枸杞作为我国“药食同源”的典型代表,既是营养丰富的保健食材,也是具有滋补肝肾、益精明目功效的传统中药材,其所富含的蛋白质、维生素、矿物质及活性成分可发挥增强免疫力、抗氧化等作用,在食品、保健品及中药领域应用广泛[1-4]。随着居民健康意识的提升,枸杞市场需求持续增长,但安全性始终是产业发展的核心前提,尤其是污染物的精准管控,直接关系到公众健康与产业口碑。
砷作为典型的蓄积性类金属污染物,可通过土壤、灌溉水等途径进入枸杞植株并富集[5-6]。其毒性并非由总含量决定,而是与形态密切相关:无机砷[亚砷酸盐As(Ⅲ)、砷酸盐As(Ⅴ)]被国际癌症研究机构列为1类致癌物,As(Ⅲ)甚至可引发急性中毒危及生命;有机砷毒性远低于无机砷,且易代谢排出[7-8]。然而,当前枸杞相关研究多集中于营养成分、药理作用及农药残留检测[9-12],针对砷含量的研究极少,更缺乏对砷形态分布的系统分析。但枸杞种植过程中土壤砷背景、灌溉水质,加工环节器具污染等因素均可能导致砷蓄积,即便微量也会因长期摄入带来健康风险。因此,开展枸杞中砷形态检测研究,是科学评估其安全性、制定质量标准的关键,对推动产业健康发展意义重大。
砷形态检测需经“提取-分离-检测”三大核心环节,其中提取效率与形态稳定性的平衡,以及砷本底干扰的去除,是决定检测结果准确性的核心瓶颈,也是当前技术研究的重点方向。在检测技术选择上,高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(high-performance liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry,HPLC-ICP-MS)联用技术凭借在线分离、单次进样多形态同步检测的优势,兼具ICP-MS高灵敏度、低检出限特性,已成为砷形态检测的首选技术,但该技术在枸杞样品分析中仍面临两大关键难题。
a)砷形态提取的技术挑战。样品提取是砷形态检测的基础步骤,需同时满足高效提取与赋存形态不变两大要求。目前主流提取方法包括酶解法与溶剂萃取法:酶解法适用于高蛋白、高脂肪的动物源性样品[13],而植物样品多采用水、盐酸、磷酸、甲醇等溶剂提取,且常辅以微波、加热、超声等辅助技术提升效率[14-17]。但实际操作中,提取溶剂的种类、浓度,辅助提取的温度、时间等参数,均可能导致砷形态发生转化:如As(Ⅲ)氧化为As(Ⅴ)或有机砷降解为无机砷,直接导致检测结果失真[18-19]。如何优化提取工艺,在最大限度提升枸杞中砷形态提取率的同时,完全避免提取过程中的形态转化,是保障后续检测准确性的首要前提。
b)砷本底干扰的去除难题。砷在环境中广泛存在,检测过程中容器、仪器管路及流动相均可能引入砷本底,其中流动相砷本底的去除难度最大,也是影响检测精度的关键障碍[20]。在HPLC-ICP-MS分析中,为实现无机形态及有机形态等多种砷形态的有效分离,常采用离子交换色谱梯度洗脱模式,但梯度洗脱过程中,仪器部件溶出及流动相本底含有的砷,会形成“本底鬼峰”。这些“鬼峰”不仅干扰砷形态的定性判断,易与样品中低含量砷形态峰重叠,还会导致定量结果偏高,严重影响检测准确性。尽管容器、管路的砷本底可通过酸洗等方式去除,但流动相砷本底因来源复杂(如试剂杂质、仪器溶出)、含量波动大,尚无成熟的高效去除方案,成为制约枸杞中低含量砷形态精准检测的核心技术瓶颈。
基于上述技术痛点,本研究以枸杞为研究对象,聚焦砷形态检测中的提取工艺优化与流动相砷本底去除两大核心问题,旨在建立枸杞中砷形态的HPLC-ICP-MS检测方法。通过筛选适配的提取溶剂与辅助提取技术,明确无形态转化的提取参数;构建高效的在线砷本底去除方案,最终实现枸杞中总砷含量与砷形态的精准、稳定测定。研究结果将为枸杞砷形态检测提供关键技术支撑,为食品监管部门制定枸杞砷污染防控标准提供科学依据,同时为枸杞的安全性评价与质量控制开辟新路径,助力枸杞产业健康可持续发展。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
