N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc或NAG)具有多种生理功能[1],例如,GlcNAc可修复和维持软骨及关节组织功能,可增强人体的免疫功能,可作为食品添加剂、糖尿病病人的甜味剂,还可以促进人体透明质酸的代谢合成。因此,GlcNAc广泛应用于医药、食品和化妆品等领域[2]。
GlcNAc的工业生产方法主要包括酸水解法、酶水解法和微生物发酵法。酸水解法以虾蟹壳提取的甲壳素为原料,需使用强酸强碱,存在环境污染、原料来源受限及产品致敏性等问题;酶水解法受限于高酶成本、低效率及长反应周期。随着合成生物学技术的快速发展,微生物发酵法因其环境友好、原料可再生等优势成为主流[2]。
目前,微生物合成GlcNAc的研究报道大多集中在大肠杆菌(Escherichia coli)[3-4]、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)[5]和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[6]等这些公认安全的菌株上。WU等[7]通过采用CRISPR-dCas12a系统针对多个竞争性代谢途径进行动态干扰,成功构建了生产GlcNAc的B.subtilis菌株,在15 L发酵罐中的GlcNAc产量达到了183.9 g/L。然而,B.subtilis容易产生具有极高抗逆性的芽孢,发酵过程中还会产生明显的异味,并不适合工业化生产[8];同年,他们通过阻断和干扰竞争性代谢途径以及优化发酵条件等使得GlcNAc在C.glutamicum中的产量达到了138.9 g/L[9]。然而,相比于C.glutamicum和B.subtilis,E.coli具有更清晰的遗传背景、更成熟的基因工具以及易于培养的优势,因此更适合合成GlcNAc。2024年,LU等[10-11]以E.coli ATCC 25947(DE3)为底盘菌株,通过代谢工程以及酶工程等策略有效缓解了生产过程中的代谢溢流和磷酸糖应激现象,使GlcNAc的产量达到217 g/L。2021年,MA等[12]和ZHANG等[13]以E.coli W3110为底盘菌株,通过敲除6-磷酸果糖激酶基因pfkA、引入甘油激酶基因glpK*(G913A)突变株等,将菌株生长与GlcNAc合成解偶联,产量达到179 g/L;2025年,又继续敲除磷酸戊糖途径的关键限速基因葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf及优化补料策略,使GlcNAc产量达到249 g/L[14]。
相比于常用的大肠杆菌,关于益生大肠杆菌Nissle 1917(Escherichia coli Nissle 1917,EcN)合成GlcNAc的研究报道很少。EcN是一种特殊的非致病性大肠杆菌。EcN被用作非处方益生菌药物已有超过100年的历史,它具有增强肠道免疫功能,保护肠黏膜屏障,抑制病理性炎症等功能[15]。EcN具有和普通大肠杆菌一样的快速生长特性,并且还具备低内毒素、抵御裂解性T4噬菌体感染的安全特征。随着近年来基因组编辑工具和基因组学测试工具的快速发展,EcN在合成生物学领域的应用引起了极大的关注和广泛的研究[16]。
本文在实验室已有菌株TCBJ117[E.coli Nissle 1917ΔattB(lacUV5-T7)ΔendAΔompT]的基础上,构建了高效合成GlcNAc的工程菌。首先过表达了GlcNAc合成基因glmS、gna1,敲除GlcNAc代谢基因,实现了GlcNAc的从头合成。随后,通过酶筛选、敲除跨膜输出基因、强化合成途径、增加谷氨酰胺(glutamine,Gln)供应、关键酶葡萄糖胺-6-磷酸合酶(GlcN-6-phosphate synthase,GlmS)的半理性设计等方法,进一步提高GlcNAc产量。GlcNAc的代谢改造图见图1。本研究将为构建高效合成GlcNAc的重组益生菌奠定基础,对推动EcN作为底盘细胞在食品科学和营养领域的应用具有积极作用。
图1 EcN中从头合成GlcNAc的代谢改造图
