嘧霉胺(pyrimethanil,PYR)作为一种苯胺基嘧啶类杀菌剂,凭借其广谱的杀真菌特性在农业领域得到广泛应用[1-2]。嘧霉胺能够通过抑制灰葡萄孢霉等病原菌侵染酶的分泌,有效阻断病菌的侵染过程;同时,还可降低病原菌水解酶水平,进而抑制菌丝生长与芽管伸长。由于这种独特的双作用机制,使得嘧霉胺成为水果、蔬菜及观赏作物在生长期、收获期以及采后贮藏期防治各类灰霉病等真菌病害的重要药剂[3-5]。然而,随着嘧霉胺在众多作物上的广泛施用,其残留问题逐渐凸显,成为食品安全领域的一大隐患。相关研究数据表明,在菠菜样本中,嘧霉胺的检出率高达76%;苹果样本中,90%存在多种农药共残留现象;梨样本中,嘧霉胺的检出率为54%。更为严峻的是,嘧霉胺对小鼠、大鼠、犬以及水生生物均具有潜在致癌性。长期摄入超标的嘧霉胺残留,会通过抑制甲状腺过氧化物酶活性,干扰甲状腺功能,进而对儿童发育和成人代谢系统造成潜在危害[6-8]。鉴于嘧霉胺残留的严重危害,不同国家、地区及组织严格制定了针对嘧霉胺的最大残留限量(maximum residue limit,MRL)标准。欧盟将果蔬和茶叶中嘧霉胺的MRL严格限定为0.05 mg/kg;我国针对谷物、果蔬和坚果等不同食品类别,规定嘧霉胺的MRL为0.01～5 mg/kg。因此,建立一种快速、高效的食品中嘧霉胺检测方法,对于保障食品安全具有至关重要的意义。
目前,不同基质中嘧霉胺的检测主要依赖于大型仪器方法。常见的方法包括高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱联用法、气相色谱法以及气相色谱-质谱串联法等[9-13]。这些大型仪器方法虽然能够实现较低的检测限,但前处理过程复杂,涉及液液萃取、石墨化炭黑柱净化等多步操作,且需要专业训练的人员进行操作,难以满足现场快速筛查的需求。相比之下,免疫分析技术凭借其操作简单、快速、便于携带、成本低等显著优势,在现场快速检测领域得到了广泛应用。在目前针对嘧霉胺的胶体金免疫层析技术(colloidal gold immuno-chromatography assay,GICA)中,不同研究方法的检出灵敏度存在较大差异,例如:章慧等[14]建立的免疫层析法方法检出限为0.05 mg/kg,检测灵敏度难以满足部分水果中嘧霉胺的检测要求;CHEN等[15]建立的免疫层析法方法针对黄瓜检出限为50 ng/mL;舒馨潓[16]建立的免疫层析法方法中嘧霉胺标准溶液视觉检出限为50 ng/mL,检测灵敏度无法满足检测需求。对此,本研究拟通过合成新型半抗原,制备灵敏度高、特异性强的嘧霉胺单克隆抗体,并建立一种快速检测果蔬中嘧霉胺残留的胶体免疫层析法。同时,对该检测方法进行一系列条件优化,旨在实现果蔬中嘧霉胺残留的现场快速检测,为保障农产品质量安全提供坚实的技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
样本垫、硝酸纤维(nitrocellulose filter membrane,NC)膜、吸水垫和聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)板,上海金标生物技术有限公司;氯金酸、柠檬酸三钠、羊抗鼠IgG、嘧霉胺标准品(纯度99.9%),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
HM330 三维平面点膜喷金仪、ZQ2000 微电脑自动斩切机、GIC-Q 金标读数仪,上海金标生物科技有限公司;101-2AB电热鼓风干燥箱,上海川宏实验仪器有限公司;LP涡旋振荡器、Sorvall ST8R低温高速离心机,美国Thermo Fisher公司;Waters 2695高效液相色谱仪,美国Waters公司。
1.3 实验方法
1.3.1 嘧霉胺半抗原的合成
嘧霉胺半抗原合成路线如图1所示:
图1 嘧霉胺半抗原合成路线
Fig.1 Synthetic routes of pyrimethanil hapten
