近年来,炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)的发病率呈上升趋势,给国家卫生系统造成了巨大的社会和经济负担[1]。IBD导致的胃肠道损伤、体重减轻、腹痛、持续腹泻和直肠出血[2],对人类健康构成了很大威胁。研究发现姜黄素(curcumin,Cur)对IBD有改善作用,通过特异性结合炎症生物标志物,促进抗炎细胞因子的释放[3],并调节受体复合物的表达发挥其生物功能[4]。然而,Cur水溶性差,化学性质不稳定,生物利用度低,进而影响其抗炎能力[5]。因此需要开发多功能、更稳定的纳米材料靶向系统,克服Cur因胃特殊的酸及酶环境和药物靶向性影响疗效的难题[6]。目前Cur封装给药系统,如脂质体、纳米颗粒、乳剂、凝胶和高内相乳剂,都被证明具有稳定性和生物相容性[7]。
醇溶蛋白因具有可持续性、生物相容性等优势,其作为功能性运载工具的研究也在激增[8]。玉米醇溶蛋白(zein)的黏附特性能够耐受胃肠道环境,并通过黏膜运输药物和疫苗[9]。然而,zein制成的纳米颗粒的再分散性较差,压力聚集,胃相水解等会使封装的活性成分在胃中释放[10],zein与多糖的络合可有效解决这一问题[11]。例如,CHANG等[12]的研究发现果胶包覆显著提高了酪蛋白酸钠/zein复合蛋白纳米颗粒在胃肠道条件下的稳定性。CHEN等[13]的研究结果也显示zein内核和透明质酸(hyaluronic acid,HA)外壳组成的逐层复合纳米颗粒具有良好的稳定性及胃肠缓释能力,提高生物可及性。根据果胶中甲氧基含量的不同,即酯化度(degree of esterification,DE)的不同,可将其分为高甲氧基果胶(high methoxyl pectin,HMP)、中甲氧基果胶(medium methoxyl pectin,MMP)和低甲氧基果胶(low methoxyl pectin,LMP)。果胶因酯化程度不同而表现出不同的功能品质,包括表面疏水性、黏度和分子质量[14]。GUO等[15]采用pH值驱动法开发的豌豆分离蛋白-果胶纳米递送系统,表明果胶的酯化程度一定程度上会影响复合物的理化性质。目前,尚没有关于不同DE的果胶与zein共同构建的递送材料的研究。
综上,本研究旨在探讨不同酯化程度的果胶对zein基纳米粒子的形成及其输送Cur能力的影响。通过动态光散射(dynamic light scattering,DLS)和傅立叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)监测了不同酯化程度的果胶对纳米粒子尺寸、ζ电位和官能团的影响。利用荧光光谱(fluorescence spectroscopy,FS)研究Cur与zein之间的相互作用,并利用X射线衍射(X-ray diffraction,XRD)技术研究纳米颗粒的晶体形态。最后,还研究了不同纳米颗粒的稳定性及消化特性,以评估基于zein的纳米颗粒封装Cur的能力。这些研究结果旨在更好地改善Cur的稳定性及其在食品和医药递送领域中的潜在应用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
zein(蛋白质含量为92%)、Cur(>98%)、人工模拟胃液(simulated gastric fluid,SGF)、人工模拟肠液(simulated intestinal fluid,SIF),上海源叶生物科技有限公司;柑橘HMP(DE值70%～77%)、柑橘MMP(DE值66%～69%)、柑橘LMP(DE值30%～40%),山东烟台安德烈果胶有限公司;所有其他化学品均为分析级,天津市恒兴化学制剂制造有限公司。
1.2 仪器与设备
