城口老腊肉作为我国西南地区传统的腌制肉制品,是大巴山南麓富硒地带的居民为延长鲜肉保质期而创制的一项地方名产,不仅被列入重庆市非物质文化遗产名录,更获得了国家地理标志产品的权威认证。城口老腊肉的制作工艺考究,所用猪肉均来自城口县本地杂粮以及猪草喂养的土猪,猪肉经腌制风干后,再用青冈树、九把香等多种中药材和香料树枝、硬杂树烘炕45 d左右,制成的成品别具特色,呈现出金黄透亮的色泽,风味醇厚鲜明。
食品的风味是一种由嗅觉和味觉相互作用形成的复合感官体验,其中肉制品的特征风味主要是由自身所含的挥发性化合物所决定的。在腊肉制作过程中,独特风味的形成主要是通过美拉德反应、脂质氧化以及前体降解等一系列复杂化学反应产生醛、醇、酮、烃、酯、呋喃,以及含氮和含硫等多种挥发性化合物。目前已有较多文献围绕着腊肉制品中挥发性风味物质的组成与形成展开研究,贝爽[1]通过对湖南腊肉的挥发性风味物质检测发现,酚类物质是构成湖南腊肉烟熏风味的关键;董梓燕等[2]利用固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对不同腌制工艺的传统湘式腊肉进行挥发性有机物鉴定,发现干腌组以壬醛为主的醛类物质含量显著高于湿腌组,对湘式腊肉风味的形成具有更积极的影响;杨树江等[3]通过对黔式风干腊肉和烟熏腊肉进行分析,发现二者的主体风味物质存在明显差异,风干腊肉主体风味由癸酸乙酯、苯乙醛和甲硫基丙醛主导,而烟熏腊肉则以芳樟醇和邻甲氧基苯酚为主,造成这一差异主要是由制作工艺的不同所产生。
在现代食品加工技术的推动下,传统食品加工的生产模式逐渐向工业化、标准化的方向迈进。在腊肉加工中,恒温恒湿烘房系统使其加工周期大大缩短,但这种工艺的改变可能会导致产品品质与风味发生变化。蔡振林[4]通过对农家腊肉和工厂腊肉对比分析发现,工厂腊肉在质地口感和安全性方面的表现优于农家腊肉,但风味丰富性与色泽饱满度等方面相对较差。李军年等[5]比较了传统腊肉与绿色液熏腊肉,研究显示二者在呈味成分上存在差异,液熏腊肉瘦肉和肥肉中挥发性物质种类和含量均显著低于传统腊肉。
以上研究均表明,加工工艺的革新在提升生产效率的同时,确实会对腊肉风味产生一定影响。目前,常海军等[6]利用顶空固相微萃取-气相色谱/质谱联用技术(headspace solid-phase microextraction-gas chromatographymass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)技术对不同包装的城口老腊肉进行挥发性风味化合物分析,发现城口老腊肉的特征性挥发风味成分主要来自于酚类、醇类、醛类,但对于城口老腊肉在不同加工方式下的风味差异及其重要香气活性成分尚缺乏系统性研究。基于此,本研究以农家和工业化的城口老腊肉为研究对象,采用HS-SPME-GC-MS并结合气味活度值(odor activity value,OAV)、变量重要性投影(variable importance in projection,VIP)值等方法,从蒸煮前后2个方面比较分析了2种工艺生产的城口老腊肉的风味特征,为城口老腊肉加工与产品质量改进提供数据支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
实验所用的2组城口老腊肉样品分别购买于重庆市城口县本地农户和腊肉生产企业(农家腊肉在自然土烘房中明火烟熏,悬挂位置距火堆1～2 m,烟熏时间30 d左右;工厂腊肉采用恒温恒湿烘房系统,使用发烟装置,通过管道将烟输送至烘房内,烘房内温度50～60 ℃,湿度60%左右,烟熏1～2 d),肉的品种和部位相同,选用辅料相近,样品采集后均置于-18 ℃保存。
甲基红、溴甲酚绿及亚甲基蓝,伊势久(江苏连云港)生物科技有限公司;1,3-二氯苯,C7～C30正构烷烃标准品,色谱纯,坛墨质检科技股份有限公司;NaOH、HCl、CuSO4、K2SO4、H2SO4、硼酸、乙醇、石油醚等均为分析纯,重庆川东化工(集团)有限公司。
1.2 仪器与设备