标准物质砷甜菜碱(arsenobetaine,ASB,CAS:64436-13-1)、二甲基砷(dimethylarsenic,DMA,CAS:75-60-5)、亚砷酸[As(Ⅲ),CAS:36465-76-6]、砷胆碱(arsenocholine,AsC,CAS:71802-31-8)、一甲基砷(monomethylarsonic,MMA,CAS:2163-80-6)、砷酸[As(Ⅴ),CAS:7774-41-6],中国计量科学研究院;标准物质4-硝基苯基胂酸(nitarsone,NIT,CAS:98-72-6)、洛克沙砷(roxarsone,ROX,CAS:121-19-7)、阿散酸(4-aminophenylarsonic acid,ASA,CAS:98-50-0),德国Dr.Ehrenstorfer;卡巴胂(carbarsone,CA,CAS:121-59-5),国家食品药品监督管理所;对羟基苯胂酸(4-hydroxyphenylarsonic acid,NAPP,CAS:98-14-6),美国Chem Service。标准物质、配制母液及稀释液在使用前保存在4 ℃冰箱中。碳酸铵溶液,上海阿拉丁生化科技股份有限公司,作为分离砷形态的流动相,在使用前用0.22 μm无机滤膜过滤,最后于4 ℃贮存。硝酸、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、甲醇、乙腈,优级纯,国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
UltiMate 3000 HPLC系统、iCAPQ 电感耦合等离子体质谱仪,德国赛默飞;AG7(2 mm×50 mm),AS7(2 mm×250 mm)色谱柱,美国赛默飞;Ultraclave 超级微波,意大利莱伯泰科;Milli-Q超纯水系统,美国密理博。
1.3 实验方法
1.3.1 样品准备
所有枸杞样品从商场和市场随机购买,使用粉碎机粉碎后过100目筛子,过筛后的样品在4 ℃条件下保存。
1.3.2 枸杞中总砷的检测
称取粉碎后的枸杞样品0.5 g于聚四氟乙烯的消解罐中,加入5 mL体积分数为50%的硝酸溶液。在微波消解仪中消解,消解程序:15 min升温至160 ℃,然后160 ℃保持3 min,随后10 min升温至220 ℃,然后220 ℃保持15 min。将消解后的溶液使用纯化水转移至25 mL容量瓶中,使用超纯水多次洗涤消解管,定容至刻度,混匀。消解完成后用少量超纯水多次冲洗消解罐内壁,合并洗涤液,最终定容至25 mL,使用ICP-MS测定总砷。
1.3.3 枸杞中砷形态的提取
精确称取粉碎的枸杞样品0.5 g于15 mL离心管中,加入体积分数为0.9%的盐酸5 mL,充分混匀,将离心管置于烘箱中,95 ℃ 3 h,冷却至室温,8 000 r/min离心5 min,取上清液,用0.22 μm的滤膜过滤,将滤液储存于4 ℃,使用HPLC-ICP-MS进行砷形态的检测。
对5种砷形态提取方式进行评估,考察多种提取方式和提取溶剂的影响。提取方式包括:2种超声辅助提取、2种微波辅助提取和1种烘箱辅助提取;提取溶剂包括:纯水及体积分数为1%盐酸、1%磷酸、1%硝酸、1%硫酸、1%醋酸、50%甲醇和50%乙腈水溶液。
1.3.4 砷形态的分离与检测
11种砷形态使用HPLC-ICP-MS进行定性及定量分析,HPLC和ICP-MS串联,ICP-MS配石英雾化器,将色谱柱AG7接于进样六通阀之前,用于去除流动相中的砷本底,将色谱柱AS7接于进样六通阀之后,对提取后的样品进行分离,梯度洗脱条件见表1,同时做空白试验。
表1 枸杞中砷形态测定的色谱洗脱程序
Table 1 Chromatographic elution program for arsenic speciation determination in wolfberry