SHZ-D(Ⅲ)循环水真空泵,上海力辰邦西仪器科技有限公司;RE-52旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂;H97恒温磁力搅拌器,上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司;JD20-5电子分析天平,沈阳龙腾电子有限公司;PHSJ-4F精密pH计,上海仪电科学仪器股份有限公司;UV-1000紫外分光光度仪,北京莱伯泰科仪器股份有限公司;80-2低速离心机,金坛新瑞仪器有限公司;DLSB冷冻干燥机,上海凌科仪器有限公司;Nicoet is5型 FTIR仪,美国赛默飞世尔科技公司;D8型XRD仪,日本日力公司。
1.3 实验方法
1.3.1 zein-Cur和zein-HMP/MMP/LMP-Cur 复合物的制备
将zein(1.0 g)溶于100 mL 体积分数为70%的乙醇-水中,在磁力搅拌器中以600 r/min的转速搅拌30 min,使样品充分溶解。将3种不同DE的果胶溶解在100 mL去离子水中,用磁力搅拌器以600 r/min 的转速搅拌30 min,使果胶充分溶解,然后在4 ℃下水合过夜。
负载Cur的复合物的制备采用CHEN等[16]的方法,并做简单修改。将Cur加入zein溶液中,在磁力搅拌器中以600 r/min 的转速搅拌2 h,使样品完全溶解。zein与Cur的质量比设置为20∶1,该样品被命名为zein-Cur。将嵌入Cur的zein溶液逐滴滴加到果胶溶液中,搅拌2 h,形成不同的纳米复合物。zein与3种DE果胶的质量比分别为1∶4、1∶3、1∶2、1∶1 和 2∶1。旋转蒸发仪在45 ℃和-0.1 MPa的条件下除去多余的乙醇。然后,再加入等体积的超纯水,以确保总体积保持恒定,从而获得复合物分散液。
纳米颗粒分散液在3 000 r/min 转速下离心20 min,然后用真空冷冻干燥机干燥一部分制备好的纳米颗粒分散液,制备出用于固态分析的冻干粉末。而其余的纳米颗粒分散液则保存在4 ℃的冰箱中,以备下一步使用。为便于后续实验标记,由zein和酯化程度不同的果胶而形成的纳米粒子的相应样品名称分别简称为ZHMC(1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1)、ZMMC(1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1)和ZLMC(1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1)。
1.3.2 粒径、多相分散指数(polymer dispersity index,PDI)和ζ-电位的测定
将纳米颗粒按比例稀释(以避免多重散射效应),然后用Zeta电度仪测定纳米颗粒的粒径、ζ-电位和 PDI。实验在室温下进行,平衡时间为120 s,每次测量扫描12次,每个样品平行测量3次。最终数据取平均值。
1.3.3 包埋特性
用超纯水将100 μL样品稀释至1 000 μL,然后取400 μL稀释样品加入3 mL由乙酸乙酯和无水乙醇(体积比为10∶1)组成的萃取剂中进行萃取和稀释。样品静置20 min后分层,用分光光度计在426 nm 波长下测定上清液的吸光度值。封装效率(encapsulation efficiency,EE)和负载能力(loading capacity,LC)的计算分别如公式(1)和公式(2)所示:
(1)
(2)
式中:C0,根据吸光度值计算出的Cur的质量,mg;C1,初始添加的Cur的质量,mg;C2,初始添加zein和果胶的质量,mg。
1.3.4 FS
使用 F-7000系列荧光分光光度计在室温下采集了zein-Cur和ZHMC、ZMMC和ZLMC三元复合纳米粒子的荧光光谱。激发波长设定为290 nm,发射波长设定为300～450 nm,激发和发射波长的狭缝宽度均为10 nm。记录空白溶液系统作为背景,以校正收集到的荧光光谱。
1.3.5 XRD
将样品研磨成粉末,放入XRD仪中。使用Cu-Ka辐射,在20 ℃、40 kV 和50 mA下以 2°/min的速度在5°至60°范围内扫描,衍射角为2θ。
1.3.6 FTIR
