影响。
图1 微流控芯片制备W/O乳液液滴的过程
Fig.1 The process of preparing W/O emulsion droplets from microfluidic chips
1.3.2 W/O乳液凝胶液滴的制备
使用微流控PMDS单包芯片制备W/O乳液液滴(图2)。PMDS芯片预先进行亲水化和疏水化处理。内部流体和外部流体分别通过注射泵注入,在芯片十字聚焦处形成W/O液滴。添加质量分数3%司盘80的癸烷为外油相,添加超低凝胶温度琼脂糖的木醋杆菌菌液为内水相。为了保证内水相在芯片中的流动状态,需要在实验过程中对内液进行加热,以确保内液处于熔融状态,并在制备过程中能够保持装置内平稳连续的流动。首先,将超低凝胶温度琼脂糖加热至熔化均匀,然后将装置加热至超低凝胶琼脂糖熔化温度60 ℃,以确保流体流动顺畅。之后,在流动液体中添加木醋杆菌菌液,混合均匀。接收相进行冰浴处理,使得超低凝胶温度琼脂糖液滴能够快速凝胶。改变外油相流速和内水相流速。收集的凝胶液滴放入30 ℃培养箱进行培养。
图2 微流控芯片制备凝胶化W/O乳液液滴的过程
Fig.2 The process of preparing gelated W/O emulsion droplets from microfluidic chips
1.3.3 乳液液滴的尺寸分析
采用ImageJ 1.36b软件(美国)半自动分析程序对乳液液滴尺寸分布进行分析。使用数码显微镜捕获至少 20 个。样品的照片以 1 280×1 024 的分辨率拍摄。
1.3.4 稳定性评估
为评估乳液液滴的物理稳定性,将其置于30 ℃的恒温静态培养箱中贮存24 h。随后,通过光学显微镜观察其微观形貌的变化,重点考察液滴的大小、分布均匀性、以及是否出现聚集、絮凝等不稳定现象。
1.3.5 激光共聚焦显微镜
收集培养不同时间的BC微球转移至离心管中,低速离心使微球沉淀,小心移除上层油相。加入适量去离子水,重悬清洗微球,重复此步骤3次,以彻底去除残留油相。使用卡尔科弗卢尔荧光增白剂和1 mol/L NaOH溶液染色BC。选用激发波长为405 nm进行拍摄。
1.4 数据处理
使用Origin 2018 完成统计分析。
2 结果与分析
2.1 微流控芯片制备W/O乳液液滴
2.1.1 水相乳化剂对液滴稳定性的影响
木醋杆菌为典型好氧微生物,其生长繁殖与纤维素合成过程均需消耗氧气。为适配这一生长习性,实验油相选用具备优异的透氧性能的癸烷[16],能高效实现油相与水相间的氧气传递,为微胶囊内的木醋杆菌提供稳定的有氧微环境。同时,为提升油水体系的乳化稳定性,避免微胶囊团聚或破乳,于癸烷中添加3%(质量分数)司盘80 作为乳化剂;水相则采用不含任何额外乳化剂的YGC培养基,既为木醋杆菌提供生长所需营养,又避免了化学乳化剂对菌体活性的潜在抑制,进一步保障其在微胶囊化过程中的生理功能完整性。如图3-a所示,当内水相流速设定为10 μL/min、外油相流速为100 μL/min时,油相可有效剪切水相,在微流控芯片通道内形成液滴。收集所得乳液液滴并在显微镜下观察,如图3-b所示,液滴粒径分布较为均一。然而,由于木醋杆菌合成BC需要在30 ℃下培养24 h以上,将乳液液滴置于30 ℃培养箱中孵育24 h后发现其出现明显破乳现象(图3-c)。该结果表明,仅靠司盘80无法在长期培养过程中维持乳液的稳定性,难以为BC的合成提供固定的“球形”微反应空间。
a-生成;b-接收;c-接收24 h后
图3 微流控芯片制备W/O乳液液滴
Fig.3 Preparation of W/O emulsion droplets from microfluidic chips