时间/min流速/(mL/min)400 mmol/L碳酸铵/%(体积分数)5 mmol/L碳酸铵/%(体积分数)00.4010040.401004.10.4109010.50.4109010.60.4257511.60.4257511.70.44060140.4406014.10.41000180.41000
1.3.5 提取效率的评估
为了考察不同提取方式和提取溶剂对枸杞中砷形态的提取效果,本研究通过考察提取的砷形态中砷的含量和微波消解直接测定总砷的含量进行对比,最终确定枸杞中砷的提取效率,提取率的计算如公式(1)所示:
提取率
(1)
2 结果与分析
2.1 样品的提取
在枸杞样品砷形态分析中,最终确定的优化方案需同时满足:1)对目标砷形态的高提取率;2)提取过程中各形态的化学稳定性。本研究系统评估了5种提取方法(包括2种超声辅助提取、2种微波辅助提取及1种加热辅助提取)与8种提取溶剂(纯水及体积分数为1%盐酸、1%磷酸、1%硝酸、1%硫酸、1%醋酸、50%甲醇及50%乙腈水溶液)的组合方案。实验采用分级筛选策略:首先通过提取效率指标初筛有效方法,继而通过形态稳定性验证排除可能导致砷转化的方案。
2.1.1 超声辅助提取
超声辅助提取因其高效、节能的特点,在天然产物活性成分提取领域得到广泛应用。针对枸杞中砷形态的提取需求,本研究采用2种典型超声辅助提取方法进行对比:一步提取法和分步提取法。其中一步提取法将样品与提取液混合后一次性完成超声处理,而分步提取法则通过多次超声-离心循环以提高提取效率。
2.1.1.1 超声一步提取
考察8种不同提取溶剂在50 ℃、50 min超声条件下的提取效果,样品粉碎称重后与溶剂混合超声,8 000 r/min离心5 min,取上清液,用0.22 μm的滤膜过滤,将滤液贮存于4 ℃,使用HPLC-ICP-MS进行砷形态的检测。结果(图1)显示,在一步提取法条件下,8种提取溶剂对枸杞中砷形态的提取率存在显著差异。具体表现为:甲醇的提取率最低,仅为37.2%,而硫酸的提取率最高,达到71.2%。所有溶剂的提取率均未达到预设的提取要求,这一结果可能与一步提取法中溶剂单次接触样品导致的提取不充分有关。值得注意的是,不同酸类溶剂的表现呈现梯度差异,其中硫酸(71.2%)>硝酸(67.3%)>盐酸(60.4%)>磷酸(58.3%),表明强酸环境更利于砷化合物的溶出。有机溶剂组中,乙腈(66.9%)的提取效果优于甲醇(37.2%),可能与乙腈的极性和渗透性更强有关。结果提示,当前一步提取法的工艺参数(如超声时间、温度)或需优化,同时需进一步验证分步提取法是否能通过多次提取突破效率瓶颈。
图1 不同提取方式及溶剂对枸杞中砷形态提取率的影响
Fig.1 Effect of different extraction methods and solvents on the extraction efficiency of arsenic species in wolfberry
结果表明,8种提取溶剂的提取率为37.2%～71.2%,甲醇的提取率最低,为37.2%,硫酸的提取率最高,为71.2%,在这种提取方式下,这8种提取溶剂均没有达到提取要求。
2.1.1.2 超声辅助多步提取
与超声辅助一步提取法相比,本方法采用如下操作流程:在50 ℃条件下超声处理50 min,随后以8 000 r/min离心5 min,取上清液;再向沉淀中重新加入提取溶剂,重复上述提取步骤2次,最终合并所有上清液,经0.22 μm滤膜过滤后,将滤液于4 ℃保存,并采用HPLC-ICP-MS进行砷形态分析。实验结果表明,8种提取溶剂的提取率为40.6%～81.6%,其中水的提取率最低(43.9%),硫酸的提取率最高(81.6%)。与超声一步提取法相比,本方法使各溶剂的提取率均有所提高,且其回收率仍未达到理想水平。
2.1.2 微波辅助提取
微波辅助提取包括2种方式:a)样品加入提取溶剂后,当天直接使用微波消解仪进行提取;b)加入提取溶剂后静置过夜,次日再进行微波辅助提取。本研究对这2种提取方式进行了系统评价(图1)。
2.1.2.1 微波辅助提取