将制备好的样品冷冻干燥,用溴化钾按1∶100的质量比研磨,然后加压压制成透明薄片。扫描范围设定为4 000～400 cm-1,分辨率为4 cm-1,在25 ℃的环境温度下累积扫描32次。
1.3.7 纳米颗粒对外部压力的稳定性
1.3.7.1 纳米粒子的热稳定性
取10 mL复合纳米颗粒分散液于样品瓶中,0 min时避光取2 mL样品,然后将样品瓶放入37、95 ℃恒温水浴中避光加热3 h,取出样品避光冷却至室温,再取2 mL样品按1.3.3节的方法测定吸光度值。热处理后Cur的保留率(retention rate,RR)以0 min时样品的初始Cur含量为基础。根据标准曲线和Cur在复合纳米颗粒中的RR计算Cur的浓度,RR的计算如公式(3)所示:
(3)
式中:Ct,根据吸光度值计算出的第t时刻纳米颗粒中Cur的含量,mg;C,新制备纳米颗粒中Cur的含量,mg。
1.3.7.2 纳米颗粒的光稳定性
取15 mL复合纳米颗粒分散液样品置于透明玻璃样品瓶中,置于紫外灯下,光照强度和温度均为室温。分别在0、30、60、90、120、150 min取2 mL样品。然后,按照1.3.3节的方法测定吸光度值。紫外线照射后Cur的RR以0 min时样品中的初始Cur含量为基础。RR的计算如公式(3)所示。
1.3.7.3 纳米颗粒的pH稳定性
取5 mL样品于透明玻璃样品瓶中,分别用HCl溶液和NaOH溶液调节pH值至2～9,然后按1.3.3节的方法测定吸光度值。不同pH值处理后Cur的RR以样品初始pH值时的Cur含量为基础。RR的计算如公式(3)所示。
1.3.8 体外消化模拟
1.3.8.1 胃消化阶段的模拟
根据HUR等[17]的相关实验研究进行简单修改,建立了该复合系统的体外消化模拟实验。该实验模拟了人体胃部的消化环境,为后续的消化奠定了基础。实验条件如下:将样品按体积比为1∶1放入SGF中,调节pH值为2.0,然后在37 ℃恒温水浴中进行模拟消化实验,分别在0、0.5、1 h后取样,用NaOH溶液中和,按1.3.3节的方法测定吸光度值。消化后的样品用NaOH溶液中和,pH值调至7.5。
1.3.8.2 模拟肠道消化阶段
将SIF以体积比为1∶1加入上述消化液中。然后在37 ℃的恒温水浴中进行模拟消化,收集的样品立即放入冰浴中冷却以终止消化过程。分别在0、0.5、1 h时取样,然后按照1.3.3节的方法测量吸光度值计算释放率。
1.4 数据分析
结果用“平均值和标准差”进行分析,每个实验进行3次。统计差异采用SPSS Statistics 26进行单因素方差分析(analysis of variance,ANONA)。
2 结果与分析
2.1 粒径、PDI 和 ζ-电位
不同DE的果胶与zein按不同质量比构建的纳米复合物的粒径、ζ-电位和PDI如图1所示。zein-Cur的平均粒径为114.43 nm,ζ-电位为14.47 mV,PDI为0.26。可能是因为Cur具有的疏水性与含疏水性氨基酸的zein之间发生了疏水相互作用、静电作用等,使zein肽链之间结合得更紧密,纳米颗粒的粒径较小,Cur的负电荷电位则使电位降低[12]。粒径结果显示,随着果胶占比的增加,ZHMC和ZMMC的粒径呈现逐渐降低的趋势,这是因为果胶的加入阻止了zein分子之间的聚集,从而提高了复合溶胶的稳定性[18]。这归因于生物聚合物团簇之间较高的净电荷和静电排斥作用。ZLMC的粒径变化趋势则呈现先减小后增加的趋势,相反,ZLMC的ζ-电位变化趋势则呈现先升高后降低的趋势。粒径降低是由于果胶的加入使体系更加稳定,质量比大于1∶2后呈现粒径增加的原因是LMP中有更多的游离羧基,LMP通过羧基与亲水性氨基酸残基的侧链共价连接锚定在蛋白分子表面而使粒径增加[19]。电位结果显示,ZMMC和ZLMC表面的电位高于ZHMC,这是因为MMP和LMP具有更多的游离羧基,因此带有更高的电荷[20]。由于不同的电荷密度可能会在络合过程中产生或大或小的静电吸引力,因此果胶的电荷密度对形成zein-果胶复合物至关重要[21]。ZHMC纳米粒子的粒径逐渐减小,电位逐渐升高。