首先,取3.00 g化合物a(15.06 mmol,CAS:53112-28-0)溶解于20 mL N′N-二甲基甲酰胺中,再依次加入3.12 g K2CO3(22.59 mmol)、4.41 g化合物b(22.59 mmol,CAS:2969-81-5)、四丁基溴化铵(200 mg,CAS:1643-19-2),充分溶解后置于室温下持续搅拌反应48 h。反应结束后向体系中加入50 mL 去离子水,随后使用乙酸乙酯萃取2次,对有机相进行减压蒸馏以去除溶剂,通过柱层析分离纯化得到1.75 g化合物c。
将1.75 g(5.58 mmol)的化合物c溶于2 mL甲醇中,再加入10 mL氢氧化锂(2 mol/L)水溶液中,将反应混合物在室温下搅拌反应超过8 h。反应完成后向体系中加入80 mL饱和氯化钠水溶液,随后使用二氯甲烷萃取2次,弃去有机相,将水相pH值调至4～5,此时有固体析出,将析出的固体进行过滤收集,并置于烘箱中干燥得到1.07 g半抗原产物。
1.3.2 人工抗原的制备
利用嘧霉胺半抗原的羧基,采用活泼酯的方法偶联钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)和牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)得到嘧霉胺人工抗原。取20 mg嘧霉胺半抗原溶于0.4 mL N,N-二甲基甲酰胺中,加入20 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亚胺和20 mg N-羟基丁二酰亚胺,室温下充分搅拌活化4 h得到半抗原活化酯。称取30 mg KLH和BSA分别溶于3.0 mL碳酸盐缓冲液(carbonate buffer,CB)(0.05 mol/L、pH 9.6)中得到载体蛋白溶液,在搅拌下将0.2 mL上述半抗原活化酯分别逐滴缓慢滴加至KLH和BSA载体蛋白溶液中,室温搅拌偶联过夜后用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)(0.01 mol/L、pH 7.4)室温透析3 d,每天换2次透析液,得到嘧霉胺人工抗原。
1.3.3 嘧霉胺单克隆抗体的制备及鉴定
将载体蛋白为KLH的嘧霉胺人工抗原作为免疫原免疫Balb/c小鼠,免疫原与弗氏佐剂按等体积混合并乳化,每次每只小鼠的免疫剂量为100 μg,每2周进行一次皮下与腹腔注射免疫。完成3次免疫后,采集小鼠尾部静脉血,采用间接竞争酶联免疫分析方法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA)检测小鼠血清抗体效价及抑制效果。选择血清效价高、抑制效果好的小鼠采用100 μg全抗原进行加强免疫,5 d后进行小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合实验,经亚克隆及有限稀释筛选得到杂交瘤细胞株。腹水采用Protein G层析柱进行纯化得到嘧霉胺单克隆抗体。
采用ic-ELISA法鉴定抗体性能,将载体蛋白为BSA的嘧霉胺人工抗原作为包被抗原,嘧霉胺抗原包被质量浓度为0.05 μg/mL,将嘧霉胺标准溶液用PBS(0.01 mol/L、pH 7.4)稀释成一系列质量浓度(0、0.5、1.5、4.5、13.5、40.5 μg/L),嘧霉胺单克隆抗体质量浓度为80 ng/mL。用酶标仪读取各孔OD450nm值,以OD450nm值为纵坐标,药物浓度为横坐标,通过Origin软件进行曲线拟合绘制标准曲线,计算得到嘧霉胺抗体的IC50值与IC20～IC80值等性能数据。
1.3.4 GICA的建立
1.3.4.1 金标抗体的制备
为调节胶体金溶液的pH值,分别采用6、8、10、12 μL 0.1 mol/L K2CO3溶液对1 mL胶体金溶液进行pH调节,振荡混匀后,将2、4、8、12 μg的嘧霉胺单克隆抗体加入胶体金溶液中,室温反应5 min后加入10 μL 的10%(质量分数)BSA水溶液进行封闭,室温反应5 min后12 000 r/min离心10 min,弃去上清液,加入1 mL金子稀释液复溶后,均匀涂抹在面积为5 cm×5 cm的玻璃纤维膜上,37 ℃干燥处理16 h后,将其裁切成4.00 mm宽的金垫保存备用。通过对照胶体金比色卡(图2)判读胶体金试纸条T、C线颜色的深浅和采用金标读数仪读取试纸条T、C线的信号值筛选出最佳的标记条件与抗体标记浓度。