为解决单一乳化剂导致W/O乳液长期稳定性不足的问题,后续采用司盘80与吐温80复配的乳化体系,二者可在油水界面协同吸附形成更致密、机械强度更高的复合界面膜,通过协同作用调控界面张力,减少液滴聚集风险[22]。由图4-a～图4-c可知,随着吐温80质量分数的增加,乳液粒径单分散性明显改善。这一现象初步证实了复配策略在短期内的有效性,表明复合乳化剂体系有助于形成更均一的液滴。然而,对乳液进行24 h的静态稳定性考察后(图4-d～图4-f),发现所有复配体系均出现液滴团聚的破乳现象。这一结果说明,尽管复合界面膜短期内可提升液滴均一性,但该膜本质是乳化剂分子的物理吸附组装体,缺乏化学交联或物理支撑结构,长时间放置易引发破乳。
a-1%吐温80 0 h;b-3%吐温80 0 h;c-5%吐温80 0 h;d-1%吐温80 24 h;e-3%吐温80 24 h;f-5%吐温80 24 h
图4 吐温80对W/O乳液液滴的影响
Fig.4 The influence of Tween 80 on W/O emulsion droplets
微流控液滴制备依赖剪切力与界面张力的平衡,流体的黏度对液滴的形成和稳定有影响。司盘80体系的水相黏度较低,在剪切力作用下,水相液滴易发生变形或融合,无法为木醋杆菌培养提供限定空间。因此,后续选用PEG600进行尝试,其分子结构中的亲水醚键与疏水端协同作用稳定油水界面,同时PEG600可显著提升水相黏度,减少微流控剪切过程中液滴的变形与融合,从根源优化液滴均一性。由图5-a～图5-c可知,与添加吐温80的体系相比,接收相的乳液粒的稳定性均随着PEG600质量分数的提高而提升。这证实了水相黏度的增加能够在短期内缓解破乳现象。然而,经24 h静置培养后(图5-d～图5-f),乳液仍发生明显聚并和破乳,这说明,尽管PEG600的增稠作用能在短期内优化乳液均一性并缓解破乳,但仍无法克服乳化剂体系在长期维持结构稳定性方面的局限性。
a-1%PEG600 0 h;b-3%PEG600 0 h;c-5%PEG600 0 h;d-1%PEG600 24 h;e-3% PEG600 24 h;f-5%PEG600 24 h
图5 PEG600对W/O乳液液滴的影响
Fig.5 The influence of PEG600 on W/O emulsion droplets
2.2 微流控芯片制备凝胶化W/O乳液液滴
2.2.1 接收相温度和时间对凝胶化乳液液滴微观形貌的影响
上述实验表明单一的乳化剂体系无法为木醋杆菌提供长期固定的生长空间,因此后续考虑引入凝胶化体系。本研究选用超低凝胶温度琼脂糖作为内相基质,其具有温敏特性,在60 ℃以上呈液态,温度降至30 ℃以下时转变为凝胶态,避免了传统凝胶体系需要引入额外交联剂的问题。将含有木醋杆菌的超低凝胶温度琼脂糖溶液作为内相,3%(质量分数)司盘80的癸烷作为外相,通过微流控法制备液滴。结果显示,若接收相温度维持在室温,液滴无法快速固化,仅2 h即出现显著黏连团聚现象(图6-a)。反之,当接收相温度控制在4 ℃并给予充分冷却时间,液滴迅速凝胶化为固态微球,其单分散性与形态完整性得到显著维持(图6-b～图6-c)。该结果表明选用超低凝胶温度琼脂糖能够实现其快速、彻底的凝胶化,是成功构建结构稳定、尺寸均一的凝胶微球的关键。这不仅解决了液滴的物理稳定性难题,更为后续木醋杆菌在限定空间内进行高密度培养和高效合成BC提供载体基础。
a-30 ℃ 2 h;b-4 ℃ 10 min;c-4 ℃ 20 min;d-4 ℃ 30 min
图6 接收相温度和时间对超低凝胶温度琼脂糖微球稳定性的影响
Fig.6 Effect of collecting temperature and time on the stability of ultra-low temperature gel agarose microspheres
2.2.2 流速比对凝胶化乳液液滴形成状态的影响