这些结果表明,增加混合物中带正电的zein分子的占比,有利于增强zein与HMP之间的静电作用,从而形成纳米颗粒复合物。相似的,ZMMC纳米粒子的发展趋势与ZHMC相同。不同之处在于,ZMMC纳米粒子的电位更高,因为相对于HMP来说,MMP具有更多的游离羧基,因此电位高于HMP。然而,在构建ZLMC纳米粒子的过程中,随着zein与果胶的质量比从1∶4 降至1∶2,粒径逐渐减小,电位逐渐升高。这可能是由于过量的果胶通过非共价吸引物吸附在蛋白表面。在蛋白表面逐渐生长成壳。一方面,这种外壳可以屏蔽蛋白质表面携带的电荷,从而减弱蛋白质分子之间的静电斥力,导致蛋白质分子体的聚集致使颗粒粒径增加,随着果胶占比的降低,这种屏蔽作用逐渐减弱,静电斥力增加,从而减小了颗粒尺寸[22]。当zein占比过高时,较低的表面静电荷不足以抵消蛋白质分子间的静电引力而产生聚集进而增大粒径。
a-ZHMC复合纳米粒子的粒径、PDI;b-ZMMC复合纳米粒子的粒径、PDI;c-ZLMC复合纳米粒子的粒径、PDI;d-ZHMC复合纳米粒子的Zeta电位;e-ZMMC复合纳米粒子的Zeta 电位;f-ZLMC复合纳米粒子的Zeta电位
图1 ZHMC、ZMMC、ZLMC复合纳米粒子的粒径、PDI和Zeta电位的影响
Fig.1 Effect of particle size,PDI,and Zeta potential of ZHMC,ZMMC,and ZLMC composite nanoparticles
但值得注意的是,由图1可以看出,所有样品的PDI都保持在较低水平,这表明ZHMC、ZMMC、ZLMC纳米复合物在溶液中的粒度分布相当均匀,显示出较好的分散性和稳定性。
2.2 纳米颗粒的包埋特性
测定zein-Cur的EE值与LC值分别为(52.24±0.45)%和(4.29±0.38)%,Cur添加量高会产生沉淀,无法被包埋,即EE值与LC值偏低[18]。由不同DE的果胶和zein构建的纳米颗粒对Cur的包埋特性如图2所示。结果比较表明,zein-果胶复合物可有效包裹Cur。比较3种复合物的EE值可以发现,zein-果胶复合物的包埋能力在一定程度上受到果胶DE的影响[15,21]。从EE值和LC值来看,MMP和LMP构建的纳米颗粒的EE和LC均优于HMP,这与CHENG等[19]的研究结论相似,即相对于HMP而言,采用LMP与大米蛋白组成的复合凝胶可以有效地包封Cur。这与纳米复合物的结构特性有关,随着果胶DE的增加,表面电荷降低。所形成的空间结构更加松散,从而使Cur不能稳定地保存在zein的疏水内核中,最终导致EE和LC降低。鉴于封装Cur的量相同,不同复合物封装Cur的速率不同可能是由于分子间非共价作用力不同造成的。本研究中,在ZHMC(1∶3)、ZMMP(2∶1)、ZLMC(1∶2)样品的EE最高,分别为(73.89±0.33)%、(80.73±0.25)%和(74.42±0.28)%。ZMMC(2∶1)的EE较高,这可能是因为zein含量高,可提供更多的疏水位点来结合Cur,而果胶的加入则通过各种分子间相互作用力保持了复合纳米颗粒的稳定性。
a-ZHMC复合纳米粒子的EE和LC;b-ZMMC复合纳米粒子的EE和LC;c-ZLMC复合纳米粒子的EE和LC
图2 ZHMC、ZMMC、ZLMC复合纳米粒子的EE和LC
Fig.2 EE and LC of ZHMC,ZMMC,and ZLMC composite nanoparticles
考虑到纳米复合物的粒度、电位、EE以及本实验的目的,接下来使用ZHMC(1∶3)、ZMMC(2∶1)、ZLMC(1∶2)进行了纳米颗粒的表征和体外模拟消化研究,因为,此条件下纳米材料具有相对较小的粒径和最大的EE。
2.3 FS
FS是研究分子间相互作用力的一种非常有效且常用的方法。在本研究中,不同物质的荧光光谱图如图3所示。在290 nm的激发下,zein在304 nm处显示出强烈的荧光发射峰。这一结果是由于zein中含有较多的酪氨酸残基,在290 nm的激发下,酪氨酸残基在304 nm附近具有典型的发射峰[23]。