JA303P分析天平,常州幸运电子设备有限公司;BOV101-70鼓风干燥箱,济南鑫贝西生物技术有限公司;NKD-6260凯氏定氮仪,上海望海环境科技有限公司;UV-7500紫外可见分光光度计,苏州聚谱科技仪器有限公司;SPME手动进样手柄及萃取头(50/30 μm DVB/CAR/PDMS),美国Supleco公司;HP-5MS石英毛细管柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm),惠普分析仪器有限公司;GC-MS-QP2020气相色谱-质谱联用仪,日本岛津公司。
1.3 实验方法
1.3.1 样品加工与处理
从腊肉块对称轴或对称面上分割为均匀大小的2块,一块直接绞碎混匀,另一块置于蒸锅中,沸水条件下蒸制40 min,取出后自然冷却至室温,随后使用无菌器械进行粉碎与混匀处理,制备成待测样品。
1.3.2 水分含量测定
参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》中的直接干燥法执行。
1.3.3 蛋白质含量测定
参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法。
1.3.4 脂肪含量测定
参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》中的索氏抽提法。
1.3.5 氯化物含量测定
参照GB 5009.44—2016《食品安全国家标准 食品中氯化物的测定》中的电位滴定法。
1.3.6 亚硝酸盐含量测定
参照GB 5009.33—2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的分光光度法。
1.3.7 挥发性风味物质分析
精确称取5.0 g均质处理的腊肉样品置于20 mL顶空样品瓶(配备聚四氟乙烯/硅橡胶隔垫)内,加2.5 g NaCl增强挥发性物质的释放,密封后于65 ℃水浴加热30 min,使挥发性成分在顶空充分扩散;随后将SPME装置中的萃取纤维针管穿透隔垫,推出涂层纤维头置于顶空部分,在65 ℃下吸附并富集挥发性化合物30 min;吸附完成后收回纤维头,迅速转移至气相色谱进样口,在240 ℃下热解吸10 min,使目标物随载气进入色谱柱进行分析。色谱分离条件如下:使用HP-5MS色谱柱(规格:30 m×0.25 mm,0.25 μm),柱箱温度采用程序升温模式;初始温度设定为40 ℃并维持1 min,随后以5 ℃/min的速率升至90 ℃并保持3 min,再以8 ℃/min的速率升温至130 ℃持续5 min,最后以15 ℃/min的速率升至250 ℃并维持5 min;载气为高纯度氦气,流速控制为1.0 mL/min,进样时不分流。质谱检测条件设定为:离子源传输线温度分别为230、250 ℃,四极杆温度150 ℃;检测器电压为350 V,发射电流为150 μA,质量扫描范围设定在35～500 m/z。
在相同条件下,对1 μL饱和正构烷烃混合标准样品进行分析,通过保留指数匹配(MS库相似度≥85%)定性。采用内标法半定量,内标为1,3-二氯苯(100 μg/mL,100 μL),挥发性化合物含量计算如公式(1)所示:
(1)
式中:X,挥发性化合物含量,μg/g;A,挥发性物质峰面积;C,内标的质量浓度,μg/mL;V,内标的添加体积,μL;A0,内标峰面积;m,样品质量,g;1 000,换算系数。
OAV是评价食品中挥发性化合物对整体风味和气味贡献强度的重要指标[7],定义为化合物在样品中的含量C(μg/kg)与其感觉阈值T(μg/kg)的比值,计算如公式(2)所示:
(2)
其中OAV<1,说明该化合物对整体风味无明显贡献;OAV>1,说明该化合物是潜在的香气活力物质,并且在一定范围内,OAV与总体的风味贡献程度呈正相关。
1.4 数据处理
使用Office 2019对数据进行整理与统计,Origin 2021进行主成分、聚类分析。SIMCA 14.1软件构建正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)模型,并计算预测VIP,结合SPSS 24.0软件进行单因素分析,以P<0.05,VIP值≥1为条件筛选差异香气成分。
2 结果与分析
2.1 不同工艺对城口老腊肉理化品质分析
