酿造食醋是由粮食、含淀粉物质或含糖物质,经微生物发酵酿制而成的液体调味品[1]。山西老陈醋、镇江香醋、四川保宁醋、福建永春醋为我国著名的四大名醋,其中山西老陈醋以绵、酸、香、甜、醇融于一体的独特口感以及源远流长的酿造史位居四大名醋之首[2]。山西老陈醋以高粱为主料,稻壳和谷壳为辅料,以大曲为发酵剂,经过蒸、酵、熏、淋、陈五大工艺酿制而成[3]。作为山西老陈醋的核心独特性,熏醅工艺旨在对结束醋酸发酵的醋醅施以高温作用。此过程催生了美拉德反应在内的多种化学反应,其结果是醋醅色度的显著加深,以及醇、酸、酯、醛、酮、酚和吡嗪等复杂挥发性香气成分的转化生成[4],这些物质共同赋予食醋特殊的风味和口感。作为食醋中熏香风味的贡献者,吡嗪类物质还具有多样的生理功能。研究已较为深入地阐明了其在健康促进与疾病治疗方面的作用机制,四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine,TMP)便是其中的典型代表[5-6]。
TMP,即川芎嗪,属于吡嗪类生物碱,分子式为C8H12N2,相对分子质量136.2[7]。TMP是源自中草药川芎根茎的一种主要活性生物碱,它在临床上具有扩张血管、抑制血小板聚集与血栓形成、改善脑缺血等多重作用,因此被广泛应用于缺血性心脑血管疾病,如冠心病等的治疗[3,8-9]。此外,TMP具有特殊的烤肉和炒坚果香气,天然存在于多种发酵食品中,例如可可制品、白酒、香醋、乳制品、面包中,其中TMP在食醋中含量较高[10]。并且国家标准GB/T 19777—2013《地理标志产品 山西老陈醋》明确规定,TMP是界定山西老陈醋的一项重要特征指标。
山西老陈醋,受多种微生物、开放和半开放发酵环境等因素影响,基质成分非常复杂,含有大量氨基酸、有机酸、脂类物质等[11]。因此要对山西老陈醋中的TMP进行测定,需要对样品进行合适的前处理。其中液液萃取(liquid-liquid extraction,LLE)[12]和固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)[13]是目前广泛使用的2种前处理技术。其中LLE结合HPLC是国标规定的TMP检测方法,该前处理设备要求不高,但由于操作人员掌握LLE技能的差异,最终样品的测量结果可能会有一定的误差。为提高萃取效率,LLE通常会用有机试剂进行第2次、第3次萃取,在操作过程中产生大量有机废液,容易造成环境污染。且TMP的萃取剂为三氯甲烷,对操作人员存在一定的健康风险。此外,一些食醋样品在萃取过程中乳化较为严重,分层不明显,可能会导致回收率不佳等问题。SPME在操作时易引入不挥发物质和水等,对色谱分析结果存在一定干扰[14]。
固相萃取(solid-phase extraction,SPE)技术基于色谱分离原理,通过选择性吸附与选择性洗脱实现对目标物的富集、分离和净化。该方法凭借样品和溶剂消耗量少、通用性强以及选择性好等优势,在样品前处理领域得到广泛应用[15]。本研究在系统考察文献方法并经过实验优化的基础上,建立了SPE结合GC-MS技术测定山西陈醋中TMP的分析方法,并与现行国标方法进行方法比对。应用所建立的方法对60余种市售食醋样品中的TMP含量进行了定量分析。结果表明,该方法操作简便、回收率高、准确性好,适用于大批量样品的快速处理。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
所有醋样均为市售样品,电商旗舰店或大型超市;TMP标准品(纯度99.9%、C8H12N2,CAS:1124-11-4),上海安谱璀世标准技术服务有限公司;三氯甲烷(色谱级)、甲醇(色谱级),上海麦克林生化科技有限公司;磷酸二氢铵(99.0%)、氢氧化钠(99.0%),上海源叶生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
TSQ9610型GC-MS、TriPlus RSH气相/气质自动进样器、TG-WAXMS(30 m×0.32 mm×0.25 μm)色谱柱、Vanquish Core高效液相色谱仪-紫外检测器、TG-WAXMS(30 m×0.32 mm×0.25 μm)气相色谱柱、AcclaimTM 120 C18 5 μm 120 A(4.6 mm×250 mm)液相色谱柱,美国Thermo Fishier Scientific公司;固相萃取仪,天津市恒奥科技发展有限公司;Poly-Sery HLB Pro SPE小柱(大粒径),安谱云实验用品(上海)有限公司;ME55/02电子天平,瑞士METTLER TOLEDO公司;超纯水机,美国MILLI-Q公司;EDAA-2300TH超声波清洗器,上海安谱实验科技股份有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 标准溶液配制