图3 zein、zein-Cur、ZLMC、ZMMC 和 ZHMC的荧光光谱图
Fig.3 FS of zein,zein-Cur,ZLMC,ZMMC,and ZHMC
加入Cur后,zein的荧光强度降低。这表明Cur能与zein中的酪氨酸残基结合,使其发生荧光淬灭,这与DAI等[24]的研究结果一致。此外,Cur的存在导致发射峰的最大值向光谱的红色端移动(从304 nm 到305.5 nm),这种红移现象表明zein-Cur相互作用引起了酪氨酸分子环境的变化,使酪氨酸分子的微环境变得更加亲水。当加入不同DE的果胶时,zein的荧光强度再次降低。这一现象可以用静电淬灭原理来解释[25]。带正电荷的酪氨酸与带负电荷的果胶相互作用,导致荧光猝灭,即聚合物之间的络合作用引起的静电淬灭。此外,果胶的加入导致玉米黄素发射峰的最大值向光谱的蓝色端移动(从304 nm到300 nm),这表明zein-Cur-果胶的相互作用导致酪氨酸分子的环境发生了变化,使酪氨酸分子的微环境更加疏水[26]。zein与Cur和果胶的结合产生了新的峰值,最大发射波长约为350 nm,表明形成了三元复合物。因此,在颗粒构建阶段,zein、果胶分子和Cur之间的疏水相互作用起到了关键作用。
2.4 XRD
研究表明功能性活性成分的水溶性会受到结晶度的影响,因此本研究可以使用XRD仪来测量不同物质的结晶状态。本研究中,不同物质的XRD图样如图4所示。在zein的XRD图谱中,可以发现在9°和19°处有2个宽峰,此外没有其他峰出现,这表明zein以无定形形式存在。DAI等[27]也发现zein的XRD图谱显示了2个较宽的驼峰,衍射角(2θ)分别为9.2°和19.5°。而在Cur的图谱中,许多尖锐的峰分别出现在8.7°、12.2°、14.2°、17.1°、21.0°、24.6°、26.5°、28.9°。这表明Cur以结晶形式存在。天然果胶因其无定形性质而没有明显的峰值[15],图谱中的小峰值可能是加工过程中的杂质造成的。当Cur被封装成二元或三元复合物时,Cur的特征峰就会消失(图4)。这表明Cur被成功包埋,同时包埋后的Cur以无定形状态存在,增加了其水溶性。果胶的加入并没有使Cur原有的形态发生太大的变化,说明果胶的存在对有效成分晶体大小的影响微乎其微。
图4 zein、Cur、LMP、MMP、HMP、zein-Cur、ZLMC、ZMMC和ZHMC复合物的XRD图谱
Fig.4 XRD spectra of zein,Cur,LMP,MMP,HMP,zein-Cur ZLMC,ZMMC,and ZHMC complexes
图5 zein、Cur、LMP、MMP、HMP、ZLMC、ZMMC和ZHMC 复合物的FTIR图
Fig.5 FTIR of zein,Cur,LMP,MMP,HMP,ZLMC,ZMMC,and ZHMC complexes
2.5 FTIR
FTIR可以检测分子中官能团的变化。在FTIR图谱中,zein的特征峰出现在3 320.9、2 929.3、1 745.3、1 658.9、1 539.1 cm-1处,分别代表O—H振动、C—H振动、C
O 振动(酰胺Ⅰ)、C—N—H 振动(酰胺Ⅱ)和未结合的羰基振动。从果胶的红外光谱图可以看出,HMP、MMP、LMP典型的O—H伸缩峰分别为3 373.2、3 381.4、3 385.6 cm-1。CO振动峰分别为1 749.1、1 746.8、1 744.4 cm-1。未解离的羧酸(COOH)的振动峰出现在1 636.6、1 634.2、1 620.2 cm-1。
