胶原蛋白肽钙皮克林乳液的制备与其稳定性研究

固体颗粒在油水界面的不可逆吸附作用,使其稳定的皮克林乳液被广泛研究和应用[1]。与传统表面活性剂相比,皮克林乳液具有低毒性、高稳定性以及环境友好等显著优势,近年来在食品工业、药物递送和化妆品领域展现出广阔的应用前景[2]。传统无机颗粒存在生物相容性差和无靶向性等问题,使研究者将目光转向肽等天然生物大分子。

胶原蛋白肽是胶原蛋白经酶解后得到的低分子质量产物,具有两亲性结构,由于疏水性氨基酸残基与亲水性氨基酸残基共存,使得界面活性十分优异。近年来,研究表明胶原蛋白肽能够在疏水相互作用吸附于油滴表面,形成物理屏障,防止液滴聚集[3]。由于单一胶原蛋白肽在极端pH或高离子强度条件下容易发生界面脱附,导致乳液分层,所以单一胶原蛋白肽应用受限制。这些因素让肽等天然分子和其他物质的结合引起广泛关注。离子交联技术被广泛应用在蛋白质基乳液中,能显著增强乳液的稳定性。Ca2+结合比其他单价离子(如Na+、K+、Fe3+)更稳定,比Mg2+等二价离子的结合常数更高,Na+和K+仅能通过静电屏蔽作用削弱肽链间斥力,交联效果较弱,Fe3+在酸性条件下易引发肽的氧化,从而可能降低乳液的稳定性[4]。Ca2+能够与蛋白质的羧基或磷酸基团结合形成三维网络结构,提升界面膜的机械强度[5]。此外Ca2+的桥接作用可促进蛋白肽在油水界面的均匀分布,使液滴大小分布更均匀,改善乳液的持水性和持油性。WEN等[6]发现由酪蛋白磷酸肽和含有Ca2+的乳清蛋白构建的高压灭菌乳液具有较好的热稳定性和贮存稳定性。胶原蛋白肽本身具有生物相容性和靶向作用,加上钙离子的营养强化作用,使该乳液在功能性食品开发等领域具有独特潜力。并且肽存在靶向作用位点,可以实现钙离子定向补充,从而应用于药物性食品的研究。有研究表明,Ca2+交联可显著提高大豆分离蛋白乳液的耐热性。壳聚糖Ca2+复合物稳定皮克林乳液,实现对维生素E的高效包埋[7]。然而,关于胶原蛋白肽钙基皮克林乳液稳定性能尚不明确。

因此,本研究使用胶原蛋白肽与Ca2+交联构建胶原蛋白肽-钙,从而制备出稳定的胶原蛋白肽钙皮克林乳液。通过测定皮克林乳液的静置稳定性、粒径及粒径分布、光学显微镜、持水性、持油性和离心稳定性,探究不同胶原蛋白肽钙浓度和不同胶原蛋白肽钙和大豆油的油水比对胶原蛋白肽钙皮克林乳液性能的影响,为胶原蛋白肽钙的高值化应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

GB6783明胶,广东欧帝玛生物工程有限公司,于常温条件下保存至使用;食品级大豆油,益海嘉里金龙鱼食品集团股份有限公司;木瓜蛋白酶(BR,500 000 U/g)、碱性蛋白酶(BR,100 000 U/g)、胶原蛋白酶(BR,100 000 U/g),南宁庞博生物工程有限公司;吐温20(皂化值40.0～50.0)(化学纯),天津市科密欧化学试剂有限公司;异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)、尼罗红(Nile red,AR),上海麦克林生化科技有限公司;氢氧化钠、二水合氯化钙(AR),西陇科学股份有限公司。

1.2 仪器与设备

EF20K型pH计,梅特勒-托利多有限公司;GJ-18C干燥台式冻干机,上海博登生物科技有限公司;BHS-4数显恒温水浴锅,福州泰美实验仪器有限公司;FJ-200高速分散均质机,上海标本模型厂;SCF-108A激光粒度分析仪,珠海欧美克仪器有限公司;BA210Digital数码显微镜,麦克奥迪实业集团有限公司;MS20多重光散色分析仪,北京奥德利诺仪器有限公司;TCSSP8激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM),徕卡显微系统(上海)贸易有限公司;W21R高速冷冻离心机,湖南沪康离心机有限公司;H1650-W医用离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 胶原蛋白肽钙皮克林乳液制备