Fig.1 Metabolic engineering for de novo GlcNAc synthesis in EcN
注:glmS:葡萄糖胺-6-磷酸合酶基因;gna1:葡萄糖胺-6-磷酸乙酰基转移酶基因;nagA:脱乙酰基酶基因;nagB:脱氨基酶基因;nagK:乙酰氨基葡萄糖激酶基因;nagE:乙酰氨基葡萄糖转运子基因;manX:甘露糖磷酸转运子基因;pgi:葡萄糖-6-磷酸异构酶基因;yqaB:果糖-1-磷酸磷酸酶基因;poxB:丙酮酸氧化酶基因;pta:磷酸乙酰基转移酶基因;ackA:乙酸激酶基因;pfkA:6-磷酸果糖激酶基因;pykA:丙酮酸激酶基因;Glu-6-P:葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate);Fru-6-P:果糖-6-磷酸(fructose-6-phosphate);GlcN-6-P:氨基葡萄糖-6-磷酸(glucosamine-6-phosphate);GlcNAc-6-P:N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸(N-acetylglucosamine-6-phosphate);Gln:谷氨酰胺(glutamine);Glu:谷氨酸(glutamate);PEP:磷酸烯醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate);FBP:果糖-1,6-二磷酸(fructose-1,6-bisphosphate);DHAP:磷酸二羟丙酮(dihydroxyacetone phosphate):GAP:3-磷酸甘油醛(glyceraldehyde-3-phosphate)。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株与培养基
菌株:TCBJ117(E.coli Nissle 1917ΔattB(lacUV5-T7)ΔendAΔompT),实验室保存;
LB培养基(g/L):胰蛋白胨10,酵母提取物5,氯化钠10。
发酵培养基(g/L):葡萄糖20,甘油1,酵母粉5,磷酸二氢钾13.5,磷酸氢二胺4,一水合柠檬酸1.7,硫酸镁1.4,1×微量元素,pH 7.0。
补料培养基(g/L):葡萄糖600,硫酸镁4,100×微量元素10 mL/L。
100×微量元素(g/L):柠檬酸铁10,七水合硫酸锌2.25,五水合硫酸铜1,一水合硫酸锰0.35,十水合硼酸钠0.23,钼酸铵0.11,二水合氯化钙2。
1.1.2 引物
本研究所用引物由天一辉远生物技术有限公司合成,如电子版增强出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044899,下同)。
表1 本研究所用菌株
Table 1 Strains in this study
菌株编号描述TCBJ117E.coli Nissle 1917ΔattB(lacUV5-T7)ΔendAΔompTG1TCBJ117ΔnagABG2TCBJ117ΔnagABΔmanXG3TCBJ117ΔnagABΔmanXΔnagEG4TCBJ117ΔnagABΔmanXΔnagEΔnagKG5TCBJ117ΔnagABΔmanXΔnagEΔnagKΔpoxBG6TCBJ117ΔnagABΔmanXΔnagEΔnagKΔpta-ackAG7TCBJ117ΔnagABΔmanXΔnagEΔnagKΔpoxB::T7-glnA
1.1.3 主要试剂
主要试剂:DNA聚合酶Primer Star Max,Takara公司;核酸标准ladder marker、DH5α感受态,北京全式金生物技术有限公司;硫酸卡那霉素(Kan)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)、琼脂粉、琼脂糖、酵母提取物和胰蛋白胨,Sigma-Aldrich贸易有限公司;FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit,南京诺唯赞生物科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