当Cur被包裹在纳米复合物中时,zein的—OH伸缩振动发生了变化,随着DE的增加,从3 320.9 cm-1移动至3 345.6、3 340.1、3 334.21 cm-1处,这表明氢键是Cur与zein和果胶复合物结合的作用力之一[28]。此外,酰胺Ⅰ从1 658.9 cm-1移动至1 658.4、1 655.5、1 656.5 cm-1处,酰胺Ⅱ的峰值从1 539.1 cm-1移动至1 536.0、1 537.9、1 537.9 cm-1处。酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ的移动分别代表疏水作用和静电作用[29-30],表明纳米颗粒形成过程中,疏水作用和静电作用也起到非常重要的作用。这与GUO等[15]的研究结果一致,即蛋白质、果胶和Cur之间的相互作用主要以氢键、疏水和静电作用为主。同时,随着DE的增加,氢键和静电作用的贡献减小,而疏水作用的贡献增大,这是因为随着DE的增加,更多的游离羰基被甲基取代,因此氢键和带负电荷的羰基减少[21]。位移的大小表明非共价作用力的强弱,上述结果表明,纳米复合物的形成过程中,ZHMC形成过程中的疏水相互作用要强于ZLMC,而ZLMC形成过程中的静电相互作用和氢键作用力强于ZHMC。Cur在光谱中的特征吸收峰通常出现在3 511.7、1 631.4、1 027.7、959.4、856.2、808.9 cm-1处,其中3 511.7 cm-1处的吸收峰源于酚羟基的伸缩振动。然而,在ZHMC、ZMMC、ZLMC纳米复合物的光谱分析没有观察到Cur的这些特定特征吸收峰,这表明Cur被成功地封装在纳米粒子中。ZHANG等[31]的研究也有类似发现,Cur被zein和褐藻多糖包裹后,其特征吸收峰也同样消失了。这一现象归因于Cur与蛋白质和多糖之间的氢键或疏水相互作用,限制了Cur化学键的弯曲和伸展运动,从而使Cur的大部分特征吸收峰在纳米复合物中不明显。这一变化可以作为Cur成功封装在纳米络合物中的有力证据。
根据荧光光谱、FTIR和XRD仪的结果,模拟了纳米粒子的形成过程图,如图6所示。
图6 通过反溶剂沉淀法制备的zein-Cur和ZHMC、ZMMC、ZLMC纳米可颗粒的形成过程
Fig.6 Formation of zein-Cur and ZHMC,ZMMC,ZLMC nanoparticles prepared by antisolvent precipitation
2.6 纳米粒子的稳定性
2.6.1 纳米粒子的热稳定性
热处理是食品加工和制造过程中必不可少的工序之一,煮沸杀菌与巴氏消毒在生产过程中也是不可或缺,KUANG等[32]研究发现纳米粒子的的热稳定性也随着温度的升高而降低,同时,为了了解人体温度条件下对活性成分稳定性也会产生影响,因此研究温度设定为95、37 ℃。zein-Cur在37、95 ℃加热3 h 后RR分别为(71±0.21)%和(24±0.84)%,因Cur本身的性质不稳定,因此对Cur的复合物构建则更为重要[5]。如图7所示,ZHMC、ZMMC、ZLMC在37 ℃时相对稳定,加热3 h后分别损失26%、20%和25%,损失较少。但在高温(95 ℃)条件下,ZHMC、ZMMC、ZLMC对Cur的保留损失相对较大,RR分别为55%、57%和48%。由此可见,ZHMC、ZMMC、ZLMC在高温条件下对Cur有部分损失,但仍有很好的保护作用。这种效果归因于Cur分子嵌入到形成纳米粒子内部的疏水性zein核心中[16]。结果表明,随着果胶DE的增加,zein-果胶复合物对Cur的保护作用也随之增加,这是因为DE高的果胶更稳定[15]。
a-RR;b-表观照片
图7 ZHMC、ZMMC、ZLMC在37 ℃和95 ℃时Cur的RR及表观照片
Fig.7 Retention and photomicrographs of curcumin in ZHMC,ZMMC,and ZLMC at 37 ℃ and 95 ℃
2.6.2 光化学处理的影响