1.3.1.1 胶原蛋白肽制备

参考虞丹丹等[8]的方法稍作修改。将80 g明胶溶于1 L去离子水中,依次加入明胶质量0.2%的碱性蛋白酶、胶原蛋白酶和木瓜蛋白酶,于常温下缓慢搅拌至明胶充分溶解,调节pH至7.5。在50 ℃条件下水浴酶解6 h,酶解过程中持续搅拌,确保酶解反应充分均匀进行。酶解结束后,100 ℃条件下沸水浴灭酶5 min,之后溶液在4 ℃、10 000×g条件下离心30 min,收集上清液冷冻干燥,获得胶原蛋白肽粉末。

1.3.1.2 胶原蛋白肽钙制备

参考ZHENG等[9]的方法稍作修改。将胶原蛋白肽粉末溶于50 mL去离子水中,制作胶原蛋白肽溶液,溶液质量浓度分别为10、20、30、40、50 g/L,按照肽钙质量比4.5∶1加入水合氯化钙混合均匀,调节pH至9.0,在50 ℃条件下水浴反应40 min,形成肽钙。

1.3.1.3 胶原蛋白肽钙皮克林乳液制备

采用单一变量法,固定油水体积比为5∶5,将不同浓度10、20、30、40、50 g/L的胶原蛋白肽钙溶液与大豆油混合,加入100 μL吐温20;在胶原蛋白肽钙浓度为10 g/L的最优条件下,按油水体积比4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2将胶原蛋白肽钙溶液和大豆油混合,加入100 μL吐温20。在20 000 r/min条件下均质2 min,制备成胶原蛋白肽钙皮克林乳液。

1.3.2 胶原蛋白肽钙皮克林乳液测定

1.3.2.1 静置稳定性

参考魏梦园等[10]方法稍作修改。将新鲜制备的胶原蛋白肽钙皮克林乳液转移到透明玻璃瓶中,在4 ℃ 冷藏条件下静置贮藏,观察乳液表观相行为直观图并拍照记录,乳液第0天、第1天和第30天的外观图进行拍照记录,评估乳液的静置贮藏的稳定性。

1.3.2.2 粒径及粒径分布

参照刘永等[11]方法稍作修改。取适量新鲜制备的胶原蛋白肽钙皮克林乳液,用去离子水或缓冲液适当稀释,采用激光粒度仪测定,每个样品平行测定3次,记录乳液粒径和粒径分布,取平均值作为最终结果。

1.3.2.3 微观结构

取适量新鲜制得的胶原蛋白肽钙皮克林乳液,用去离子水稀释至适当浓度,在光学显微镜下观察,在不同放大倍数下拍摄代表性图像,观察乳液形貌及分散状态。参照WANG等[4]的方法,采用CLSM对乳液微观形貌进一步表征。将FITC和尼罗红分别溶于异丙醇(1 mg/mL),按1∶1体积比混合后加入胶原蛋白肽钙乳液。激发波长为488 nm和552 nm,分别激发FITC(绿色荧光)和尼罗红(红色荧光),其中绿色荧光代表胶原蛋白肽钙颗粒,红色荧光代表大豆油,用40×物镜进行观察。

1.3.2.4 多重光散射

采用MS20稳定性分析仪对胶原蛋白肽钙乳液进行分析,将新鲜制备的乳液样品缓慢注入专用圆柱形玻璃样品瓶中,样品液面高度保持一致。将样品瓶垂直置于仪器样品舱固定位,设置扫描参数为:扫描高度0～40 mm,分辨率0.06 mm,扫描速度12.5 mm/s,测试时间和温度分别为6 h和 25 ℃。此外,胶原蛋白肽钙乳液的稳定性指数通过仪器内置软件自动分析后获得。

1.3.2.5 持水性和持油性

参照夏光华等[12]方法稍作修改。取适量新鲜制得的胶原蛋白肽钙螯合物,离心分离,收集离心管底部析出的水层和上层游离的油层,分别称重,计算析出的水质量和油质量占初始乳液总质量的百分比,每个样品平行测量3次,取平均值。