TMP标准储备液(2 000.00 mg/L):准确称取20.00 mg TMP标准品,置于10 mL棕色容量瓶中,以甲醇溶解并定容,于-20 ℃下避光保存。
TMP标准中间液(200.00 mg/L):吸取此储备液1 mL,用甲醇定容至10 mL,即得质量浓度为200 mg/L的标准中间液。
TMP标准工作液:采用逐级稀释法,以200 mg/L的TMP标准中间液为母液,使用甲醇溶液进行梯度稀释,最终配制0.1、1、5、10、20、40、100 mg/L的标准系列溶液用于HPLC、GC-MS分析,现配现用。
1.3.2 前处理操作
LLE:取10.00 mL样品,经氢氧化钠溶液碱化至pH>8.0后,以三氯甲烷为萃取剂进行2次萃取(每次5 mL),合并有机相。再以0.2 mol/L盐酸溶液(每次4.5 mL)对有机相进行反萃取,重复2次后合并水相后用重蒸水定容至10.0 mL,并经0.45 μm滤膜过滤,供HPLC分析。
SPE:取Poly-Sery HLB Pro SPE小柱,依次使用5 mL 甲醇和5 mL超纯水平衡小柱[16],醋样摇匀后取1 mL上样,样品依靠重力通过小柱。依次使用5 mL 50%(体积分数)甲醇水溶液淋洗,3 mL甲醇洗脱并收集洗脱液,随后用甲醇定容至5 mL并混匀,经0.22 μm有机微孔滤膜过滤后,进行GC-MS分析。
1.3.3 色谱条件
HPLC色谱条件:流动相:0.2 mmol/L磷酸二氢铵∶甲醇=6∶4(体积比);流速:0.8 mL/min;柱温:室温;进样量10 μL;检测波长:297 nm。
GC-MS色谱条件:载气:氦气,流速1.5 mL/min;进样口温度:250 ℃;升温程序:初始温度40 ℃(保持3 min);以8 ℃/min升至100 ℃(保持3 min);再以15 ℃/min升至240 ℃(10 min);进样量:1 μL(不分流模式)。
1.3.4 质谱条件
电离模式:电子轰击源(electron impact ion source,EI);电子能量为70 eV;离子源温度280 ℃;质谱接口温度:230 ℃;采用全扫描(full scan)模式定性,质谱检测器扫描范围:30～450 m/z;溶剂延迟时间:5 min;选择离子监测模式(selected ion monitoring,SIM)定量,TMP选择监测离子(m/z):136、54、53,定量离子136。
1.4 数据处理与统计分析
按照外标法计算TMP的含量[17]。所有市售样品TMP含量数据平行测定3次,结果以“平均值±标准差”的形式表示。采用SPSS统计软件进行数据差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 GC-MS色谱和质谱条件的选择
目前,已有文献报道用GC-MS法分析发酵产品中吡嗪类物质[12,18-21],本研究在现有文献报道基础上进一步开展分析技术优化。由于TMP属于极性物质,故本实验选用TG-WAXMS色谱柱,其固定相为强极性聚乙二醇,主要用于分析极性化合物,性能可靠且重现性好。在确定的优化条件下,TMP出峰尖锐,灵敏度高,相邻杂质峰分离度好,无明显干扰。按照1.3.4节方法进行全扫描分析,TMP标准溶液和前处理后的食醋样品总离子流色谱图(图1-a和图1-b)显示TMP的保留时间(retention time,RT)为11.78 min。样品质谱图(图1-c)经NIST谱库对比分析,确认该化合物为TMP,得分为87.19。结合TMP标准溶液的色谱图,最终确定TMP的保留时间为11.78 min,其定性定量离子(m/z)分别为:136、53、54。此外,图1-d为样品中TMP的典型SIM图,其呈现出平滑且尖锐的峰形,信号质量优异,说明该方法具有较高的选择性和可靠性。
a-TMP总离子流图;b-样品总离子流图;c-TMP质谱图;d-样品TMP SIM图
图1 TMP色谱图及质谱图
Fig.1 Chromatogram and mass spectrum of TMP
2.2 前处理优化