水分影响着腌腊肉加工过程中微生物代谢以及部分生化反应,是决定腌腊肉质地和货架期的关键因素[8]。由图1-A可知,工业化城口老腊肉水分含量显著高于农家传统工艺(P<0.05),分别为(15.88±0.54)g/100 g和(37.70±1.48)g/100 g,农家腊肉在加工过程中风干和熏制时间较长,加工方式中的条件参数不同可能造成含水量差异。再比较蒸煮制前后的水分含量,发现不管农家还是工厂的城口老腊肉,经蒸煮后的水分含量均有所增加,这可能是由于高温蒸制使蛋白质的空间构象发生改变,结构变得松弛,从而提高了持水力。工业化城口老腊肉中蛋白质含量显著高于农家,脂肪含量则与之相反,这可能与熏制的温度有关,温度会改变蛋白质水解酶和脂肪水解氧化酶的活性,从而对腊肉中脂肪、蛋白质水解以及氧化造成影响[9]。
A-农家和工厂腊肉蒸煮前后水分、蛋白质、脂肪、氯化物的含量变化;B-农家和工厂腊肉蒸煮前后亚硝酸盐的含量变化
图1 不同工艺对城口老腊肉理化品质的影响
Fig.1 Effects of different processes on the physicochemical quality of Chengkou bacon
注:图中CL、CLS、XL、XLS分别表示传统工艺城口老腊肉生制品、熟制品和现代工艺城口老腊肉生制品、熟制品(下同)。不同小写字母表示有显著性差异(P<0.05)。
食盐是腌制腊肉必不可少的配料,对加工成熟和贮藏性有重要影响,其含量通常用氯化物含量表示[10]。由图1-A可知,不同工艺城口老腊肉氯化物含量为(3.14±0.11)～(3.75±0.17)g/100 g,相差不大。如图1-B所示,所有被测样品的亚硝酸盐残留量均符合国家标准限值要求(≤30 mg/kg),亚硝酸盐在肉制品加工中具有赋予色泽、抑制菌类和抗氧化等关键作用,然而过量摄入或不当使用存在中毒甚至是致癌风险。但目前尚无可完全替代其作用的技术方案,因此严格控制腌腊肉制品中亚硝酸盐的残留量十分重要[11]。农家城口老腊肉中亚硝酸盐残留量显著低于工业化生产,这可能与食品添加剂的使用有关。经蒸煮后,传统工艺城口老腊肉熟制品中含量显著上升,这与李维等[12]的结果相似;但现代工艺城口老腊肉熟制品中亚硝酸盐残留量反而降低,这可能与前述结果中现代工艺城口老腊肉熟制品蛋白质和脂肪等的含量增加有关。高温蒸制使腊肉中的水分饱和后又逐渐流失,增加了粗蛋白含量的同时对脂质的降解、氧化和流失速度产生影响。
2.2 不同工艺对城口老腊肉风味的影响
2.2.1 不同工艺的城口老腊肉挥发性风味物质组成
为探究腊肉样品间的香气特征差异,本研究借助HS-SPME与GC-MS联用技术检测了传统农家与工业化2种加工工艺的城口老腊肉在蒸煮处理前后所含挥发性风味物质的组成及其相对含量。挥发性成分的鉴定结果(表1)表明,4个样品共鉴定出77种挥发性化合物,这些物质可以划分为8个类别,其中包括酚类17种、酯类14种、烃类13种、醇类12种、酮类9种、酸类4种、醛类4种以及其他4种。CL、CLS、XL、XLS 4个样品中分别检测到34、34、45和50种挥发性化合物,其总量分别为16.64、18.83、27.31、30.04 mg/kg。
表1 城口老腊肉挥发性风味物质HS-SPME-GC/MS分析结果
Table 1 HS-SPME-GC/MS analysis results of volatile flavor compounds in Chengkou bacon
香气物质阈值/(mg/kg)[13]CAS保留指数含量/(mg/kg)CLCLSXLXLS苯酚0.000 77108-95-29991.87±0.05b2.85±0.16a0.21±0.02c0.23±0.01c2-甲酚0.000 695-48-71 0650.59±0.04b0.83±0.05a—0.04±0.00c愈创木酚0.001 890-05-11 0871.17±0.03b1.73±0.12a0.48±0.02c0.48±0.02c3-甲酚0.000 8108-39-41 0911.30±0.03b1.98±0.13a——麦芽酚0.015118-71-81 1110.12±0.01a0.18±0.01b——2,5-二甲基苯酚0.495-87-41 