纳米颗粒在贮存和运输过程中会受到光的影响,因此研究纳米颗粒的光稳定性也很有用。zein-Cur在紫外线照射下0至2.5 h的RR分别为(74±1.82)%、(71±0.30)%、(64±1.41)%、(57±1.57)%和(49±0.92)%。Cur对紫外线敏感会迅速降解,紫外线照射1 h后,游离Cur的RR降至30 %以下[33-34]。zein中双键和芳香族氨基酸残基具有吸收紫外线的能力,有利于提高抗紫外线稳定性,故稳定性相对较高。如图8-a所示,ZHMC、ZMMC、ZLMC在紫外线照射下0～2.5 h的RR变化情况。可以看出,随着辐照时间的延长,RR逐渐降低。结果表明,DE对zein-果胶复合物对Cur的保护作用的影响较小。相对而言,由于DE较高的果胶比DE较低的果胶更稳定,氢键的增加有利于提高抗紫外线稳定性,因此由HMP组成的复合物具有更好的保护能力[15]。辐照结束后,各组仍有50%以上的RR,这也是因为Cur被嵌入到复合纳米粒子内部的疏水性zein核心中,其活性得到了很好的保护[9]。此外本实验的结果也证实了基于蛋白质的纳米系统是保护Cur的有效方法。
a-ZHMC、ZMMC、ZLMC在紫外灯照射 0～2.5 h时的Cur RR;b-ZHMC、ZMMC、ZLMC在pH值为2～9时的Cur RR;c-ZHMC、ZMMC、ZLMC在pH值为2～9时的表观照片
图8 ZHMC、ZMMC、ZLMC在紫外灯照射0～2.5 h时的Cur RR和pH值为2～9时的Cur RR及表观照片
Fig.8 Curcumin retention of ZHMC,ZMMC,and ZLMC at UV light irradiation from 0 to 2.5 h and pH value from 2 to 9,and photomicrographs
2.6.3 pH值的影响
纳米颗粒在体内和体外环境条件下会发生不同的pH值变化,因此研究不同pH值条件下Cur包裹纳米颗粒的稳定性非常重要。zein-Cur在pH值为2～9的环境下的RR分别为(61±1.15)%、(58±0.59)%、(51±1.78)%、(32±0.20)%、(29±0.58)%、(25±1.74)%、(37±1.51)%和(32±0.94)%,zein的等电点在6.1左右,当pH值为5～7,会出现明显的“絮凝”现象,因zein-Cur的表面电位下降,颗粒之间发生聚集沉淀,分散性下降,导致负载量下降[34]。
图8-b展示了ZHMC、ZMMC、ZLMC样品的复合纳米粒子在pH值为2～9的环境下的Cur保护效果;如图所示,ZHMC、ZMMC、ZLMC在酸性条件下能够保持良好的稳定性。但由于碱性条件会改变物质表面电荷的性质和分布,从而影响ZHMC、ZMMC、ZLMC形成复合纳米粒子的主要作用力,导致其封装能力下降,Cur被释放出来。总体而言,3种纳米粒子在整个pH值范围内具有相同的趋势,即在酸性条件下对Cur的保护作用相对较强,而在碱性条件下对Cur的保护作用相对较弱。这表明本实验构建的纳米颗粒具有敏感的pH依赖性,即酸性条件下保护Cur不被破坏,在碱性条件下释放。可用于下一步的体外模拟消化研究,作为开发具有pH相应特性的生物相容性纳米给药系统的一种方法[35-36]。Cur在碱性条件下呈现红色是由于溶液中含有大量游离Cur,使样品整体呈现红色(如图8-c所示)。
2.7 体外胃肠道消化
研究发现单一的zein纳米粒子仍然很容易被胃肠道中的消化酶(如胃蛋白酶和胰蛋白酶)消化。通过非淀粉多糖对zein纳米粒子进行表面包覆,可增强其对胃肠道消化酶的抵抗力,从而实现在肠道内的控释[37]。YAN等[38]研究发现,多糖可作为复合纳米粒子的“外壳”,提供屏障保护,减少胃蛋白酶对纳米粒子的消化,从而使更多Cur转移到肠道中。SHEHZAD等[39]发现,zein和多糖的耦合增加了生物活性成分在胃肠道环境中的稳定性,从而可以控制生物活性成分的输送。zein-Cur在胃液消化过程中,Cur的释放率在0.5 h和1.0 h时分别达到27.29%和38.94%,可能是胃液的低pH环境的使其稳定性降低,纳米颗粒发生了聚集,出现了“絮凝沉积”现象。纳米颗粒表面受到盐酸和胃蛋白酶的侵蚀,在酸性环境下发生了降解,影响了结构,使内部的Cur分子在消化过程快速释放,且Cur在酸性条件下的溶解度很小,释放出的Cur可能吸附在纳米颗粒表面,使纳米颗粒的疏水性增大,进而发生聚集[40]。在模拟肠液的过程中Cur的释放率变化不大(分别为47.68%、50.29%和52.04%),可能是蛋白被消化破坏后功能性发生变化,同时pH的变化增大了Cur的溶解度,但失去包埋保护的Cur生物活性下降,即Cur释放率不高[41]。