1.3.2.6 离心稳定性

取适量胶原蛋白肽钙螯合物样品,置于离心管中,在20 ℃、8 000×g条件下离心30 min。离心后,观察样品是否分层并拍照记录。

1.4 数据处理

采用Excel、Origin 9.0软件进行实验数据分析,LSD方法用于显著性分析(P<0.05)。每组实验重复3次。

2 结果与分析

2.1 静置稳定性

不同胶原蛋白肽钙浓度和油水比下胶原蛋白肽钙乳液的静置稳定性,如图1所示。乳液在第1天和第30天均出现明显的乳析现象。随着胶原蛋白肽钙溶液的质量浓度从10 g/L逐渐增加至50 g/L,胶原蛋白肽钙皮克林乳液的静置稳定性逐渐下降(图1-a)。分层现象产生的原因可能是乳液中的界面膜破裂导致乳滴聚集,在油水密度差异下分层。胶原蛋白肽钙分子通过吸附于油水界面,形成单层界面膜,构建三维网络结构,能阻碍液滴间的聚集,维持乳液的均匀分散状态。低浓度下的胶原蛋白肽钙分散均匀,形成致密的界面膜,但肽浓度升高,油水界面逐渐达到吸附饱和,过量胶原蛋白肽钙颗粒难以锚定在界面,导致界面膜结构完整性被破坏,使乳液更容易分层[13]。随着油水体积比从4∶6增至8∶2乳液的静置稳定性增强(图1-b)。在第1天,油相小于60%的乳液出现不同高度的分层。这可能是由于水相比例过高,油水密度差较大导致在重力作用下水相下沉,导致乳液出现明显分层。随着油相的增加,在30 d时出现乳析高度随着油相的增加而减小的现象。油水比例可以平衡胶原蛋白肽钙分子在界面吸附均匀,从而影响液滴聚集现象。值得注意的是,油水体积比在7∶3和8∶2 时,乳液更稳定,肽钙形成三维交联网络结构,影响乳滴间的范德华力,使静电排斥力与范德华力动态平衡,增加空间位阻效应,从而提高胶原蛋白肽钙皮克林乳液稳定性[14]。

2.2 粒径及粒径分布

不同胶原蛋白肽钙浓度和油水比下胶原蛋白肽钙皮克林乳液的粒径及粒径分布,如图2所示。随着胶原蛋白肽钙浓度的增加,胶原蛋白肽钙皮克林乳液的粒径逐渐减小(图2-a)。当胶原蛋白肽钙质量浓度为50 g/L时,胶原蛋白肽钙皮克林乳液平均粒径显著低于其他浓度(P<0.05),并且胶原蛋白肽钙粒径微分分布更加集中(图2-b)。高浓度胶原蛋白肽钙更有效地降低油水界面张力,阻止油滴聚集,使大油滴更容易分散成小液滴,减少乳滴合并的可能性从而使乳液粒径更小[15]。这一现象与JIANG等[16]研究结果相符,肽分子充分覆盖油界面膜的强度是影响乳液稳定性的重要因素。随着胶原蛋白肽钙和大豆油的油水比增加,胶原蛋白肽钙乳液的粒径增加(图2-c),有新的峰出现并且粒径分布朝粒径大的方向移动(图2-d)。

产生该现象可能的原因是,低油水比条件下,水相比例高,界面吸附密度增加,界面膜结构完整,增加空间位阻作用。致密界面膜能够抵抗剪切力破坏,乳滴聚集粒径减小且粒径微分分布范围变窄[17]。油水两相比例增加,胶原蛋白肽钙含量少,难以在界面形成致密的交联网络,过量油相可能以较大的乳滴形式存在,乳滴因颗粒吸附不足而发生絮凝从而导致粒径分布朝粒径大的方向移动。

2.3 微观结构

不同胶原蛋白肽钙浓度和油水比下胶原蛋白肽钙皮克林乳液的光学显微镜和CLSM图,如图3和图4 所示。不同质量浓度(10～50 g/L)的胶原蛋白肽钙皮克林乳液,在10×显微镜下的乳滴分布均匀。随着油水比的增加胶原蛋白肽钙皮克林乳液乳滴数量增加并且粒径增大(图3-b)。低油水比条件下,水相体积相对增加,在乳化过程中,油相会被水相更充分地分散,油水界面张力降低,形成更小粒径的液滴[18]。当油相比例增加时,胶原蛋白肽分子可能因油相溶剂化作用而降低界面吸附效率,导致钙离子在油水界面的排布密度下降,无法有效阻止液滴聚并,进而引起粒径增大。李真等[19]制备的改性淀粉基鱼油皮克林乳液也有相似的趋势,油相体积分数的增加导致比表面积增加,颗粒能在空间中充分扩散,吸附至油水界面使乳液粒径增加。