1640.25±0.03a0.29±0.03a——2,3-二甲基苯酚0.5526-75-01 1660.35±0.02a0.36±0.03a——2,4-二甲基苯酚0.4105-67-91 1860.38±0.02a0.40±0.06a——4-甲基愈创木酚0.000 193-51-61 1921.28±0.06a1.32±0.02a0.24±0.02b0.27±0.04b3,5-二甲基苯酚5108-68-91 2060.14±0.01b0.17±0.01a——4-乙基愈创木酚0.000 022785-89-91 2741.48±0.04a1.40±0.06a0.15±0.01b0.21±0.02b2-甲氧基-4-乙烯基苯酚0.0037786-61-01 3150.22±0.00a0.18±0.01b——2,6-二甲氧基苯酚1.8590-10-11 3511.73±0.06a1.65±0.04a0.18±0.02b0.21±0.02b二氢丁香酚0.000 712785-87-71 3680.42±0.02———2,6-二甲氧基-4-甲基苯酚0.000 096638-05-71 4500.60±0.04a0.52±0.03b0.11±0.01c0.10±0.01c异丁香酚0.002 597-54-11 4580.19±0.01a0.13±0.01b——2,6-二叔丁基对甲基苯酚1128-37-01 5050.69±0.03c1.06±0.02a0.82±0.04b0.60±0.02d乙醇1664-17-57050.11±0.01c0.27±0.01c3.80±0.06b4.42±0.19a异丁醇0.00878-83-1730——0.03±0.00b0.12±0.01a乙缩醛二乙醇0.004 9105-57-7767——0.03±0.00b0.03±0.00a异戊醇0.000 65123-51-3774——0.55±0.01b0.70±0.05a2-甲基-1-丁醇0.000 06137-32-6776——0.07±0.00b0.11±0.01a2,3-丁二醇20513-85-9806——1.95±0.09a0.32±0.02b2-糠醇0.198-00-0862—0.19±0.01——桉树醇0.001 2470-82-61 027——0.17±0.01b0.23±0.03a芳樟醇0.000 08778-70-61 101——0.44±0.02b0.58±0.04aβ-苯乙醇0.000 2560-12-81 118——0.18±0.02b0.23±0.03a4-松油醇0.007562-74-31 185——0.10±0.01b0.15±0.01a2,6,6-三甲基二环[3.1.1]-2-庚醇0.007473-54-11 198——0.07±0.01b0.13±0.02a己烷0.5110-54-37220.04±0.00b0.14±0.02a0.03±0.00b0.04±0.00b甲苯0.3108-88-37450.46±0.03a———邻二甲苯0.450 2395-47-6872—0.16±0.01a0.12±0.00b0.18±0.01a间二甲苯1108-38-3893———0.04±0.00桧烯0.0343387-41-59710.15±0.01b—0.06±0.01c0.20±0.01a月桂烯0.034123-35-3988——0.04±0.00b0.10±0.01a右旋萜二烯0.0075989-27-51 0250.15±0.01b0.08±0.01d0.11±0.01c0.23±0.02aγ-松油烯0.00199-85-41 054——0.03±0.00b0.05±0.01a水合桧烯—546-79-21 069——0.04±0.00a0.07±0.02a3-羟基-4-甲氧基甲苯—1195-09-11 1800.11±0.00b0.14±0.01a——甘菊蓝—275-51-41 1890.91±0.05a0.58±0.01b——3,7-二甲基癸烷—17312-54-81 1980.07±0.00———十六烷—544-76-31 297———0.03±0.00α-柏木烯—469-61-41 