精确称取0.5 g粉碎后的枸杞样品置于聚四氟乙烯罐中,分别加入5 mL 8种提取溶剂,充分混匀后,于微波消解仪中95 ℃条件下进行提取50 min。提取完成后,将样品以8 000 r/min离心5 min,取上清液经0.22 μm滤膜过滤,滤液于4 ℃贮存,并采用HPLC-ICP-MS进行砷形态分析。实验结果显示,8种提取溶剂的提取率为45.3%～95.3%,其中甲醇的提取率最低(45.3%),磷酸的提取率最高(95.3%),其余溶剂的提取率均低90%。尽管磷酸表现出较高的提取率,但存在滤膜通过性差的问题,因此该提取方式仍非理想选择。
2.1.2.2 浸泡-微波辅助提取
本方法与当天提取的区别在于:样品加入提取溶剂后静置过夜,翌日再进行微波辅助提取。实验结果表明,8种提取溶剂的提取率扩大至58.5%～108.3%,甲醇提取率最低(58.5%),磷酸提取率最高(116.3%)。与当天提取相比,所有溶剂的提取率均有提高,其中盐酸和硝酸的提取率分别达到108.3%和102.3%,处于较理想范围内。尽管磷酸提取率较高,仍存在过滤困难的问题,因此最终选择硝酸及盐酸作为提取溶剂。
2.1.3 加热辅助提取
取粉碎后的枸杞样品,精确称量0.5 g至15 mL离心管中,向各离心管分别加入5 mL不同类型的提取剂,经涡旋充分混匀后,将离心管置于加热器中,在95 ℃条件下恒温提取3 h。提取结束后,待样品体系冷却至室温,以8 000 r/min的转速离心5 min,收集离心后的上清液。上清液经 0.22 μm微孔滤膜过滤,所得滤液于4 ℃避光条件下贮存,采用HPLC-ICP-MS对样品中砷形态进行定性与定量分析。
结果显示,使用加热辅助提取,8种提取剂对砷形态的提取效率为48.9%～115.4%。甲醇溶液的提取效率最低,仅为43.2%;硫酸溶液的提取率最高达 117.3%。硝酸溶液(92.7%)、盐酸溶液(98.9%)及磷酸溶液(103.7%)的提取率均高于90%。需注意的是以磷酸溶液作为提取剂时,上清液仍存在滤膜过滤阻滞现象,可能导致后续检测流程的效率降低。综合提取效率、加标回收率及实际操作可行性,在本实验设定条件下,硝酸溶液、盐酸溶液及硫酸溶液为枸杞样品砷形态提取的适宜溶剂。
2.1.4 砷形态转化评估
通过对提取率的研究,确定了5种适宜的提取方法,分别为:以硝酸或盐酸为提取溶剂的微波辅助提取法,以及以硝酸、盐酸或硫酸为提取溶剂的热辅助提取法。除提取率外,砷形态的转化情况也需纳入评估范畴。本研究采用质量浓度为5 μg/L 的砷形态混合标准溶液,对上述5种提取方法进行砷形态转化评估,实验结果见图2-A。
A-不同提取方式及溶剂下砷形态转化的评价;B-不同盐酸体积分数对枸杞中砷形态提取率的影响及趋势分析;C-不同提取时间对枸杞中砷形态提取率的影响及趋势分析;D-不同提取温度对枸杞中砷形态提取率的影响及趋势分析
图2 不同条件下枸杞中砷形态提取结果
Fig.2 Arsenic speciation extraction results in wolfberries under different conditions
以硝酸为溶剂的微波辅助提取结果显示:As(Ⅲ)(2.98 μg/L)、ASC(3.58 μg/L)及ASA(1.85 μg/L)的测定值显著降低,而As(Ⅴ)(7.21 μg/L)及NAPP(9.65 μg/L)的测定值显著升高,11种砷形态的平均测定值为5.02 μg/L。以盐酸为溶剂的微波辅助提取结果显示:As(Ⅲ)(3.24 μg/L)、ASA(0 μg/L)与CA(4.02 μg/L)的测定值显著降低,As(Ⅴ)(9.65 μg/L)与NAPP(8.45 μg/L)的测定值显著升高,11种砷形态的平均测定值为5.02 μg/L。上述结果表明,在微波辅助提取条件下,砷形态的分布发生改变。As(Ⅲ)、ASC、ASA及CA测定值降低并非因物质损失,而是提取过程中砷形态发生转化所致。