分散相与连续相流速比是微流控芯片中液滴断裂与形成的核心参数,为探究两相流速比对液滴生成的影响,本实验基于十字聚焦型PDMS芯片,固定分散相流速为10 μL/min,将连续相流速从10 μL/min逐步增加至100 μL/min,流速比从1∶1梯度变化至1∶10,通过高速摄像机实时观测液滴形成过程。结果发现,当两相流速比为1∶1时,由于连续相提供的剪切力不足,分散相与连续相在十字交叉处无法形成有效包裹与聚焦,反而以层流形式并行流动,两相界面未发生任何流束夹断与液滴断裂现象。随着连续相流速逐步增大,连续相提供的剪切力能够从十字交叉处向中心挤压分散相流束,使其在聚焦区出口被逐步拉细为均匀的圆柱形液丝,随后在剪切力与界面张力的协同作用下,形成尺寸均一的球形液滴(图7)。
图7 流速比对超低凝胶温度琼脂糖微球生成的影响
Fig.7 The influence of flow rate ratio on the generation of ultra-low temperature gel agarose microspheres
2.2.3 流速比对凝胶化乳液液滴粒径的影响
为进一步量化不同流速比下液滴的实际形态与稳定性,实验收集了各流速梯度下生成的乳液样品,通过显微镜拍摄图像并用ImageJ分析微球粒径。如图8和图9所示,当外相流速处于20～50 μL/min时,由于剪切力相对较弱,液滴生成频率较低,新生微球在通道中停留时间较长,易因碰撞而发生融合。而当外相流速提高至50 μL/min以上时,流体剪切作用显著增强,液滴生成稳定、间距适中,微球的单分散性与粒径均一性均得到明显改善。粒径分析图可以发现微球的平均粒径随外相流速的增加而显著减小,二者呈负相关关系。当外相流速由50 μL/min提升至100 μL/min时,平均粒径由约190 μm减小至约150 μm。该结果符合微流控液滴生成过程中的流体力学期望,即连续相流速增大导致对分散相的剪切作用增强,进而生成更小尺寸的液滴。这一规律为实现对微球尺寸的精确调控提供了可靠依据。
图8 不同流速比形成的超低凝胶温度琼脂糖微球显微镜图像
Fig.8 Microscopic images of ultra-low temperature gel agarose microspheres formed at different flow rate ratio
图9 不同流速比形成的超低凝胶温度微球粒径图
Fig.9 Particle size diagrams of ultra-low temperature gel agarose microspheres formed by different flow rate ratio
2.2.4 浓度对超低凝胶温度琼脂糖微球的影响
超低凝胶温度琼脂糖浓度直接影响凝胶网络的交联密度、机械强度及热稳定性,这些特性是影响木醋杆菌在固定空间中生长的核心因素,因此需探究琼脂糖浓度对微球制备及稳定性的影响。由图10-a可知,当琼脂糖质量浓度为0.01 g/mL～0.03 g/mL,均可通过微流控技术制备出粒径均一、单分散性良好的微球。将所得微球置于30 ℃培养箱中静置培养24 h后发现,0.01 g/mL琼脂糖微球出现明显融合(图10-b),其原因可能在于琼脂糖质量浓度过低,凝胶网络结构强度不足,在30 ℃下发生部分解凝胶或软化,导致微球形态失稳。相比之下,0.02 g/mL和0.03 g/mL的琼脂糖微球在相同培养条件下仍保持完整球形结构,形态未见明显改变,表现出良好的物理稳定性。该结果说明,适当质量浓度的琼脂糖凝胶模板能够为木醋杆菌的定植与生长提供结构稳定、形状固定的球形微环境,从而为其在固定空间内合成BC奠定基础。
a-4 ℃ 30 min;b-30 ℃ 24 h
图10 不同质量浓度超低凝胶温度琼脂糖微球的显微镜图像
Fig.10 The microscope images of ultra-low temperature gel agarose microspheres with different mass concentrations