424——0.06±0.00—3,4,5-三甲氧基甲苯—6443-69-21 5250.27±0.02a0.27±0.01a——丙酮1767-64-1708——2.07±0.04a2.07±0.06a2,3-丁二酮0.000 059431-03-8721——0.35±0.01b0.61±0.03a3-羟基-2-丁酮0.095 1513-86-07590.41±0.02c—8.92±0.23b12.38±0.25a2-庚酮0.001110-43-0888——0.06±0.00—甲基环戊烯醇酮0.021120-73-6960—0.17±0.01——
续表1
香气物质阈值/(mg/kg)[13]CAS保留指数含量/(mg/kg)CLCLSXLXLS3-甲基-2-环戊烯-1-酮—2758-18-19610.13±0.00———3-甲基-1,2-环戊二酮1765-70-81 0220.22±0.01b0.43±0.04a——乙基环戊烯醇酮—21835-01-81 1190.08±0.01a0.09±0.02a——胡椒酮—89-81-61 252———0.05±0.01乙酸甲酯0.0479-20-9711——0.21±0.01b0.28±0.02a乙酸乙酯0.005141-78-67250.37±0.03c0.42±0.00b—1.24±0.02a异丁酸甲酯0.000 1547-63-7748——0.07±0.00b0.10±0.01a丁酸甲酯0.000 1623-42-7764——0.03±0.00a0.02±0.01a异丁酸乙酯0.000 197-62-1785——0.04±0.00b0.07±0.00a异戊酸甲酯0.000 1556-24-1797——0.46±0.02a0.47±0.04a2-甲基丁酸乙酯0.0427452-79-1852——0.08±0.00a0.06±0.01b3-甲基丁酸乙酯0.000 003108-64-5856——0.22±0.01a0.20±0.01a乙酸异戊酯0.000 006123-92-2876——0.09±0.00b0.13±0.01a己酸甲酯0.000 1106-70-7921——0.38±0.02b0.51±0.03a己酸乙酯0.000 1123-66-0995—0.04±0.00b0.07±0.01a0.08±0.01a戊酸异戊酯0.000 12050-09-11 104——0.12±0.01—乙酸芳樟酯1115-95-71 244——0.11±0.01a0.12±0.03a癸酸乙酯0.008 6110-38-31 393——0.05±0.01—己醛0.004 566-25-1813—0.05±0.01——糠醛0.00198-01-1840—0.19±0.02——壬醛0.000 2124-19-61 1030.15±0.01a0.12±0.01b—0.09±0.01c桂醛0.00414371-10-91 2800.13±0.00———乙酸0.00764-19-7724—0.20±0.02c3.66±0.11a0.90±0.03b2-羟基异丁酸—594-61-6814———0.12±0.013-甲基丁酸0.000 2503-74-2864——0.30±0.01a0.23±0.02b2-甲基丁酸0.000 1116-53-0870——0.07±0.00—2-乙酰基呋喃101192-62-7908—0.24±0.03a—0.09±0.01b4-烯丙基苯甲醚—140-67-01 2870.10±0.01———
注:采用化合物在水中的嗅觉阈值进行分析;表中各组含量为“平均值±标准差”;“—”代表未检出或无此物质阈值信息;不同小写字母表示有显著性差异(P<0.05);CL、CLS、XL、XLS分别表示传统工艺城口老腊肉生制品、熟制品和现代工艺城口老腊肉生制品、熟制品(下同)。
为了进一步分析蒸煮前后城口农家和工厂老腊肉中挥发性风味物质含量的差异,对4种腊肉样品进行热图聚类分析。由图2看出,农家和工厂生产的城口老腊肉挥发性风味物质的种类丰富,不同工艺腊肉样品在化合物种类和含量上存在差异,同种工艺的城口老腊肉蒸煮前后化合物种类和含量基本没有变化。整体而言,工厂样品中的挥发性风味物质含量和种类数量都高于农家,而酚类是4个样品中含量最高的挥发性组分,其次是醇类、烃类、酯类。