WIX-EP300电泳仪,北京韦克斯科技有限公司;UVP Gelsolo凝胶成像系统,德国Analytik Jena公司;ZQZY-108振荡培养箱,上海知楚仪器有限公司;LRH-150恒温培养箱,上海柏欣仪器设备厂;HVA-110高压湿热灭菌锅,日本Hirayama公司;5910 Ri台式低温离心机,德国eppendorf公司;SW-CJ-2FD超净工作台,苏净集团苏州安泰空气技术有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 基因敲除
采用Crisper-Cas9技术敲除底盘菌株的nagAB、nagK、nagE、manX、poxB、pta-ackA等基因[17]。
本研究所构建菌株见表1。
1.3.2 质粒构建
以E.coli K-12 MG1655的基因组为模板,用引物EcglmS-F和EcglmS-R(附表1)克隆出EcglmS的基因片段;委托苏州泓迅生物科技有限公司人工合成密码子优化后的来源于酿酒酵母的gna1基因,命名为Scgna1opt,利用引物Scgna1opt-F和Scgna1opt-R扩增Scgna1opt基因,凝胶电泳并切胶回收DNA片段。将上述回收的EcglmS和Scgna1基因片段通过无缝克隆连接到载体pETDuet上,构建表达质粒pET-EcglmS-Scgna1。其他质粒改造方法同上。本研究所构建菌株见表2。
表2 本研究所用质粒
Table 2 Plasmids in this study
质粒编号质粒描述pETpETDuet1购买自addgenepColApColADuet1购买自addgenepRSFpRSFDuet1购买自addgenepCDFpCDFDuet1购买自addgeneP1pET-EcglmS-Scgna1optpETDuet1含有EcglmS、Scgna1opt基因P2pColA-EcglmS-Scgna1optpColADuet1含有EcglmS、Scgna1opt基因P3pCDF-EcglmS-Scgna1optpCDFuet1含有EcglmS、Scgna1opt基因P4pRSF-EcglmS-Scgna1optpRSFDuet1含有EcglmS、Scgna1opt基因P5pRSF-BsglmS-Scgna1optpRSFDuet1含有BsglmS、Scgna1opt基因P6pRSF-CsglmS-Scgna1optpRSFDuet1含有CsglmS、Scgna1opt基因P7pRSF-EcglmS-Scgna1pRSFDuet1含有EcglmS、Scgna1基因P8pRSF-EcglmS-Cegna1pRSFDuet1含有EcglmS、Cegna1基因P9pRSF-EcglmS-Cegna1optpRSFDuet1含有EcglmS、Cegna1opt基因P10pRSF-EcglmS-Scgna1-pgipRSFDuet1含有EcglmS、Scgna1、pgi基因P11pRSF-EcglmS-Scgna1-yqaBpRSFDuet1含有EcglmS、Scgna1、yqaB基因P12pRSF-EcglmS∗54-Scgna1-yqaBpRSFDuet1含有EcglmS∗54、Scgna1、yqaB基因P13pRSF-EcglmS∗72-Scgna1-yqaBpRSFDuet1含有EcglmS∗72、Scgna1、yqaB基因P11∗M1～M39pRSF-EcglmS∗-Scgna1-yqaBpRSFDuet1含有EcglmS突变基因和Scgna1、yqaB基因
1.3.3 glmS突变株的构建
本研究采用全质粒扩增法构建含有glmS突变基因的重组质粒。在所需突变体位点处设计上下游引物(附表1),以表达野生型GlmS酶的质粒pRSF-EcglmS-Scgna1-yqaB为模板,使用PrimeSTAR Max进行全质粒扩增,并转化入E.coli DH5α感受态细胞中;次日挑取单菌落送天一辉远生物技术有限公司测序。将测序正确的质粒转化进G7菌株。
1.3.4 产量验证