山西老陈醋中含有丰富的有机酸、各种氨基酸、糖类、酯类等成分,直接进行质谱分析时会对色谱柱造成污染,且基质成分会干扰目标物的出峰、响应强度、保留时间等,本节系统探究了前处理条件对TMP准确定性定量的影响。
根据TMP结构特性分别选择了C18(500 mg,6 mL)、Poly-Sery HLB Pro SPE小柱(500 mg,6 mL)对山西老陈醋基质进行净化处理[22]。按照1.3.2节SPE方法分别对C18、HLB小柱进行活化和上样,对2种小柱的流出液进行分析,评估2种SPE柱对TMP的保留效果。结果表明,C18柱的流出液中可见TMP高强度响应信号。这说明TMP在上样过程中已随样品基质流失,无法在C18柱上实现有效吸附。当用HLB柱处理样品时,在样品流出液和淋洗液中均未检出目标物,在洗脱液中有明显的目标物响应信号,说明HLB小柱对TMP有较好的保留效果。这是由于TMP属于中等级性化合物,HLB小柱的作用机理依赖于其特殊共聚填料:疏水组分二乙烯基苯用于保留非极性物质,亲水组分N-乙烯基吡咯烷酮则负责吸附极性物质,从而实现广谱保留[23-24],其对极性化合物的提取回收率较C18柱更高[25],故后续实验选择用HLB小柱对样品进行处理。进一步考察淋洗液、洗脱液对回收率的影响。
2.2.1 淋洗液对TMP回收率和基质效应的影响
不同的淋洗液极性有一定差异,因而对食醋样品中各类物质的去除能力也有所不同。本实验考察了纯水和一定比例的甲醇水作为淋洗液对基质效应和回收率的影响,结果表明,在使用纯水和50%甲醇水溶液做淋洗液时均不会将TMP从小柱上淋洗下来,且进一步比较两者的净化效果时发现,50%甲醇水溶液在去除杂质方面表现更优。由图2与图3可知,采用50%甲醇水作为淋洗液时,所得色谱图(图2)中杂峰数量显著减少,表明该条件可有效淋除样品中大部分色素类杂质,净化效果较好,有助于降低后续分析中的基质干扰。基于上述结果,本研究最终确定采用5 mL 50%甲醇水溶液作为淋洗液。
图2 经过50%甲醇水做淋洗液SPE净化处理的陈醋样品色谱图
Fig.2 Chromatogram of aged vinegar sample purified by SPE using 50% methanol-water as the eluent
图3 经过水做淋洗液SPE净化处理的陈醋样品色谱图
Fig.3 Chromatogram of aged vinegar sample purified by SPE using water as the eluent
2.2.2 洗脱液对TMP回收率的影响
为探究甲醇洗脱液的最佳体积分数,分别选择纯甲醇和含有95%、90%、80%、70%(体积分数)甲醇水溶液3 mL,在洗脱流速约1.5 mL/min、其余条件不变的条件下,按1.3.2～1.3.4节方法处理与测定,最终回收率结果见表1。
表1 不同洗脱液(甲醇体积分数)对TMP回收率的影响
Table 1 Effect of different eluents(methanol volume fraction)on the recovery of TMP
甲醇体积分数/%回收率/%123456平均回收率/%方差S10096.5497.4797.8998.74100.1296.4597.871.959596.7497.2596.8998.1495.3896.1496.880.899081.4882.7481.6580.7283.7581.7882.021.148064.1567.7866.3565.2164.1966.7465.742.157041.1242.1540.7843.1844.4541.9142.261.85
双总体t检验是一种统计推断方法,旨在通过比较2个样本的均值,来评估其所代表的总体均值是否存在显著性差异[26]。本研究通过双总体t检验来确定不同甲醇含量洗脱液回收率间差异,从而确定洗脱液中甲醇含量的最佳比例。将100%甲醇溶液的数据组作为参考组,利用t检验计算公式计算其他组数据的回收率与参考组间是否存在显著差异。统计结果表明,使用95%甲醇洗脱时,其回收率与纯甲醇无显著差异(t=1.615<t0.05/10)。然而,当甲醇含量降至90%、80%及70%时,t值均大于临界值,表明其回收率与纯甲醇洗脱液回收率差异显著,且TMP回收率随甲醇含量的减少呈下降趋势。此外,由于TG-WAXMS柱为极性柱,样品中含有水相可能对柱子寿命有一定损耗,故最终选择纯甲醇溶液为洗脱液。