图2 挥发性风味物质热图
Fig.2 Thermogram of volatile flavors
酚类是腊肉烟熏风味的重要挥发性成分,也是检测到的挥发性成分种类最多的类别,主要由烟熏木材的木质素分解产生[14]。分析表明苯酚、愈创木酚等7种共有成分对腊肉风味形成具有关键作用,提供了酚香、烟熏味、药香和木香在内的多种气味,特别是愈创木酚、4-甲基愈创木酚和4-乙基愈创木酚,所呈现的强烈烟熏气味是城口老腊肉中标志性风味的核心贡献者[15]。农家生产的城口老腊肉在蒸煮前后这3种物质的含量都明显高于工厂,可能是工厂在生产腊肉的过程中烟熏时间较短造成的。
醇类化合物的阈值普遍较高,对腊肉风味的贡献比较有限,多由脂质氧化或羰基还原而来[16]。蒸煮前后,乙醇在2种工艺的城口老腊肉中均普遍存在,贡献了基础的芳香醇味。其中工业化的城口老腊肉中检出的芳樟醇、4-松油醇、β-苯乙醇主要来源于腌制时添加的香辛料,而异丁醇、异戊醇和2,3-丁二醇等饱和醇类因为阈值较高,对腊肉的整体风味贡献不大。另一方面,不饱和醇中的2,6,6-三甲基二环[3.1.1]-2-庚醇以其木质烟熏气息对腊肉的风味形成了一定修饰,乙缩醛二乙醇可赋予产品清冽草香与淡雅酒香。
烃类化合物主要是由脂肪酸烷氧自由基发生裂解反应所生成[17]。在腊肉风味形成的过程中,烷烃是相对贡献较少的一类化合物,由正构烷烃和甲基支链构成的脂肪烃通常具有较高的气味感知阈值,对整体风味的影响较为有限。然而,腊肉挥发性成分中存在多种不饱和烃,这些成分能够发挥增香作用,对腊肉特征风味的形成具有积极意义。4组样本中,农家城口老腊肉中检测出的甲苯,其来源可能与苯丙氨酸等带苯环的氨基酸降解有关,也可能来自饲料。相比之下,工业化生产的城口老腊肉中对风味有贡献的挥发性碳氢化合物大多来自烟熏材料,如月桂烯呈现蜡香、清香、木香等混合香味,γ-松油烯和桧烯除了带有些许油腻感外,也散发出柑橘类香气,这些成分为工业化腊肉风味增添层次[18]。α-柏木烯在工业城口老腊肉中存在依赖人工添加与稳定性处理,而传统烟熏因工艺限制含量极低甚至检测不出,经过蒸煮处理α-柏木烯消失主要是因为挥发、降解及油脂溶出。
醛类物质主要源于加工过程中脂肪的氧化降解,其感官阈值普遍较低,并具有较强的挥发性。在气味上,醛类物质常呈现出令人愉悦的清新草香、烘培麦芽香和甜润果香,是构成腊肉独特风味的重要挥发性物质。例如农家腊肉中的己醛会提供绿色草香味[19],另一种壬醛也会提供柑橘和绿色的香气,而工业生产的城口老腊肉仅在蒸煮过后检测出微量的壬醛,这是因为抗氧化工艺将壬醛前体锁定在结合态,而蒸煮后源于热力破坏结合态和热氧化爆发。
酮类物质的生成与不饱和脂肪酸的氧化降解以及氨基酸的热诱导分解反应密切相关,通常呈现出持久的坚果与乳酪味香气。多数酮类物质的气味阈值相对较高,因此对腊肉整体风味的直接贡献也相对有限,主要发挥风味修饰与协调的作用[6]。但2,3-丁二酮的阈值较低,蒸煮前后都只在工厂生产的城口老腊肉中检出,可作为工厂腊肉关键风味的重要贡献物质。腊肉中的酮类化合物的形成途径以美拉德反应为主,同时脂肪的降解与氧化反应以及这些初级产物的进一步转化也是来源之一。尽管酮类化合物在腊肉中检出的种类和含量均低于醛类,且气味阈值通常高于相应的醛类同分异构体,致使其对风味的直接影响不及醛类,但它在肉制品风味形成过程中仍具有一定的辅助增强作用[20]。在腊肉风味形成体系中,酯类物质的生成涉及多重生物化学途径,主要是由微生物代谢活动催化醇类和羧酸类化合物发生酯化反应而生成。因为其通常呈现出宜人的果香与香甜气息,对腊肉的特征风味构成具有重要贡献。在工业化生产的城口老腊肉中,无论是蒸煮前或蒸煮后,酯类物质的种类多样性均较农家腊肉更为丰富,因而在抑制脂肪酸辛辣味及中和氨基酸类物质苦味方面的作用也更为显著。被检出的酯类成分中,乙酯类化合物的含量最为丰富,占优势的形成原因可能是羧酸分子中的羟基与醇分子中的氢氧基在脂肪酶的有效催化下,更容易发生亲核取代反应[21],从而高效生成相应的乙酯类化合物。