图2 胶体金比色卡
Fig.2 The colloidal gold color card
1.3.4.2 T线抗原浓度的优化
将嘧霉胺包被抗原用PBS(0.01 mol/L、pH 7.4)稀释成0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL,羊抗鼠IgG稀释成0.1 mg/mL后分别包被于NC膜的检测线(T线)与质控线(C线)上,经45 ℃烘箱烘干16～24 h。通过对照胶体金比色卡判读胶体金试纸条T、C线颜色的深浅和采用金标读数仪读取试纸条T线和C线的信号值,对比试纸条的显色程度与T/C值筛选出最佳的T线抗原浓度。
1.3.4.3 嘧霉胺检测卡的组装及检测
嘧霉胺检测卡以PVC板为底板,依次层叠黏贴样品垫、金垫、NC膜及吸收垫,且各组件间重叠1～2 mm。将其裁切成3.00 mm宽的卡条,装入检测卡塑料卡槽,将检测卡和干燥剂一同密封于铝箔袋内,室温避光环境下保存。样品检测时,取100 μL待测液滴加至试纸条加样孔中,室温反应5～8 min后观察结果。当T线显色强度深于或接近C线,试纸条呈现阴性结果,表示样本中嘧霉胺残留量未超出方法的检出限。若样本中嘧霉胺残留量超出方法的检出限,待测液中的嘧霉胺药物会与金标抗体结合,从而与T线上嘧霉胺包被抗原竞争金标抗体,抑制T线包被抗原对金标抗体的捕获,从而使T线显色随药物浓度增加而减弱,颜色明显浅于C线,试纸条呈现阳性结果。如果C线不显色,结果无效。
1.3.5 试纸条性能测试
1.3.5.1 灵敏度
在最佳检测条件下,将嘧霉胺标准品用PBS(0.1 mol/L、pH 7.4)配制成1、2、5、10、15、20、25 μg/L的系列浓度,并分别取100 μL依次进行试纸条检测,根据实验结果确定试纸条的标准品检测限。
1.3.5.2 实际样品检测
选取马铃薯、苹果、洋葱和莴苣等7种果蔬空白样本进行梯度加标,加标量为0、15、25、50、75 μg/kg。取2 g剪碎或搅碎后的果蔬样品,放入50 mL离心管中,加入2 mL 0.1 mol/L PBS中,剧烈振荡混匀2 min,即为待测液。取100 μL待测液加入检测卡中,待层析5～8 min后,通过对照胶体金比色卡判断检测结果。
1.3.5.3 稳定性
将同一批次试纸条置于45 ℃烘箱中,通过进行速老化实验对比不同日期试纸条的显色与在不同嘧霉胺标准溶液浓度下的灵敏度变化评估胶体金检测卡的稳定性。
2 结果与分析
2.1 嘧霉胺半抗原及单克隆抗体性能鉴定
在单克隆抗体制备中,小分子半抗原的设计是制备高特异性、高亲和力抗体的关键第一步。小分子半抗原的设计策略主要是保留目标分析物的关键结构特征、充分暴露目标结构及引入合适的连接臂。目前报道的嘧霉胺半抗原设计策略,例如孙琨[17]、舒馨潓[16]、郭鑫[18]、CHEN等[15]从嘧霉胺的苯环与二甲基嘧啶环引入连接臂,然而,这种设计方式存在一定局限性,它只能暴露嘧霉胺一侧的特征结构。由于特征结构暴露不充分,导致此类半抗原制备得到的单克隆抗体灵敏度不足,难以满足目前的检测需求。因此,本研究中嘧霉胺半抗原设计完整保留了嘧霉胺中的苯环和二甲基嘧啶环结构,从结构中心处引入连接臂不仅具有活性基团,还完整地呈递了嘧霉胺的关键特征结构,有效增强了识别位点。将制备得到的嘧霉胺半抗原采用质谱鉴定,结果如图3所示,嘧霉胺半抗原的分子质量285.1 Da,分子离子峰为ESI-[M-H]-:284.1,且为最高峰,表明嘧霉胺半抗原成功制备。
图3 嘧霉胺半抗原负离子质谱图
Fig.3 The negative MS of pyrimethanil hapten
在最佳检测条件下,将载体蛋白为BSA的嘧霉胺人工抗原作为包被原,加入质量浓度为0～40.5 μg/L的嘧霉胺标准溶液和嘧霉胺单克隆抗体进行了检测,得到ic-ELSIA数据绘制标准曲线。标准曲线如图4所示,嘧霉胺的线性方程为:y=(2.53 61-0.129 4)/[1+(x/1.72 82)×0.847 9]+D,R2=0.999,x表示待测物质量浓度,y表示OD值,通过计算得到嘧霉胺单克隆抗体对嘧霉胺的IC50值为1.97 μg/L,在0.5～40.5 μg/L内呈线性关系。