CLSM可以直观表示不同浓度和油水比条件下胶原蛋白肽钙颗粒在油水界面的分布情况。CLSM图像显示,该胶原蛋白肽钙Pickering乳液为O/W型。随着胶原蛋白肽钙浓度的增加,乳滴粒径减小。低质量浓度(10～20 g/L)下的胶原蛋白肽钙皮克林乳液分布不均匀且存在少量大液滴,当胶原蛋白肽钙质量浓度超过30 g/L时,红色乳滴粒径显著减小并且紧密排列,乳滴分散性提高且无明显聚结现象(图4-a)。高浓度的胶原蛋白肽钙颗粒能够在油水界面形成连续的覆盖层,有效阻止液滴之间的聚集。这与图2中测得的粒径及粒径分布结果一致。固定胶原蛋白肽钙质量浓度为10 g/L时,不同油水比乳液的CLSM图像如图4-b所示。当油相体积分数为40%时,乳滴出现明显的絮凝和团聚现象,而80%油相下的乳滴大小分布均匀,胶原蛋白肽钙颗粒在油水界面形成一层致密的刚性屏障。这是由于低油相乳液中的部分颗粒可能无法有效吸附在油水界面导致界面覆盖不完全,从而容易发生絮凝和团聚;而高油相可以给乳滴提供充足的连续相,能够有效分散水相液滴促进乳滴大小分布均匀[20]。

2.4 多重光散射

通过动态监测背散射光强度变化,定量分析乳液的分层行为及稳定性特征。不同胶原蛋白肽钙浓度和油水比下胶原蛋白肽钙皮克林乳液的多重光散射图如图5所示。不同浓度的胶原蛋白肽钙皮克林乳液均表现出相似的趋势:随着时间延长,样品底部的背散射光强逐渐降低,而顶部则呈现光强逐渐升高的特征。说明乳液体系均出现不同程度的乳析现象,仅通过调控浓度无法形成稳定的皮克林乳液。当胶原蛋白肽钙质量浓度为10 g/L时,不同油水比下制备的Pickering乳液结果见图5-f～图5-j。油水比4∶6和5∶5(体积比)时,同样观察到样品底部随时间的变化背散射光逐渐降低,顶部背散射光逐渐增加,乳液析出水层高度均大于20 mm(图5-f和图5-g),乳液体系中出现明显的相分离现象。

随着油水比的增加,析出水层高度逐渐降低。在油水比为8∶2(体积比)时样品背散射光随着时间的延长而增大,不会出现明显的差值,此时胶原蛋白肽钙皮克林乳液无分层现象并且稳定性最佳。这也与乳液的静止稳定性(图1)结果一致。

稳定性指数越小,说明乳液体系越稳定。不同胶原蛋白肽钙浓度和油水比下胶原蛋白肽钙皮克林乳液的稳定性指数,如图6所示。不同浓度胶原蛋白肽钙的稳定性指数随时间的延长呈现上升趋势,乳液体系均出现乳析现象且稳定性较差(图6-a)。这可能是由于油水比为5∶5(体积比)时,油相和水相的表面张力可能无法达到平衡,不同浓度的胶原蛋白肽钙颗粒对相分离的抑制作用有限,乳液体系处于相分离的临界区域从而难以维持稳定的油水界面的稳定导致乳液分层。这也跟YU等[21]研究的不同低浓度明胶稳定的Pickering乳液的部分实验结果一致。随油相比例升高,胶原蛋白肽钙皮克林乳液稳定性指数显著降低,油水比8∶2(体积比)时,胶原蛋白肽钙皮克林乳液稳定性指数最小且曲线几乎呈水平直线,乳液稳定性最佳(图6-b)。油水比增加使胶原蛋白肽钙颗粒在油-水界面的吸附效率提高,界面膜强度增大,且油滴均分散在连续油相中使颗粒重力沉降效应减弱,乳液稳定性显著提升[17]。