酸类物质在腊肉中主要通过醛类物质的氧化反应和碳水化合物代谢途径生成。乙酸是城口老腊肉的主要酸类物质,在农家城口老腊肉蒸煮后和工业城口老腊肉蒸煮前后均检出,本研究检测出的脂肪酸类物质的种类和含量都较少,由于酸类物质普遍具有较高的气味阈值,因此对腊肉整体风味的直接贡献并不显著[22]。
2.2.2 不同工艺的城口老腊肉香气活性成分
OAV法可以与HS-SPME-GC-MS的结果相结合,有效识别出对腊肉风味形成具有重要影响的香气活性成分[23]。腊肉样品实际的浓度和气味阈值共同决定了挥发性风味物质对腊肉最终香气特征的影响程度。通过计算各挥发性物质的OAV(基于水中的阈值),可以实现对风味贡献作用的评估。普遍将OAV>1作为判断标准,认为此类挥发性物质对样品整体风味特征形成了重要的影响[24],也为评估城口老腊肉中的香气活性成分提供重要的依据。从城口腊肉中共检出51种挥发性物质的OAV>1,其中农家腊肉检测出18种,经过蒸煮工艺后检测出20种。工厂腊肉检出36种,经过蒸煮工艺后检测出35种。在51种挥发性物质中,不同类别的OAV表现出明显的差异,酚类物质和酯类物质的OAV普遍维持在较高水平,多数数值接近或超过1 000,表明这两类物质的腊肉特征风味形成具有重要贡献;相比之下醇类、烃类物质的OAV大多集中在100左右,对香气贡献相对有限。此外,通过分析还发现部分酮类、酚类、呋喃类物质的OAV处于较低水平,说明对腊肉的整体风味组成影响较小(表2)。总体而言,城口老腊肉的特征风味是由多种物质共同作用形成的复杂体系,酚类和酯类物质在风味形成中起到重要作用,其次是酮类、醇类和烃类。
表2 不同工艺的城口老腊肉蒸煮前后挥发性风味物质OAV
Table 2 Volatile flavor compounds OAV before and after cooking of Chengkou bacon with different technologies
挥发性物质OAVCLCLSXLXLS苯酚2 428.573 701.3272.73298.72-甲酚983.331 383.33—66.67愈创木酚650961.11266.67266.673-甲酚1 6252 475——麦芽酚812——4-甲基愈创木酚12 80013 2002 4002 7004-乙基愈创木酚74 00070 0007 50010 5002-甲氧基-4-乙烯基苯酚73.3360——二氢丁香酚591.55———2,6-二甲氧基-4-甲基苯酚6 666.675 777.781 222.221 111.11异丁香酚7652——2,6-二叔丁基对甲基苯酚—1.06——异丁醇——3.7515乙缩醛二乙醇——6.126.12异戊醇——846.151 076.922-甲基-1-丁醇——1 166.671 833.332-糠醇—1.9——桉树醇——141.67191.67芳樟醇——5 057.476 666.67β-苯乙醇——7209204-松油醇——14.2921.432,6,6-三甲基二环[3.1.1]-2-庚醇——1018.57甲苯1.53———桧烯4.41—1.765.88月桂烯——1.182.94右旋萜二烯21.4311.4315.7132.86γ-松油烯——30502,3-丁二酮——5 932.210 338.983-羟基-2-丁酮4.31—93.8130.182-庚酮——60—甲基环戊烯醇酮—8.5——乙酸甲酯——5.25—乙酸乙酯7484—248异丁酸甲酯——7001 000丁酸甲酯——300200异丁酸乙酯——400700异戊酸甲酯——4 6004 7002-甲基丁酸乙酯——1.91.433-甲基丁酸乙酯——73 333.3366 666.67乙酸异戊酯——15 00021 666.67己酸甲酯——3 8005 100己酸乙酯—400700800戊酸异戊酯——1 200—癸酸乙酯——5.81—己醛—11.11——糠醛—190——壬醛750600—450桂醛32.5———乙酸—28.57522.86128.573-甲基丁酸——1 50011502-甲基丁酸——700—
注:表中“—”代表此物质OAV在本文中无法计算得到。
2.3 不同工艺城口老腊肉对主成分分析(principal components analysis,PCA)和OPLS-DA的影响