以硝酸为溶剂的热辅助提取结果显示:As(Ⅲ)(4.01 μg/L)、CA(4.23 μg/L)与ASA(2.36 μg/L)的测定值显著降低,As(Ⅴ)(5.43 μg/L)与NAPP(8.85 μg/L)的测定值显著升高;其余6种砷形态的测定值为4.89～5.12 μg/L,11种砷形态的平均测定值为4.98 μg/L。
以硫酸为溶剂的热辅助提取结果显示:NIT(0 μg/L)的测定值显著降低,CA(10.86 μg/L)的测定值显著升高,11种砷形态的平均测定值为5.03 μg/L。
上述结果表明,热辅助提取过程中,As(Ⅲ)、CA、ASA及NIT的含量发生明显改变,且硝酸对砷形态的影响与微波辅助提取中硝酸的作用效果相似,因此硝酸与硫酸均不适宜作为提取溶剂。
当以盐酸为热辅助提取的溶剂时,11种砷形态的测定值为4.91～5.05 μg/L,平均测定值为4.99 μg/L,形态稳定性最佳。综上盐酸被选为最适宜的提取溶剂。
2.1.5 最终结果的确认
结果表明,盐酸是枸杞中砷形态提取的适宜溶剂,因此进一步对提取过程中的盐酸体积分数、提取时间及提取温度进行单因素考察,以确定最优提取条件。
2.1.5.1 盐酸体积分数的影响
精确称取0.5 g枸杞样品,置于15 mL离心管中,向离心管中加入5 mL不同体积分数的盐酸溶液,盐酸体积分数为 0%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.5%、2.0%。充分涡旋混匀后,将离心管放入烘箱,在95 ℃条件下恒温提取3 h。提取结束后,待样品体系冷却至室温,以8 000 r/min的转速离心5 min,收集上清液;上清液经 0.22 μm微孔滤膜过滤,滤液于4 ℃条件下避光贮存,最终采用HPLC-ICP-MS对砷形态进行测定。
结果显示,当盐酸体积分数为0%(即纯水提取)时,砷形态提取率仅为35.6%;随着体积分数浓度的升高,样品中砷形态的提取率呈逐步上升趋势;当盐酸体积分数达到0.9%时,提取率达到峰值,为99.8%;继续增加盐酸浓度,砷形态提取率未出现显著提升,表明体积分数0.9%为该提取体系下的最优盐酸浓度,具体实验结果见图2-B。
2.1.5.2 提取时间的影响
精确称取0.5 g枸杞样品,至15 mL离心管中。加入5.00 mL体积分数为0.9%的盐酸溶液,涡旋振荡3 min使充分混匀后,置于95 ℃恒温烘箱中进行梯度提取(时间梯度:0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 h)。提取结束后,将离心管置于冰水浴中冷却至室温,以8 000 r/min离心5 min,收集上清液。上清液经0.22 μm水系滤膜过滤,4 ℃避光保存,待HPLC-ICP-MS联用分析。
如图2-C所示,随着提取时间从0.5 h延长至3 h,砷形态提取率呈逐步升高趋势;当提取时间达到3 h时,提取率为99.8%,实现理想提取效果;继续延长至3.5 h,提取率未出现显著变化,表明3 h已能充分完成砷形态提取。进一步延长时间不仅无法提升提取率,还可能增加实验能耗与成本。因此,本实验确定枸杞样品砷形态提取的最佳时长为3 h。
2.1.5.3 提取温度的影响
精确称取0.5 g枸杞样品,置于15 mL离心管中,向每支离心管中加入5 mL体积分数为0.9%盐酸溶液,充分涡旋混匀后,将离心管置于烘箱内,分别在25、45、65、85、95、105、115、125 ℃的恒温条件下保持3 h。各温度组提取结束后,待样品体系冷却至室温,以8 000 r/min的转速离心5 min,收集上清液;上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤,滤液于4 ℃条件下避光贮存,最终采用HPLC-ICP-MS联用技术测定砷形态提取率。