2.3 方法学对比
2.3.1 线性范围、检出限和定量限
在1.3.3～1.3.4节所述分析条件下,对1.3.1节配制的TMP标准溶液系列分别用HPLC、GC-MS由低到高进行梯度浓度进样分析。通过拟合浓度(X)与峰面积(Y)数据绘制标准曲线,信噪比法确定的2种方法的检出限(limit of detection,LOD,S/N=3)和定量限(limit of detection,LOQ,S/N=10)。其结果如表2所示,在灵敏度方面,GC-MS方法展现出显著优势。GC-MS法检出限与定量限远低于HPLC法,这表明GC-MS方法检测痕量TMP的能力更强。在线性关系上,2种方法在各自线性范围内均表现出良好的线性,相关系数(r2)均大于0.999,GC-MS方法标准曲线的斜率远高于HPLC法,这表明其对浓度变化的响应更为灵敏。
表2 两种方法的线性范围、检出限和定量限
Table 2 Linear range,LOD,and LOQ for the two methods
测定方法线性方程相关系数(r2)样品定量限/(μg/L)样品检出限/(μg/L)HPLC法Y=0.65X+0.030.999 8291.81102.40GC-MS法Y=1 552 457.23X+37 652.810.999 91.030.31
2.3.2 精密度、重复性分析
为全面评估2种方法的可靠性,采用同一种食醋样品,分别对2种方法的精密度与重复性进行了对比。由表3与表4可知,HPLC与GC-MS方法的仪器精密度均表现良好,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均小于3.0%。重复性试验中,HPLC方法的RSD值略高,结果波动更为明显。这主要源于其采用的LLE前处理步骤复杂,易产生乳化现象,导致萃取效率不易控制,分析结果的波动性因而增大。综上所述,GC-MS方法在分析过程的稳定性和结果可靠性方面均显著优于HPLC方法。
表3 精密度试验结果(n=6)
Table 3 Results of the precision test(n=6)
序号HPLC法GC-MS法TMP含量/(mg/L)TMP平均含量/(mg/L)RSD/%TMP含量/(mg/L)TMP平均含量/(mg/L)RSD/%153.4849.61252.1050.59352.7552.061.8751.6150.622.28451.9649.63550.7452.64651.3550.62
表4 重复性试验结果(n=6)
Table 4 Results of the repeatability test(n=6)
测定方法TMP含量/(mg/L)123456平均含量/(mg/L)RSD/%GC-MS法49.8750.8650.2352.2452.7052.2451.36 2.32%HPLC法48.8848.75 53.95 49.25 52.66 52.49 51.00 4.50%
2.3.3 加标回收率试验
方法准确性的验证通过加标回收实验进行。结果如表5所示,GC-MS法与HPLC法的平均回收率均处于可接受范围(94.14%～102.12%),表明2种方法均能实现准确定量。然而,在精密度方面,GC-MS法展现出更优的稳定性,其回收率的RSD值低于HPLC法。HPLC法回收率波动较大,可能与其所依赖的传统LLE流程有关,该过程易受乳化等现象影响,引入误差。相比之下,基于SPE的GC-MS方法流程更可控,重现性更好。
表5 TMP的加标回收结果(n=3)
Table 5 Recovery results of TMP(n=3)
测定方法本底值/(mg/L)加标质量浓度/(mg/L)测量值/(mg/L)回收率/%平均回收率/%回收率RSD/%GC-MS法50.0041.2152.5262.2288.3595.0788.6995.9090.7493.86102.90100.72103.00103.92102.90101.72110.5497.31112.32100.16111.4598.7794.94102.1298.753.00HPLC法48.5238.4048.5057.0083.0592.0284.8595.7284.2394.4599.84105.8195.1096.0598.39102.83103.9996.84102.7994.36101.2791.2394.06101.5694.145.10
2.4 市售样品中TMP含量检测分析