PCA可以通过线性变换将原始数据中包含的主要信息浓缩到少数几个不相关的主成分(principal component,PC)中,通常所选取PC的累计方差贡献率越高,说明其保留原始变量信息的能力越强,从而更好地反映各样品间的整体差异与结构特征。OPLS-DA是一种有监督的降维技术,通过在建模过程中分离与判断类别间关系从而提供更具有解释性的可视化结果,适用于建立物质表达量与样品分类之间的关系模型[25],以筛选关键的差异物质。OPLS-DA模型会极力拟合甚至放大数据中的差异信号,这导致其存在过拟合的风险,因此,对OPLS-DA模型需要进行严格的验证。通过腊肉样品的HS-SPME-GC-MS结果进行PCA,结果显示,第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的贡献率分别为70.6%和14.8%,累计贡献率达到了85.4%。较高的累计贡献率表明PC1和PC2能够充分代表原始数据集中的主要变异信息。图3-A显示4组样品呈现出清晰的组内聚集和组间分离态势,直观反映了各组样品在挥发性风味物质组成上存在着显著差异。OPLS-DA腊肉中的关键标志香气化合物时发现,4组样品间差异较为明显,工厂腊肉蒸煮前后重要香气活性成分都更集中,而农家腊肉重要香气活性成分更为分散(图3-B)。本次分析中,自变量拟合指数(R2X)为0.992,因变量拟合指数(R2Y)为0.999,反映变量的变异信息几乎可以被模型完全解释。此外,模型预测指数(Q2)为0.998,通常R2和Q2超过0.5则认为模型拟合结果具有可靠的解释力和预测精度[26]。为避免存在过拟合现象,进行200次置换检验,如图3-C所示,检验生成的Q2回归线与纵轴相交于零点以下,说明模型不存在过拟合,证实模型的有效性,可用于支持城口农家和工厂老腊肉在主体风味具有一致性的判断。
A-农家和工厂腊肉PCA评分图;B-农家和工厂腊肉OPLS-DA评分图;C-模型交叉验证结果
图3 城口农家和工厂腊肉挥发性成分分析
Fig.3 Analysis of volatile components of in Chengkou bacon farmhouse and factory
VIP值是不同工艺的城口老腊肉样品中每种挥发性化合物对城口老腊肉样品的风味影响程度大小的量化指标,VIP值越高,表明化合物在不同工艺的腊肉组间区分效力越显著,因此可作为识别城口老腊肉重要香气活性成分的依据。根据VIP值进一步分析发现,在所有检测出的挥发性物质中共有30种VIP值>1的物质(图4)。为进一步筛选出组间差异最显著的化合物,基于OPLS-DA结果与差异倍数(fold change,FC)≥2或FC≤0.5进行联合筛选,最终筛选出了5种差异代谢物质:乙酸、右旋萜二烯、己烷、邻二甲苯、桧烯。这5种挥发性风味化合物对城口老腊肉不同工艺造成的差异贡献最为显著,其变化可能直接与工艺参数所造成的特征风味形成途径有关。
图4 城口农家和工厂腊肉VIP评分图
Fig.4 VIP score chart of Chengkou bacon farmers and factories
注:红色部分表示代谢物的VIP值>1,绿色部分表示代谢物的VIP值≤1。
3 结论与讨论
通过对农家传统工艺与工厂工业化生产的城口老腊肉理化性质进行对比,发现两者蒸煮前后的水分、蛋白质、脂肪、氯化物以及亚硝酸盐含量都存在显著差异,其中工厂腊肉的水分、蛋白质和亚硝酸盐含量高于农家,可能是由于加工方式有关。采用HS-SPME-GC/MS技术共检测出77种挥发性风味物质,其中工厂腊肉在蒸煮前后的种类数和总量上均显著高于农家腊肉。OAV分析表明,农家腊肉以酚类物质为主导,而工厂腊肉则依赖于酯类、醇类和酮类物质,风味更为复杂。PCA与OPLS-DA显示,4组样品均能显著分离,工厂腊肉蒸煮前后的重要香气活性成分都更集中,而农家更为分散。根据VIP值,共筛选出30个VIP值>1的物质,包括乙酸、右旋萜二烯、己烷、邻二甲苯、桧烯等。本研究虽存在局限但初步阐明了不同工艺下城口老腊肉风味特征的差异,研究结果可为城口老腊肉不同工艺的烟熏风味控制提供一定的指导。
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