2.5 持水性和持油性

不同胶原蛋白肽钙浓度和油水比下胶原蛋白肽钙皮克林乳液的持水和持油性,如图7所示。持水性和持油性与油水界面膜的稳定性有关。随着胶原蛋白肽钙质量浓度的增加,持水性与持油性而减小,并且均在肽质量浓度为10 g/L时达到峰值(图7-a和图7-b)。产生该现象可能的原因是,低浓度下的胶原蛋白肽钙分子能够有序吸附在油水界面,形成结构紧密的界面膜,阻止水相和油相的流失,发挥界面屏障作用。而随着肽浓度增加,过量的肽分子在界面上相互竞争吸附,导致界面膜排列紊乱、结构疏松,屏障功能受损,最终表现为持水性和持油性下降[22]。随着油水比逐渐增加,乳液的持水性与持油性显著提高(P<0.05)(图7-c～图7-d)。这是由于低油水比条件下,油相不足,乳液粘度降低,水的蒸发和流失增加,从而降低了乳液的持水性。油相增加使胶原蛋白肽钙在油水界面处的浓度相对降低,但乳化剂分子之间的相互作用增强,乳化剂在油相中分布更加均匀,使得界面膜更加致密和稳定。这种致密的界面膜能够有效阻止水相和油相的流失,提高乳液的持水和持油性[23]。HUO等[24]的研究也表明了,液滴分布影响界面膜机械强度和网络结构,从而能影响对水相和油相的束缚能力。

2.6 离心稳定性

不同胶原蛋白肽钙浓度和油水比下胶原蛋白肽钙皮克林乳液的离心稳定性,如图8所示。随着胶原蛋白肽钙溶液的质量浓度从10 g/L增至50 g/L,乳液的离心稳定性显著下降(图8-a)。产生该现象可能的原因是,低浓度条件下,胶原蛋白肽分子和钙离子交联作用形成机械致密界面膜,抵抗离心力作用,减少乳滴聚集。随着的胶原蛋白肽钙浓度增加,油水界面吸附饱和,界面膜结构松散化,肽分子从界面脱离成游离态。游离肽分子会因为疏水相互作用和钙离子桥接成聚集体,破坏原有的界面膜结构,Ca2+的静电屏蔽效应受影响,影响乳液在离心条件下稳定性[25],该现象和乳液持水性和持油性相符(图7)。MUHAMMAD等[26]的研究也表明,Ca2+交联形成致密界面膜影响油水界面的吸附和膜机械强度,从而影响离心力和液滴聚集。随着胶原蛋白肽钙和大豆油的油水比例增加,胶原蛋白肽钙螯合物乳液的离心稳定性增大(图8-b)。产生该现象可能的原因是低油水比条件下,油相比例少,界面吸附密度不足,界面膜结构不完整,连续相黏度较低,空间位阻作用减弱。导致薄弱界面膜受剪切力破坏,油水两相分离速度快。而油水比提高有助于胶原蛋白肽钙在界面形成致密的交联网络,界面膜机械强度增加,从而能抵抗离心作用力[27]。LIU等[28]的研究也表明,低油水比下界面吸附稀疏无法形成致密界面膜,离心时薄弱界面膜易被破坏。而高油水比下的乳液黏度高,有利于提高离心稳定性。

3 结论

本研究系统探究了不同质量浓度(10～50 g/L)和油水比(4∶6～8∶2,体积比)对胶原蛋白肽钙皮克林乳液性能的协同影响,并通过单因素实验优化其制备工艺。随着胶原蛋白肽钙溶液浓度的减小(10～50 g/L)和油水比的增加(4∶6～8∶2,体积比),胶原蛋白肽钙皮克林乳液的粒径,持水性、持油性和离心稳定性增大。此外,油水比为8∶2的胶原蛋白肽钙皮克林乳液稳定性指数最小且在30 d后虽有少许乳析现象但仍表现出良好的稳定性。综上所述,10 g/L和8∶2(体积比)油水比的胶原蛋白肽钙皮克林乳液,有利于胶原蛋白肽钙在油水界面形成致密吸附层从而增强乳液稳定性。研究结果为胶原蛋白肽钙稳定的皮克林乳液的开发与应用提供了新策略。

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