ZHMC、ZMMC、ZLMC的结果如图9所示。在胃液中消化1 h后,ZHMC、ZMMC、ZLMC纳米颗粒中Cur的释放率分别为18.80%、32.37%和24.87%。但从外观上观察到,ZMMC在模拟胃液中结构被破坏,出现沉淀,说明ZMMC复合物在胃液中的释放能力更强,而ZHMC、ZLMC复合物在模拟胃液环境中对Cur的保护能力更强。相比之下,ZHMC纳米粒子能更好地保护Cur在胃中不被破坏。随后,在肠道中模拟消化1.5 h后,ZHMC、ZMMC、ZLMC复合物的Cur释放率分别达到67.78%、76.91%和92.16%。这些结果表明,ZHMC能更好地防止Cur在胃中的释放,并能实现其在肠道中缓慢释放的能力。
a-ZHMC、ZMMC、ZLMC在SGF中反应0～1 h的表观照片;b-ZHMC、ZMMC、ZLMC在SIF中反应1.5～2.5 h的表观照片;c-ZHMC、ZMMC、ZLMC中Cur在SGF和SIF中的释放率
图9 ZHMC、ZMMC、ZLMC在SGF中反应 0～1 h,在SIF中反应1.5～2.5 h,Cur在SGF和SIF中的释放率
Fig.9 Release rate of curcumin in simulated gastric and simulated intestinal fluids for ZHMC,ZMMC,and ZLMC reacted in SGF for 0-1 h and in SIF for 1.5-2.5 h
此外,Cur的缓慢释放可能归因于复合纳米颗粒之间的氢键和强疏水相互作用。因此,ZHMC、ZMMC、ZLMC复合物中的蛋白质和多糖共轭物可以保护蛋白质的疏水氨基酸,减少胃蛋白酶对蛋白质结构的破坏,从而减少Cur的释放。相比之下,ZMMC纳米粒子由于含有高质量占比的zein,容易被胃蛋白酶破坏,因此部分纳米粒子在胃中就被破坏了。然而,ZHMC、ZLMC纳米粒子含有更多果胶,可以有效保护zein不被破坏。因此,在模拟胃液环境中,ZHMC、ZLMC纳米复合物可防止胃蛋白酶消化破坏Cur,只释放出少量Cur。然而,当ZHMC、ZLMC纳米复合物被引入模拟肠液时,随着环境pH变成弱碱性,不同DE的zein和果胶之间的相互作用减弱。此时,胰蛋白酶开始发挥作用,破坏蛋白质结构,进而促进Cur的大量释放。这种转变确保了Cur在肠道中的有效释放,从而提高了Cur的生物利用率。
因此,本研究认为ZHMC纳米粒子能更好地保护Cur在胃中不被消化,并在肠道中缓慢释放。因此,Cur的生物利用率可以得到有效提高,从而达到缓解肠道炎症的目的。这与GUO等[15]的研究结果一致,即豌豆分离蛋白-Cur-HMP复合物可延迟Cur在模拟胃肠道中的释放。
3 结论
本文以zein和3种不同酯化程度的果胶为壁材,制备了ZHMC、ZMMC、ZLMC三元纳米复合物,研究了zein和不同DE果胶的质量比对粒径、电位、PDI和EE的影响。分析了Cur在模拟胃肠道消化过程中的释放行为,不同的光、热和pH条件以确定ZHMC、ZMMC、ZLMC三元纳米复合物的稳定性。当zein与HMP、MMP、LMP的质量比分别为1∶3、2∶1、1∶2时负载Cur,制备的纳米复合物粒径较小,样品大小均匀,zeta电位分别为(-15.6±0.61)、(-22.5±0.81)、(-26.0±0.95)mV,包封率分别为(73.89±0.33)%、(80.73±0.25)%和(74.42±0.28)%。此外通过FTIR、XRD和荧光显微镜可以推断氢键、静电和疏水相互作用是形成纳米复合物的驱动力。ZHMC还具有良好的热稳定性、光稳定性和pH值响应特性,更有利于Cur在胃中的保护和在肠道中的释放。总之,本研究制备的Cur负载纳米复合物有望应用于功能食品和药物领域,并为负载易分解及不稳定物质提供理论与实验参考。
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