胶原蛋白是人体最丰富的结构蛋白,构成全身支撑组织的骨架,是生命活动的支架。目前,在脊椎动物中可以分离得到28种天然胶原蛋白,主要存在于动物的皮肤中,骨骼、韧带、内脏、血管、虹膜、角膜等结缔组织中[1],具有支撑器官、保护机体的功能[2]。在分子结构层面,胶原蛋白由3条多肽链组成,形成独特的三螺旋结构[3]。在胶原三螺旋结构中,每条多肽链由Gly-X-Y的氨基酸重复序列重复组成(X位通常是脯氨酸,Y位通常为4-羟脯氨酸),而其结构的稳定性主要依赖于脯氨酸和羟脯氨酸的脂环族特性[4]。这种脂环残基通过占据螺旋位中的Gly位形成刚性约束,从而稳固整个三股超螺旋构象。胶原蛋白这种独特的三螺旋构象可以直接介导细胞膜受体的相互作用,促进细胞黏附、增殖和迁移等关键的生物学过程[5]。
胶原蛋白和胶原基生物材料主要从动物组织、植物、海洋生物等自然来源中分离得到,但是普遍存在质量和纯度不均一等问题,并且具有病原体传播及免疫原性等风险[6]。目前,常见的胶原蛋白制备的方式包括:组织提取[7-8]、化学合成[9]和微生物重组表达[10]。其中微生物表达制备的重组胶原蛋白具有成本低、产量高、安全性高等突出优势,此方法逐渐成为胶原蛋白制备的主要方式[11]。大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统是以工程化质粒载体在E.coli中高效表达外源基因的原核表达平台[1],因其成本低、生长快、易于遗传操作、基因组特征良好、异源基因表达能力高等优点[12-13],已成为重组蛋白生产中使用最广泛的原核宿主之一。
然而,重组胶原蛋白在医用材料领域仍旧面临重大挑战:结构的稳定性与机械性能的局限性。一方面,现有的重组胶原蛋白难以具备三螺旋结构[14],或者热稳定差导致三螺旋极易解链[15];另一方面,天然胶原蛋白具有较长的分子链结构,组装机械性能强,是胶原基材料成为生物医学领域材料的主要优势[16]。然而重组胶原蛋白在工程化过程中链长显著低于天然胶原(仅为天然分子的10%～30%),导致链间缠结力不够,难以自组装形成稳定的水凝胶[17]。针对机械性能方面的问题,研究学者提出一种低毒性且具有光活性的小分子物质-甲基丙烯酸酐(methacrylic anhydride,MA),它可以与胶原肽链侧链氨基发生亲核取代反应,在光交联剂和光照的共同作用下形成具有三维网络的水凝胶[18-19],从而有效提升重组胶原蛋白水凝胶的稳定性和机械强度。
因此,基于胡金远等[17]和HU等[20]在重组胶原蛋白序列设计领域的研究,将V-P5BP5和V-P10BBP10这2条不同序列长度的重组胶原蛋白作为模式分子进行研究。将表达得到的重组胶原蛋白P5BP5和P10BBP10进行甲基丙烯酰化后通过光交联方式制备出水凝胶,探究重组胶原蛋白序列长度对光交联制备的水凝胶性能的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株与质粒
E.coli BL21(DE3)菌株及质粒pColdⅢ为研究室保藏。实验所用基因片段由苏州金唯智有限公司合成。实验过程中涉及的菌株和质粒如表1所示。
表1 本研究所使用的菌株和质粒
Table 1 Strains and plasmids used in this study
菌株和质粒特性来源菌株E.coli BL21(DE3)E.coli,野生型,表达宿主实验室保存质粒pColdⅢE.coli BL21(DE3)表达载体,Ampr实验室保存pColdⅢ-V-P5BP5E.coli BL21(DE3)中整合质粒pColdⅢ-V-P5BP5,Ampr本实验pColdⅢ-V-P10BBP10E.coli BL21(DE3)中整合质粒pColdⅢ-V-P10BBP10,Ampr本实验