图4 嘧霉胺ic-ELISA曲线
Fig.4 Ic-ELISA curve of pyrimethanil
2.2 嘧霉胺半抗原及单克隆抗体性能鉴定
2.2.1 标记pH值的优化
在胶体金标记抗体的过程中,抗体主要通过静电吸附作用被固定于胶体金颗粒表面,进而形成兼具稳定性与特异性识别能力的标记复合物。其中,胶体金溶液标记体系的pH值作为标记过程的关键参数,对后续免疫检测的灵敏度、特异性及稳定性具有直接且显著的影响[19]。为优化标记效果,本研究通过添加K2CO3溶液对标记体系pH值进行调节。由表1和图5-A可知,当1 mL胶体金溶液中0.1 mol/L K2CO3溶液添加量为 6 μL时,由于标记体系的pH值过低,胶体金探针发生了聚沉现象,导致试纸条整体显色偏紫且显色强度不足。进一步增加K2CO3溶液添加量至10 μL时,试纸条在阴性条件下的T线颜色满足L6的标准,且与阳性条件下的显色梯度差值≥2,试纸条在阴性与阳性条件下的显色均能满足胶体金判读要求。然而,当K2CO3溶液添加量达到或超过10 μL 时,标记体系的pH值升高,导致抗体过度带负电,与胶体金的静电吸附作用减弱,标记效率下降导致胶体金-抗体复合物数量下降,试纸条整体显色强度减弱,阴性条件下T线显色出现单边现象,阳性条件下T线显色强度与C线接近,呈现弱阳性的结果,导致阳性判读准确性下降,因此1 mL胶体金溶液中0.1 mol/L K2CO3 溶液的最佳添加量为8 μL,此条件下标记体系pH值可有效平衡胶体金探针的稳定性与抗体活性,从而确保免疫检测的灵敏度、特异性及稳定性达到最优水平。
表1 0.1 mol/L K2CO3 溶液添加量对胶体金试纸条性能的影响
Table 1 Effect of 0.1 mol/L K2CO3 solution addition amount on GICA performance
0.1 mol/L K2CO3添加量/μL空白对照(稀释液)嘧霉胺质量浓度(10 μg/L)T、C线颜色T/C值T、C线颜色T/C值6L5,L41.26L1,L40.288L6,L32.57L3,L50.5410L5(单边),L13.81L3,L40.9512L5(单边),L13.69L3,L40.89
A-0.1 mol/L K2CO3 溶液添加量;B-抗体标记质量浓度;C-T线包被质量浓度
图5 不同检测条件的胶体金试纸条检测结果
Fig.5 Experimental results of different detection condition on GICA
2.2.2 抗体标记质量浓度的优化
抗体标记质量浓度作为影响试纸条性能的关键因素,其标记质量浓度高低变化会对试纸条的显色强度和灵敏度产生直接且显著的影响[20]。由表2和图5-B可知,抗体标记质量浓度对试纸条性能有着显著影响,随着抗体标记质量浓度的从2 μg/mL提升到12 μg/mL,试纸条在阴性条件下的T线颜色呈现出逐渐加深的趋势。当抗体标记质量浓度低于4 μg/mL时,试纸条在阴性条件下的T线显色强度明显不足,颜色较浅,无法满足肉眼判读的基本需求。当抗体标记质量浓度提升至8 μg/mL时,试纸条在阴性条件下的T线颜色达到L6以上,阳性条件下的T线显色强度明显弱于C线,肉眼可明显判读。而当抗体标记质量浓度进一步增加到12 μg/mL时,试纸条在阴性条件下T线出现了局部结合过强的单边现象,表明此时抗体标记质量浓度已经超出合适范围,处于过量状态,而且试纸条的灵敏度也随之开始下降,因此抗体的最佳标记质量浓度为8 μg/mL。
表2 嘧霉胺抗体标记质量浓度对胶体金试纸条性能的影响
Table 2 Effect of pyrimethanil antibody label mass concentration on GICA performance
抗体标记浓度(μg/mL)空白对照(稀释液)嘧霉胺质量浓度(10 μg/L)T、C线颜色T/C值T、C线颜色T/C值2L2,L21.02L1,L30.154L4,L41.05L2,L60.218L7,L33.12L3,L60.4112L8(单边),L43.89L5,L60.90