摇瓶培养:一级种子液以1%(体积分数)接种量接到50 mL发酵培养基中,37 ℃振荡培养2～3 h,OD600nm达到0.6～0.8时,加入终浓度0.2 mmol/L IPTG诱导,25 ℃,220 r/min条件下继续诱导发酵72 h。
10 L发酵罐发酵:一级种子液以1%(体积分数)接种量接到100 mL LB培养基中,37 ℃,振荡培养4～5 h后,接入含4 L发酵培养基的10 L发酵罐中。初始温度30 ℃,pH 7.0,转速300 r/min,初始葡萄糖20 g/L,OD600nm达到20后,加入0.3 mmol/L IPTG,诱导温度为25 ℃。用氨水调节,使pH值维持在7.0。转速关联溶解氧≥40%时,提高转速;补糖关联pH≥7.01时补糖。
高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)检测法:Agilent 1260,示差折光检测器,HPX-87H柱(Bio-RadHercules,CA),流动相:5 mmol/L H2SO4,流速0.5 mL/min,柱温40 ℃,进样体积10 μL。
1.3.5 GlmS与底物分子对接及相互作用力分析
使用Discovery studio 4.5的CDOCKER模块将底物对接至GlmS活性中心,通过综合分析对接得分、底物在活性口袋中的空间定位及关键残基相互作用,系统评估对接构象的合理性。利用Discovery studio进行关键位点相互作用分析,并通过Pymol软件对结果进行三维可视化呈现。
2 结果与分析
2.1 合成GlcNAc基础底盘菌株的构建
本实验室之前已经通过基因编辑在EcN的attB位点敲入T7RNA聚合酶以使其可以识别T7启动子并启动外源基因表达[16];敲除了endA基因(编码核酸内切酶I),可以减少对外源基因的降解[18];敲除ompT基因(编码蛋白酶),减少蛋白酶对外源蛋白的降解[19],得到的菌株命名为TCBJ117。这些改造可以使外源基因(合成GlcNAc的相关基因)在EcN中稳定表达。本研究使用TCBJ117作为异源合成GlcNAc的起始菌株。EcN不能天然合成GlcNAc,需要过表达gna1,同时过表达glmS以加强GlcNAc途径[12]。本研究将来源于E.coli MG1655的glmS基因和来源于酿酒酵母(经过大肠杆菌密码子优化后)的gna1opt基因构建在pETDuet1质粒上,得到重组质粒pET-EcglmS-Scgna1opt(P1)。其次,为了防止GlcNAc降解,敲除nagAB基因,得到基础底盘菌株TCBJ117ΔnagAB,命名为G1。将重组质粒P1转化到G1中,得到GlcNAc合成菌株G1-P1。经过摇瓶发酵验证,G1-P1的GlcNAc产量达到1.9 g/L。
2.2 GlcNAc合成途径的优化
2.2.1 筛选表达载体
目的基因的表达水平是影响产量的关键因素,而选择不同拷贝数的表达质粒可以改变目的基因的表达水平[20],因此本研究尝试了不同拷贝数的表达质粒。将质粒pET-EcglmS-Scgna1opt上的EcglmS-Scgna1opt基因片段连接到载体pColADuet1、pCDFDuet或pRSFDuet上,得到重组质粒为P2-P4。重组质粒分别转化进菌株G1中,得到菌株G1-P2、G1-P2、G1-P3、G1-P4。经过摇瓶发酵,GlcNAc产量结果如图2所示,72 h发酵后,G1-P4的产量最高,GlcNAc产量达到2.8 g/L,即pRSFDuet做表达载体时产量最高。
图2 不同载体和不同来源基因的影响
Fig.2 Effects of different vectors and genes from different sources
2.2.2 筛选不同来源的基因
不同来源基因的活性差异较大[21],因此对关键基因做了筛选。首先,筛选glmS基因。分别以B.subtilis、C.glutamate的基因组为模板,分别克隆出BsglmS、CgglmS的基因片段。将BsglmS和CgglmS基因片段分别替换质粒P4中的EcglmS基因,构建出表达质粒pRSF-BsglmS-Scgna1opt和pRSF-CgglmS-Scgna1opt,命名为P5、P6。将P5、P6分别转化进菌株G1中,获得菌株G1-P5、G1-P6。经过摇瓶发酵,相比于G1-P4,G1-P5、G1-P6产量分别降低了25%、34%(图2),说明EcglmS活性最高。