由图11可知随着琼脂糖质量浓度的提高,微球的平均粒径相应地从约150 μm增大至约190 μm。该现象主要与琼脂糖溶液黏度的变化有关:随着质量浓度升高,水相黏度显著增大,在相同的两相流速比条件下,高黏度流体在剪切过程中形成的流束直径更大、断裂延迟,从而导致最终生成的液滴及固化后的微球粒径增大。这一结果符合微流控液滴生成过程中黏度对液滴尺寸影响的基本规律,进一步表明可通过调节琼脂糖质量浓度实现对微球粒径的控制。
图11 超低凝胶温度琼脂糖浓度对微球粒径的影响
Fig.11 The influence of ultra-low gel temperature agarose mass concentration on the particle size of microspheres
2.3 BC微球的表征
将制备得到的超低凝胶温度琼脂糖凝胶微球置于培养箱中静态培养,使用CFW对微球染色以观察BC的合成与积累情况,结果如图12所示。培养24 h后,荧光成像显示微球内部已出现少量BC的特异性荧光信号,表明木醋杆菌在凝胶微球内已初步适应环境并开始生长BC;随着培养时间的延长,BC在琼脂糖凝胶的三维网络内部持续积累,荧光信号强度逐步增强且分布范围不断扩大;当培养至第5天时,凝胶网络的空间限域引导木醋杆菌在球形内部不断分泌BC,荧光信号覆盖微球,证明BC微球的成功制备。
a-1 d;b-3 d;c-5 d
图12 不同培养时间形成的BC微球的激光共聚焦图
Fig.12 Laser confocal images of bacterial cellulose microspheres formed at different culture time
3 结论与讨论
不同的壁材决定了聚合物微球的性能差异和应用领域划分,其中天然可生物降解材料因环境友好、生物安全性高等突出优势,成为当前微球壁材研究的核心热点。在这类材料中,纤维素凭借优异的机械强度、稳定的物理及化学特性备受关注。张聪[23]和庄浩[24]以天然纤维素为原料展开研究,经强化学试剂溶解后,再通过手动滴注方式成型,最终得到可用于活性物负载和控释的纤维素微球。然而,此类纤维素微球的制备存在显著局限。首先,原料溶解依赖强化学试剂,不仅操作流程繁琐,残留的溶剂还可能引发细胞毒性风险,对生物医学应用的安全性构成威胁。其次,手动滴注、均质等成型方式[25-26]缺乏精准的尺寸调控能力,导致所得微球普遍粒径偏大且均一性差,无法满足连续规模化生产的工业需求。最后,天然纤维素除核心成分外,还不可避免夹杂木质素、半纤维素等杂质[27],导致材料的结构与性能存在差异,进而限制应用领域。
与天然植物纤维素相比,通过微生物发酵制备的BC,仅含单一纤维素成分、无杂质干扰,适配场景更为广泛,已成为功能载体的优选原料。不过,传统BC微球的制备工艺仍存在短板,尽管通过振荡培养已实现其生物合成,成功解决了溶剂残留问题,但所得微球粒径普遍偏大,难以满足精细化需求。载体制备与功能活性成分的负载过程相互独立[28],无法实现活性成分的原位负载,不仅增加了操作流程的复杂性,还可能降低负载效率,影响载体与活性成分的功能协同性。
综上所述,本研究选用木醋杆菌作为BC的合成菌株,借助微流控技术将其包封于超低凝胶温度琼脂糖微球内部,通过静态培养实现木醋杆菌在球形限域空间内的生长繁殖与BC合成。该方法既有效规避了传统振荡培养工艺中微球粒径偏大的核心缺陷,又依托微流控技术固有的高通量特性,满足了连续规模化生产的实际需求。这不仅为BC微球的绿色精准制备开辟了全新路径,也为微生物功能材料的微尺度定向构建提供了极具参考价值的创新思路。
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