2.2.3 T线抗原包被质量浓度的优化
T线上抗原包被的抗原质量浓度是试纸条中一个至关重要的核心参数,它直接决定了试纸条的灵敏度和结果判读的准确性,因此通过探究不同T线抗原包被质量浓度下试纸条的检测结果变化情况,以此确定最佳的T线抗原包被质量浓度[21]。由表3和图5-C可知,当T线抗原包被质量浓度为0.05 mg/mL时,试纸条在阴性条件下的T线显色强度弱于C线,呈现假阳性的结果。当T线抗原包被质量浓度增加到0.1 mg/mL时,试纸条阴性和阳性条件下的T、C线之间显色梯度都≥2.5,能明显的对检测结果进行判读。而将T线抗原包被质量浓度持续增加到0.2、0.4 mg/mL时,试纸条在阴性条件下的显色强度符合要求,但阳性条件下的T线显色强度也随着增加,导致试纸条呈现阴性的结果,表明T线抗原包被质量浓度已经过量。因此T线抗原最佳包被质量浓度为0.1 mg/mL。
表3 T线抗原包被质量浓度对胶体金试纸条性能的影响
Table 3 Effect of T-line antigen coating mass concentration on GICA performance
T线质量浓度/(mg/mL)空白对照(稀释液)嘧霉胺浓度(10 μg/L)T、C线颜色T/C值T、C线颜色T/C值0.05L5,L60.85L1,L60.150.1L6+,L33.02L2,L60.340.2L7,L42.93L5,L51.210.4L8,L25.01L7,L15.83
注:“+”表示试纸条颜色加深。
2.3 试纸条性能评价
2.3.1 灵敏度评价
按照上述所优化的最优条件下,配置了一系列不同质量浓度的嘧霉胺标准溶液进行试纸条灵敏度测试,由表4和图6可知,当嘧霉胺标准溶液质量浓度小于10 μg/L时,试纸条T线显色强度强于或等于C线,结果为阴性,当嘧霉胺标准溶液质量浓度达到10 μg/L时,试纸条T线显色强度明显弱于C线,结果为阳性,因此,本研究所建立的方法对嘧霉胺的检出限为10 μg/L。
表4 嘧霉胺不同药物质量浓度的胶体金试纸条检测结果
Table 4 Experimental results of different pyrimethanil mass concentration on GICA
嘧霉胺标准溶液质量浓度/(μg/L)12510152025检测结果---++++
注:-为阴性结果表示未含有或低于检出限的目标物质,+为阳性结果表示含有或高于检出限的目标物质(下同)。
图6 嘧霉胺不同药物质量浓度的试纸条检测结果
Fig.6 Experimental results of different pyrimethanil mass concentration on GICA
2.3.2 实际样品检测
通过对市场上随机购买的7种空白果蔬样本进行不同加标量的梯度加标实验,确定本研究所建立的方法对果蔬样本中嘧霉胺的检测限。由表5可知,当果蔬样本中嘧霉胺添加量低于25 μg/kg时,由于检测灵敏度无法达到要求,试纸条无法检测出嘧霉胺的存在,所有样本的检测结果均显示为阴性。而当样本中嘧霉胺添加量达到或者超过25 μg/kg时,所有样本的试纸条检测结果均为阳性,因此,本研究所建立的方法对果蔬样本中嘧霉胺的检测限为25 μg/kg。
表5 不同果蔬样本中嘧霉胺梯度加标的试纸条检测结果
Table 5 Experimental results of different fruits and vegetables samples for pyrimethanil grade spiked on GICA
样品加标量/μg/kg010 255075马铃薯--+++莴苣 --+++洋葱 --+++胡萝卜--+++香蕉 --+++苹果 --+++梨 --+++
2.3.3 稳定性
由表6可知,在45 ℃干燥箱的条件下,试纸条在60 d内显色情况及在不同嘧霉标准溶液浓度下的灵敏度均未发生显著变化,表明试纸条稳定性良好。
表6 稳定性检测结果
Table 6 Stability results
时间/d嘧霉胺标准溶液浓度/(μg/L)0510150--++5--++10--++20--++30--++40--++50--++60--++