此外,筛选了不同来源的gna1基因。来源于酿酒酵母、秀丽隐杆线虫的gna1基因,分别命名为Scgna1和Cegna1;经过E.coli密码子优化后的Cegna1,命名为Cegna1opt。以上基因片段替换pRSF-EcglmS-Scgna1opt上的Scgna1opt基因片段,构建出的表达质粒分别命名为P7、P8、P9。质粒转化到G1中,获得菌株G1-P7、G1-P8、G1-P9。经过摇瓶发酵验证,G1-P7的GlcNAc产量最高,达到4.6 g/L,说明Scgna1活性最高。
2.2.3 代谢途径的优化
EcN自身有运输GlcNAc、唾液酸乳糖等糖类的跨膜运输蛋白[12,22]。为了防止胞外的GlcNAc再被运回到胞内代谢,跨膜基因manX、nagE被迭代敲除,分别得到菌株TCBJ117ΔnagBΔnagAΔmanX、TCBJ117ΔnagBΔnagAΔmanXΔnagE,命名为G2、G3。将质粒P7转化进G2、G3,分别得到菌株G2-P7和G3-P7。相比于G1-P7,G2-P7和G3-P7产量分别提高了33%和53.5%,达到5.9 g/L和6.8 g/L。此外,敲除了nagK基因以防止GlcNAc代谢,命名为菌株G4。质粒P7转化进G4,得到G4-P7。相比于G3-P7,G4-P7的GlcNAc产量提高了20%,达到8.2 g/L。此外,为了减少发酵过程中乙酸的生成,分别敲除了poxB、pta-ackA基因[11],得到菌株TCBJ117ΔnagB ΔnagAΔmanXΔnagEΔnagKΔpoxB、TCBJ117ΔnagBΔnagA ΔmanXΔnagEΔnagKΔpta-ackA,命名为G5、G6。相比于G4-P7,菌株G5-P7的产量几乎不变,但是乙酸生成量减少50%,效果显著;G6-P7虽然乙酸生成量明显降低,但是GlcNAc产量也明显降低,可能因为该基因敲除影响了菌株生长(图3)。
图3 代谢途径优化的影响
Fig.3 Effects of metabolic pathway optimization
为了提高GlcNAc产量,本研究分别过表达了GlcNAc合成途径中的pgi、yqaB基因(图1)。把MG1655来源的pgi、yqaB基因分别克隆到P7质粒上,得到pRSF-EcglmS-Scgna1-pgi和pRSF-EcglmS-Scgna1-yqaB(P10、P11)。把质粒转化进G5,得到菌株G5-P10、G5-P11。相比于G5-P7,G5-P10产量降低,可能是pgi基因过表达影响了葡萄糖其他的代谢途径,如磷酸戊糖途径;G5-P11的GlcNAc产量提高14%,达到9.3 g/L,即,过表达yqaB有利于GlcNAc积累。
此外,GlmS反应需要辅因子Gln[11],为了再生Gln,需要过表达来自MG1655的glnA基因。由于glnA不是GlcNAc合成途径中必需的基因,不需要高表达,所以,把glnA基因整合到G4菌株的poxB位点,得到TCBJ117ΔnagBΔnagAΔmanXΔnagEΔnagKΔpoxB:T7-glnA(G7)。P11转化到G7中,得到菌株G7-P11。相比于G5-P11,G7-P11摇瓶水平的GlcNAc产量提高10%,达到10.2 g/L(图3)。
2.3 半理性改造GlmS
2.3.1 GlmS结构分析与突变位点的选择
研究发现,在大肠杆菌合成GlcNAc过程中,GlmS催化Fru-6-P生成GlcN-6-P,该反应作为合成路径的限速步骤[13]。根据参考文献,突变酶GlmS*54和GlmS*72可以降低产物GlcN-6-P对GlmS的活性抑制,以提高对底物Fru-6-P的催化效率[23]。以质粒P11为模板,通过定点突变得到质粒pRSF-EcglmS*54-Scgna1-yqaB、pRSF-EcglmS*72-Scgna1-yqaB,命名为P12、P13。将质粒转化进菌株G7中,获得菌株G7-P12、G7-P13。经过摇瓶发酵验证,G7-P12、G7-P13与G7-P11产量无明显差异(图3)。可能是因为在G7-P11中使用的Scgna1活性足够高,使得GlcN-6-P全部转化成了GlcNAc-6-P,不存在底物抑制效应。因此,本研究对GlmS进行改造,旨在提高GlmS活性。