结果表明,当提取温度为25 ℃时,砷形态提取率仅为52.3%,且在25～65 ℃,随着温度升高,提取率变化无显著差异;当提取温度升高至85 ℃时,提取率出现明显跃升,达到90.1%;继续升温至 95 ℃时,提取率进一步提升至 99.8%;当温度达到105 ℃和115 ℃ 时,提取率分别为97.2%和 96.3%,呈小幅下降趋势,且95～115 ℃提取率均处于90%～110%的合格区间,但需注意的是,当提取温度达到100 ℃及以上时,提取溶剂会因达到沸点而发生剧烈汽化,易导致离心管内溶剂溢出,不仅造成样品损失,还可能影响实验安全性与重复性。综合考量提取率、实验安全性及操作稳定性,最终确定本实验中枸杞样品砷形态的最优提取温度为95 ℃(图2-D)。
为建立枸杞中砷形态的高效、可靠提取方法,本研究首先对5种提取方式及8种提取溶剂展开系统性考察,筛选过程先评估提取效率,后验证形态稳定性:第1步以提取率为核心评价指标,通过对比分析初步筛选出提取率达标的提取方式与溶剂组合;第2步针对初步筛选合格的方案,进一步聚焦提取过程中砷形态的转化情况,以此保障后续检测环节的定性准确性与定量可靠性。
结果表明,部分提取方式或溶剂虽能实现较高的砷形态提取率,满足提取率的基础要求,但在提取过程中会诱发砷形态发生转化,导致检测结果无法真实反映样品中砷形态的赋存分布特征。经综合验证发现,采用热辅助提取方式搭配盐酸提取溶剂的组合方案,不仅可达到满意的提取效率,还能有效规避提取过程中砷形态的转化问题,从根本上确保了砷形态定性分析的准确性与定量检测的可靠性。基于上述研究结果,本研究最终确定枸杞样品中砷形态的最佳提取方法为:热辅助提取-盐酸溶剂体系。
2.2 流动相本底的去除
在多种砷形态的分离实验中,梯度洗脱是常用技术手段。其核心原理是通过动态调整流动相各组分的比例,改变流动相整体极性,从而使每1种目标砷形态都能获得适宜的容量因子(K),最终实现样品中所有砷形态组分在最短分析时间内的最佳分离效果。该技术具有显著优势,不仅能有效缩短分析周期,还可提升分离能力、改善色谱峰型,并进一步增加检测灵敏度,为砷形态的精准分离提供有力支撑。
砷作为一种典型的类金属污染物,在环境中分布广泛,这使得实验中作为流动相的缓冲盐、超纯水及相关容器极易受到砷污染。而由于多种砷形态的分离必须依赖梯度洗脱,在洗脱过程中,流动相中残留的砷污染会对测定结果产生干扰,具体表现为产生与目标砷形态保留时间重叠的“鬼峰”,且该“鬼峰”的响应值波动较大,直接影响测定结果的准确性,易导致假阳性或假阴性判定,给砷形态的定性与定量分析带来严重干扰。
本研究在砷形态分离过程中,选用碳酸铵作为流动相缓冲盐,并针对多个不同厂家的多批次碳酸铵产品开展了专项验证实验。结果显示,所有批次碳酸铵在As(Ⅴ)的特征出峰时间均出现了“鬼峰”,其中“鬼峰”对应的砷质量浓度最高可达2.41 μg/L;更值得关注的是,即便同厂家的碳酸铵,不同批次间“鬼峰”浓度差异也较为显著,例如某厂家的3个不同批次产品,其“鬼峰”质量浓度分别为0.35、1.32、2.41 μg/L,这种批次间的不稳定性进一步增加了砷形态检测的干扰风险。
针对元素形态检测中流动相本底干扰的难题,本研究创新性地提出了流动相本底在线消除方案:在六通阀前端串联一根AG7色谱柱(该色谱柱原设计为AS7色谱柱的预柱),通过优化装置连接方式实现本底与目标物的有效分离。其核心原理为:样品中的目标物不经过AG7色谱柱,仅流经后续的AS7色谱柱;而流动相需先通过AG7色谱柱。在分离程序初始阶段,碳酸铵浓度较低,流动相中含有的干扰物会被AG7色谱柱优先吸附,随后吸附了干扰物的流动相再进入AS7色谱柱;当洗脱过程中碳酸铵浓度升高时,AG7色谱柱上吸附的干扰物会被洗脱下来。由于样品与干扰物在流经路径上的差异(样品仅经过AS7,干扰物先经AG7再到AS7),干扰物与样品中目标物的保留时间产生明显差值,从而实现流动相本底干扰的有效消除,具体连接方式详见电子版增强出版附图1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044946)。