3 结论与讨论
本研究根据嘧霉胺的结构特点,在半抗原设计策略中完整保留了嘧霉胺分子中的苯环和二甲基嘧啶环结构,完整呈递嘧霉胺的关键特征结构,进而有效增强了识别位点,制备得到一株对嘧霉胺的IC50值为1.97 μg/L的高灵敏度单克隆抗体。基于此单克隆抗体建立了一种用于快速检测果蔬中嘧霉胺残留的胶体金免疫分析法。通过对一系列影响因素进行优化,优化后的方法对嘧霉胺的标准溶液检出限为10 μg/L,对果蔬样品检出限为25 μg/kg,检测时间约为15 min。本研究建立的胶体金免疫分析法样品检出限满足国家标准要求,其样品检出限符合国家标准要求。该方法具备灵敏度高、准确性好、检测速度快等特点,能够实现果蔬中嘧霉胺残留的现场快速检测,为保障农产品质量安全提供了坚实可靠的技术支撑。
[1] EUROPEAN F S A E,
LVAREZ F,ARENA M,et al.Peer review of the pesticide risk assessment of the active substance pyrimethanil[J].EFSA journal.European Food Safety Authority,2024,22(10):e8998.
[2] 
M,et al.Pyrimethanil:Between efficient fungicide against Aspergillus rot on cherry tomato and cytotoxic agent on human cell lines[J].Annals of Applied Biology,2019,175(2):228-235.
[3] CHEN R S,LIU T T,DENG D,et al.Review:Progress towards research on the toxicology of pyrimethanil[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part C:Toxicology &Pharmacology,2024,283:109940.
[4] KANETIS L,FÖRSTER H,ADASKAVEG J E.Comparative efficacy of the new postharvest fungicides azoxystrobin,fludioxonil,and pyrimethanil for managing Citrus green mold[J].Plant Disease,2007,91(11):1502-1511.
[5] COEGO A,RAMIREZ V,GIL M J,et al.An Arabidopsis homeodomain transcription factor,overexpressor of cationic peroxidase 3,mediates resistance to infection by necrotrophic pathogens[J].The Plant Cell,2005,17(7):2123-2137.
[6] 马琳.嘧霉胺在蓝莓中的残留行为及膳食风险评估[J].农药学学报,2022,24(4):884-889.MA L.Residue and dietary exposure risk assessment of pyrimethanil in blueberries[J].Chinese Journal of Pesticide Science,2022,24(4):884-889.
[7] CRÉPET A,LUONG T M,BAINES J,et al.An international probabilistic risk assessment of acute dietary exposure to pesticide residues in relation to codex maximum residue limits for pesticides in food[J].Food Control,2021,121:107563.