基于对GlmS的晶体结构分析(PDB编码:4amv),GlmS单体由2个功能结构域组成,由一条18 Å长的氨通道连接[24]。本研究主要针对合成酶结构域进行改造以提升催化活性。与酶催化活性紧密相关的氨基酸残基多数位于底物结合口袋附近[25],为深入探究关键残基对酶活性的影响,本研究针对底物Fru-6-P附近6 Å范围内的部分氨基酸进行了突变。基于以下2个方面的考量:首先,在筛选出与底物相互作用的6 Å范围内所有氨基酸残基中,存在多个Ser残基,且Ser中的羟基与底物形成较强的氢键作用力,考虑到这些氢键可能对底物识别与催化过程至关重要,故不对Ser进行突变;其次,根据GlmS催化机理,E488、H504、K603是参与质子转移、维持酶活性和底物特异性的关键催化残基,故也不对其做突变[24]。因此最终选取了剩余的14个保守性较低的氨基酸位点进行丙氨酸扫描突变。具体包括以下氨基酸:T302、Y304、L346、Q348、E351、T352、T355、L381、L396、V399、E481、L484、K485、L486。图4为上述氨基酸的空间位置。
图4 GlmS底物结合口袋附近氨基酸
Fig.4 Residues in substrate binding pocket of GlmS
本研究提出了一种多维扫描突变策略,即首先将底物结合口袋处氨基酸进行丙氨酸(alanine,Ala)扫描,根据Ala扫描结果,将得到的关键残基按照以下原则进一步选择目标突变残基:a)增强疏水性:缬氨酸(V);b)引入离子键:赖氨酸(K)和天冬氨酸(D);c)引入氢键:丝氨酸(S);d)引入特殊化学键如二硫键:半胱氨酸(C)。
2.3.2 GlmS突变体筛选及发酵罐产量验证
本研究通过全质粒扩增法构建含有glmS突变基因的重组质粒,模板质粒为P11。将携带突变质粒转化至G7中,得到菌株G7-P11*M1到G7-P11*M39,根据1.3.4节方法进行GlcNAc摇瓶发酵产量的测定。
首先,将底物结合口袋附近的氨基酸突变成Ala,突变株G7-P11*M1-M14的GlcNAc摇瓶发酵产量结果如图5-A所示。该轮突变获得2个较优突变体,G7-P11*M7(Y304A)、G7-P11*M11(L381A)发酵72 h后,摇瓶产量为11.8 g/L和13.2 g/L,较G7-P11分别提升了12.38%和25.71%。L346、L486、L484位点突变为Ala后与野生型(wild type,WT)产量接近,由于缬氨酸相较于亮氨酸疏水性更强且具有更小的空间位阻,故将Y304、L346、L381、L484、L486位点分别突变为缬氨酸,得到突变株G7-P11*M15-M19。如图5-B所示,在该轮筛选中获得一个优异突变株G7-P11*M15(Y304V),摇瓶产量达12.0 g/L,较野生型菌株产量提升17.64%。在第一轮Ala扫描结果中,T352、T355、V399、E481、K485突变成Ala后,产量急剧下降,表明这些位点与底物及周围残基之间存在重要的相互作用力。针对这些位点,本研究对其进行多维度作用力的引入,包括引入离子键、氢键、特殊化学键如二硫键。故将T352、T355、V399、E481、K485分别突变成D、K(R)、S、C,得到突变株G7-P11*M20-M39,如图5-C所示。T355和T352位点的突变结果表明,除了突变为丝氨酸外,其余氨基酸突变均在不同程度上降低了GlcNAc产量;突变株G7-P11*M22(T352S)和G7-P11*M26(T355S)的GlcNAc产量分别为12.3 g/L和11.2 g/L,较野生型菌株分别提高了24.21%、13.13%。V399位点突变成带电性氨基酸(D、K)时,产量急剧下降,突变成半胱氨酸时,GlcNAc摇瓶产量下降为6.2 g/L,而突变成丝氨酸时,突变株G7-P11*M30(V399S)的产量提高了16.21%,产量为11.5 g/L。而对于K485和E481位点,仅当突变成同类型氨基酸才能恢复部分催化活力,说明这2个位点原有氨基酸的电荷特性在其催化功能实现过程中起着至关重要的作用。