为验证该技术的有效性,本研究开展了系列对比实验,结果如图3所示。a)未接AG7色谱柱的对照实验:仅进行梯度洗脱程序而不进样,色谱图出现一个明显的色谱峰(图3中的A),该本底峰保留时间比较固定,但是色谱峰的响应变化较大。在六通阀前不接AG7预柱时,进样11种砷形态混合标准溶液(各砷形态浓度一致),结果显示As(Ⅴ)的响应值显著高于其他砷形态(图3中的B),而且As(V)的保留时间和空白进样时的保留时间相同。b)串联AG7色谱柱的验证实验:在六通阀前接入AG7色谱柱后,再次进样11种砷形态混合标准溶液,结果显示As(Ⅴ)的保留时间后出现一个新色谱峰,同时AsⅤ的峰面积显著降低(图3中的D)。为确认新色谱峰的来源,仅进行梯度洗脱程序不进样,发现新峰位置处出现清晰色谱峰(图3中的C),证明流动相本底与目标化合物已实现彻底分离。
A-六通阀前不接本底去除柱,本底色谱图;B-六通阀前不接本底去除柱,砷形态混合标准溶液(5 μg/L)色谱图;C-六通阀前接本底去除柱,本底结果色谱图;D-六通阀前接本底去除柱,砷形态混合标准溶液(5 μg/L)色谱图;1-本底;2-As(Ⅴ)和本底;3-CA;4-NIT;5-NAPP;6-本底;7-As(Ⅴ)。
图3 砷形态本底去除色谱图
Fig.3 Chromatograms of online background removal technology
综上,本研究建立的流动相本底在线去除技术,可有效改善砷形态分离中梯度洗脱带来的本底干扰问题;同时,该技术具有良好的通用性,可拓展应用于其他元素形态的检测,为提升元素形态测定结果的准确性提供了可靠解决方案。
2.3 方法评价
对于一种分析方法的评价最主要是看它能否正确地反映待测物质在样品的含量,因此对本研究建立的枸杞中砷形态的测定方法进行考察。为了验证本方法的可靠性,对方法的线性、检出限、定量限、准确度及精确度进行考察,结果见表2。
表2 HPLC-ICP-MS法测定枸杞中11种砷形态的分析方法特性研究
Table 2 Characteristics of the developed analytical procedure for determination of eleven arsenic species in wolfberry by HPLC-ICP-MS
砷形态检出限/(μg/kg)定量限/(μg/kg)2.5 μg/kg(n=3)5 μg/kg(n=3)25 μg/kg(n=3)回收率/%变异系数/%回收率/%变异系数/%回收率/%变异系数/%ASB0.0330.10898.62.5105.22.897.63.5DMA0.0890.29597.23.696.73.596.53.8As(Ⅲ)0.0370.12195.64.797.44.898.73.9AsC0.0460.153101.83.196.32.896.82.8MMA0.0730.24296.82.998.72.999.63.3ASA0.0790.26398.42.699.53.698.74.1As(Ⅴ)0.0900.29792.35.890.64.399.33.9CA0.1210.39996.74.696.83.697.83.0NIT0.1250.412102.74.994.82.999.52.7NAPP0.1290.42596.34.897.83.196.82.6ROX0.1210.40098.74.296.72.797.62.9
本方法的线性范围为0.05～100 μg/L,线性关系良好(R2>0.999)。检出限与定量限分别根据3倍和10倍的信噪比(S/N)进行计算。11种砷形态[包括ASB、DMA、As(Ⅲ)、AsC、MMA、ASA、As(Ⅴ)、CA、NIT、NAPP和ROX]的检出限为0.033～0.129 μg/kg,定量限为0.108～0.425 μg/kg,均低于文献中多数报道结果。由于砷形态易发生相互转化,现有可靠标准物质较为有限,为验证方法准确性,本研究采用加标回收实验进行评估。在枸杞样品中分别添加2.5、5、25 μg/kg水平的标准品,结果显示所有砷形态的加标回收率为90.6%～105.2%,变异系数为2.5%～5.8%,表明方法具有良好的准确度与精密度。综上,本方法可准确、稳定地用于枸杞中11种砷形态的含量测定。
2.4 实际样品的检测