[8] MENG Y L,ZHONG K Y,XIAO J H,et al.Exposure to pyrimethanil induces developmental toxicity and cardiotoxicity in zebrafish[J].Chemosphere,2020,255:126889.
[9] 陈立军.气相色谱质谱法检测土壤中4种嘧啶类杀虫剂[J].食品工业,2020,41(7):306-309.CHEN L J.Determination of four pyrimidine insecticides in soil by GC-MS[J].The Food Industry,2020,41(7):306-309.
[10] 乔海霞,孙效乐,曹宁,等.气相色谱-三重四极杆质谱联用法测定黄瓜中嘧霉胺的不确定度评定[J].食品安全质量检测学报,2020,11(24):9256-9260.QIAO H X,SUN X L,CAO N,et al.Uncertainty evaluation for the determination of pyrimethanil residues in cucumber by gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry[J].Journal of Food Safety &Quality,2020,11(24):9256-9260.
[11] 贾春虹.超高效液相色谱-串联质谱检测草莓中氟吡菌酰胺和嘧霉胺的残留与消解[J].农药,2021,60(1):42-45.JIA C H.Determination and dissipation of fluopyram and pyrimethanil in strawberry using UPLC-MS/MS[J].Agrochemicals,2021,60(1):42-45.
[12] 张文锦.QuEChERS-气相色谱-串联质谱法测定农田土壤中3种嘧啶类杀菌剂的残留量[J].理化检验-化学分册,2019,55(12):1463-1465.ZHANG W J.Determination of residual amount of 3 pyrimidine bactericides in farmland soil by Qu ECh ERS-GC in hypenation with MS/MS in tandem[J].Physical Testing and Chemical Analysis(Part B(Chemical Analysis)),2019,55(12):1463-1465.
[13] Y
LDRM I,ÇIFTÇI U.Monitoring of pesticide residues in peppers from Çanakkale(Turkey)public market using QuEChERS method and LC-MS/MS and GC-MS/MS detection[J].Environmental Monitoring and Assessment,2022,194(8):570.
[14] 章慧,丰东升,张唯谊,等.胶体金法快速检测蔬菜中哒螨灵、咪鲜胺、嘧霉胺残留的应用研究[J].上海农业学报,2021,37(2):121-126.ZHANG H,FENG D S,ZHANG W Y,et al.Study on colloidal gold assay in rapid detecting residues of pyridaben,prochloraz,and pyrimethanil in vegetables[J].Acta Agriculturae Shanghai,2021,37(2):121-126.
[15] CHEN Z W,WU X L,XU L G,et al.Development of immunocolloidal strip for rapid detection of pyrimethanil[J].Food and Agricultural Immunology,2019,30(1):1239-1252.
[16] 舒馨潓.嘧霉胺单克隆抗体的制备及三种快检试纸条的研制[D].南昌:南昌大学,2024.SHU X H.Preparation of pyrimethanil monoclonal antibody and development of three rapid detection test strips[D].Nanchang:Nanchang University,2024.
[17] 孙琨.嘧霉胺单克隆抗体的制备及荧光免疫层析试纸条的研发[D].南昌:南昌大学,2024.SUN K.Preparation of pyrimethanil monoclonal antibody and development of fluorescent immunochromato-graphic test strip[D].Nanchang:Nanchang University,2024.
[18] 郭鑫.食品中六种化学药物残留的免疫检测方法研究[D].无锡:江南大学,2022.GUO X.Study on immunological detection methods for six chemical drug residues in foods[D].Wuxi:Jiangnan University,2022.
[19] LI X L,HUANG J,LI N,et al.Development of a colloidal gold immunochromatographic assay strip using a monoclonal antibody for the rapid detection of ofloxacin[J].Foods,2024,13(24):4137.
[20] LU Q Q,GUO L L,XU X X,et al.Hapten prediction,monoclonal antibody preparation,and development of an immunochromatographic assay for the detection of fenamiphos[J].Journal of Hazardous Materials,2025,487:137168.
[21] LU Q Q,XU X X,LIU L Q,et al.Production of a monoclonal antibody against thiacloprid,resistant to matrix interference,and its application in quantitatively immunochromatographic assay[J].Food Chemistry,2025,467:142172.