实验对60余种市售食醋产品中TMP的含量进行测定(表6),结果表明地理标志产品山西老陈醋中TMP具有显著特征性。检测结果显示,所有地理标志产品的TMP含量均符合GB/T 19777—2013《地理标志产品 山西老陈醋》标准要求。具体而言,其最低检出值为34.80 mg/L;相比之下,其他食醋中TMP的含量显著偏低,为0.19～26.90 mg/L,且数据离散程度更高。统计分析证实,二者在TMP含量上存在显著差异(图4)。这一差异表明TMP可作为山西老陈醋的特征性指标,这与朱丽等[27]的研究结果基本一致。
表6 市售样品中TMP含量
Table 6 TMP content in commercially available samples
产品类别产地样品TMP含量/(mg/L)产品类别产地样品TMP含量/(mg/L)山西老陈醋(地理标志产品)山西陈醋(非地理标志产品)山西S0146.60±0.05S0247.52±0.01S0348.27±0.10S0443.93±0.06S0563.80±0.08S0647.51±0.05S0763.08±0.24S0848.24±0.13S0934.80±0.09S1036.26±0.53S1143.84±0.02S1246.60±0.04S1354.08±0.41S1453.74±0.32S1510.31±0.15S164.51±0.00S177.00±0.36S182.74±0.41S192.80±0.03S202.80±0.05S212.88±0.07S2217.63±0.01S2311.70±0.05S2412.63±0.09S255.20±0.04S265.29±0.12S277.76±0.24S283.52±0.11S295.72±0.05S303.15±0.13S316.90±0.04对照食醋四川镇江福建B014.92±0.03B0216.87±0.23B0317.22±0.11B0411.72±0.23B051.18±0.09B061.77±0.05B071.11±0.03B0817.79±0.10B0911.38±0.23B1011.46±0.08B113.03±0.30B124.82±0.21Z013.05±0.02Z022.95±0.10Z030.19±0.11Z0426.90±0.27Z052.94±0.06Z060.73±0.01Z070.37±0.26Z0820.79±0.04Z0915.92±0.02Z101.79±0.00F010.94±0.12F022.65±0.03F032.65±0.11F042.65±0.35F052.66±0.29F062.67±0.21F072.68±0.32F082.67±0.05F092.54±0.25
图4 不同类型产品中TMP含量
Fig.4 The contents of TMP in various product types
注:****表示P<0.000 1。
这种差异的形成与山西老陈醋独特的传统酿造工艺密切相关。首先,其以优质高粱和麸皮为主要原料,辅以谷糠和稻壳,丰富的淀粉和蛋白质为微生物发酵提供了良好的物质基础。更重要的是,山西老陈醋特有的熏醅工艺通过美拉德反应,不仅赋予产品特有的黑褐色泽和浓郁风味,还显著促进了TMP的生成。此外,根据GB/T 19777—2013《地理标志产品 山西老陈醋》规定,山西老陈醋需经过至少12个月的陈酿,期间通过“夏伏晒、冬捞冰”这一独特工艺使醋液浓缩至原体积的1/2以下,这一过程不仅提升了醋液的浓度、色泽和香气,更促进了TMP的进一步富集,从而形成了山西老陈醋特有的品质特征。相比之下,其他食醋(如镇江香醋)工艺重点不同,缺乏熏醅或类似长时间深度陈酿的工艺环节,因此TMP含量普遍较低且分布分散。
3 结论
本研究开发了一种基于SPE-GC-MS的技术,用于快速测定山西陈醋中的TMP含量。样品经过Poly-Sery HLB Pro SPE小柱净化处理后,用GC-MS进行测定,外标法进行定量。与现行国标方法相比,本方法操作更简便、灵敏度更高、结果准确可靠,更适用于大批量样品的高效分析。利用本实验所建立的方法对市售60余种食醋样品进行测定,结果表明地理标志保护产品山西老陈醋和非地标产品TMP含量有显著差异,这一差异表明TMP可作为山西老陈醋的关键特征性指标,为提高山西老陈醋产品质量提供保障。
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