方法学验证结果表明,本方法灵敏度高、准确度佳,可用于枸杞样品砷形态分析。对80批次枸杞样品中11种砷形态进行测定,共检出有机砷ASB、DMA及无机砷As(Ⅲ)、As(V)四类物质;As(Ⅲ)、As(V)、DMA为全部样品共有组分,ASB仅存在于65批样品中。
不同批次的枸杞样品中总砷、无机砷含量差异较大,总砷含量为3.56～43.58 μg/kg,总砷含量的平均值为15.05 μg/kg,其中29批次总砷含量小于10 μg/kg,34批次为10～20 μg/kg,20～30 μg/kg共9批次,30～40 μg/kg共5批次,3批次大于40 μg/kg。绝大部分枸杞样品中总砷含量在20 μg/kg以下,总砷含量整体呈金字塔式分布,低含量区间样品数量占主导,高含量样品占比极少,整体总砷含量处于较低水平。无机砷含量为2.89～42.02 μg/kg,平均值为13.62 μg/kg,其中As(V)含量为2.00～37.46 μg/kg,平均值为9.67 μg/kg;As(Ⅲ)含量为0.89～18.11 μg/kg,平均值为3.95 μg/kg;DMA的含量为0.30～2.75 μg/kg,平均值为1.21 μg/kg;ASB的含量为0.11～0.68 μg/kg,平均值为0.27 μg/kg,部分样品中检出3种砷形态,部分样品中检出4种砷形态(图4)。各样品总砷含量离散程度较高,未呈现明显规律性,但砷形态组成存在稳定分布特征。
图4 枸杞样品中砷形态分布
Fig.4 Arsenic speciation distribution in wolfberry samples
根据80批次样品砷形态检测结果可知,无机砷为枸杞中砷的主要赋存形态,枸杞中无机砷占总砷含量的比例为74.8%～97.8%,其中6批次样品无机砷占比低于80%,90%以上32批次,无机砷和总砷的线性系数为0.995 6(图5)。进一步分析无机砷内部组成发现,主要的无机砷形态为As(V),占无机砷总量的比例为52.1%～89.2%;所有样品中As(V)含量均高于As(Ⅲ),所有样品中As(V)与As(Ⅲ)的含量比值为1.09～8.22(图6)。所有样品均呈现统一的砷形态含量规律,各形态含量排序为As(V)>As(Ⅲ)>DMA>ASB,无机砷总量高于有机砷。
图5 枸杞样品中无机砷与总砷的线性关系分析
Fig.5 Analysis of linear relationship between inorganic arsenic and total arsenic in wolfberry
图6 枸杞样品中砷形态占比分析
Fig.6 Proportion of arsenic species in wolfberry
注:横坐标为样品编号,属于离散样本序号,仅用等间距排布展示,不代表数值大小。
枸杞中砷含量差别较大,可能受到多种因素的影响,如生长环境、土壤条件、灌溉水、产地、种植条件及加工处理等因素影响,枸杞中特定的砷形态分布规律可能指示枸杞中的砷转化过程。枸杞砷形态组成存在明显个体差异,赋存特征较为复杂。通过进一步的分析和研究,可以更好地理解砷形态在枸杞中的分布和转化规律,以及它们对人类健康的潜在影响。
3 结论
本研究建立了可同步分离、定量枸杞中11种砷形态的HPLC-ICP-MS检测方法,并对枸杞中砷形态分布规律进行研究。通过对比5种提取方式和8种提取溶剂,考察提取过程中砷形态的转化稳定性,最终确定以盐酸为提取溶剂的热辅助提取方案,该方法提取率高,且可完整保留枸杞中砷的原始赋存形态。创新性地建立在线砷形态本底去除体系,采用阀前柱技术,去除环境中砷本底对砷形态测定的影响。将所建方法应用于实际枸杞样品检测,系统解析枸杞中各类砷形态的分布特征。本研究可以精准测定枸杞中总砷和砷形态含量,为阐释枸杞对砷的富集规律与砷形态转化机制提供理论依据;可为市场监管部门制定枸杞砷污染管控标准、完善检测规范提供数据支撑,并有助于提高贸易商、种植农户和消费者对枸杞中砷含量及其危害的认识。
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