A-菌株WT与G7-P11*M1至G7-P11*M14摇瓶水平的GlcNAc产量;B-菌株WT与G7-P11*M15至G7-P11*M19摇瓶水平的GlcNAc产量;C-菌株WT与G7-P11*M20至G7-P11*M39摇瓶水平的GlcNAc产量
图5 GlmS突变株的GlcNAc产量
Fig.5 GlcNAc yields of GlmS mutant strains
最优菌株G7-P11*M11(L381A)采用10 L发酵罐验证产量,发酵72 h,产量达到135 g/L(图6)。这为EcN高效合成GlcNAc奠定了基础。
图6 G7-P11*M11在10 L发酵罐中的GlcNAc产量
Fig.6 GlcNAc yield of G7-P11*M11 in 10 L bioreactor
2.3.3 GlmS突变体重要位点作用力分析
基于本研究所采用的突变策略,筛选发现 G7-P11*M11(L381A)、G7-P11*M15(Y304V)及G7-P11*M22(T352S)显著地提高了GlcNAc产量。为进一步从分子层面探究GlcNAc产量提升的内在机制,本研究对上述3个表现优异的突变体与底物Fru-6-P进行分子对接及相互作用力分析。
如图7-A和图7-B所示,L381A突变降低了与L356及L359周围的空间位阻效应,扩大了底物结合口袋;且L381与L356、L359形成较强的疏水区域,影响水分子在周围稳定和聚集,Ala的突变有效地减少了该区域无效的疏水堆积[25],这与L381A突变株产量提高而L381V产量下降的实验结果相一致;此外,L381A距离底物距离由原来的5.8 Å缩短为4.7 Å,增强了与Fru-6-P相互作用,有助于催化反应的进行,进而提升GlcNAc产量。如图7-C和图7-D所示,Y304V消除了原本苯环与周围残基存在π-烷基、π-sigma作用力,引入了与A299之间的烷基作用力;缬氨酸的突变降低了空间位阻效应以及增强了口袋附近的疏水性,更有利于催化反应进行。如图7-E和图7-F所示,T352位点突变成丝氨酸后,增强了与L355、L356、G301以及底物间的氢键作用,更有利于稳定催化结构;且丝氨酸具有更小的侧链,更易调整构象以适应结合口袋,提高结合效率。综合分析表明,底物结合口袋附近的残基在空间位阻效应、疏水性及氢键作用均能影响GlmS的催化效果,进而影响GlcNAc产量,这为后续继续半理性改造提升GlmS催化性能提供了改造思路。
A-L381;B-A381;C-Y304;D-V304;E-T352;F-S352
图7 GlmS野生型及突变体的关键位点与底物相互作用力的分析
Fig.7 Analysis of the interaction between substrates and key sites of GlmS wild-type and mutants
注:绿色虚线:氢键作用;蓝色:范德华力;紫色:烷基作用;红色:π-烷基作用、π-sigma作用。
3 结论
本研究首次以EcN为底盘菌株,通过代谢途径优化、关键酶的改造等方法构建高产GlcNAc的益生工程菌株。本文获得以下结论:a)通过关键基因glmS、gna1的筛选、强化GlcNAc合成途径(过表达pgi、yqaB)、提高辅因子Gln的供给等策略使GlcNAc产量提高了5.4倍,达到10.2 g/L。b)对关键酶GlmS改造,筛选到6个阳性突变株并解析了作用机理。其中,最优突变体L381A的摇瓶产量提高了25.7%,达到13.2 g/L,10 L发酵罐产量达到135 g/L,本研究为EcN高效合成GlcNAc奠定了基础。在后续的研究中,可以继续对GlmS阳性突变株进行组合突变来提高GlmS活性,同时利用全局调控策略优化GlcNAc代谢网络中各个模块的通量,进一步提高GlcNAc的合成效率。
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