注:r表示抗生素抗性。
1.1.2 主要试剂
质粒提取、基因片段回收试剂盒和抗生素,生工生物工程(上海)股份有限公司;酵母提取物、胰蛋白胨,OXOID公司;IPTG,Biosharp公司;SDS-PAGE预制胶、蛋白电泳缓冲液,常州天地人和生物科技有限公司;Protein Marker,宝日医生物技术(北京)有限公司;研究中使用的其他化学品均购于西格玛奥德里奇公司、中国医药集团有限公司或生工生物工程(上海)股份有限公司。
1.1.3 培养基
LB固体培养基(g/L):胰蛋白胨10、酵母提取物5、NaCl 10、琼脂粉(固体)20。
LB液体培养基(g/L):胰蛋白胨10、酵母提取物5、NaCl 10。
TB培养基(g/L):胰蛋白胨12、酵母提取物24、KH2PO4 2.31、K2HPO4·3H2O 16.43,甘油4 mL。
1.2 仪器与设备
ZQZY-HC振荡培养箱,上海知楚仪器有限公司;DYCP-24DN蛋白胶垂直电泳仪,美国BIO-RAD公司;AKTA pure蛋白纯化仪,美国General Electric公司;Chirascan圆二色谱仪,英国Applied Photophysics公司;ultrafleXtreme基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪,美国布鲁克道尔顿公司;NEXUS傅里叶变换红外光谱仪,美国尼高力仪器公司;AVANCE NEO 600MHz核磁共振波谱(nuclear magnetic resonance,NMR)仪,德国布鲁克公司。
1.3 实验方法
1.3.1 重组菌株的构建
重组胶原蛋白V-P5BP5和V-P10BBP10,序列前端包含折叠域V-domain(V)和N端组氨酸(His)标签,利用PCR将其转入pColdⅢ质粒,得到的重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)表达体系中。转化后的E.coli BL21(DE3)涂布于含50 μg/mL的氨苄抗性的LB固体平板,37 ℃下培养24 h后挑取单菌落并且在LB液体培养基中培养,送基因测序。测序验证成功后确定其为V-P5BP5和V-P10BBP10。
1.3.2 重组菌诱导表达胶原蛋白的条件
将验证正确的基因工程菌进行划线,在含有氨苄抗性的LB平板37 ℃恒温培养24 h。菌落长出后,挑取单菌落接种于含50 μg/mL氨苄抗性的LB液体培养基,37 ℃摇床过夜培养。将在LB液体培养基中培养完成的种子液,按照接种量为1%接种于含氨苄抗性的TB液体培养基中。在37 ℃下过夜培养24 h后,添加终浓度为1 mmo/L的诱导剂IPTG在25 ℃摇床下诱导10 h,接着转入15 ℃低温培养14 h。至此,培养结束。
1.3.3 重组胶原蛋白的纯化、酶切
利用离心机(6 500 r/min,10 min)收集发酵完成的菌体,将收集到的菌体重悬于缓冲液A中,利用高压均质机进行破碎。破碎完成后离心(8 000 r/min,30 min)收集上清液。上清液经过0.45 μm滤膜过滤后利用蛋白纯化仪AKTA pure准备上样。采用5 mL的His Trap HP柱进行Ni2+亲和纯化。首先利用5个柱体积的缓冲液B冲洗柱子和仪器。接着利用5个柱体积的缓冲液A平衡柱子后上样。上样结束后,继续利用缓冲液A冲洗8个柱体积,以冲洗掉少量杂蛋白。然后用缓冲液B进行梯度洗脱(50、400、500 mmol/L)。将经过纯化得到的重组胶原蛋白进一步利用胰蛋白酶在25 ℃切除所制备胶原蛋白的球状结构域(V)。酶切完成后,利用Hitrap Desalting柱置换其缓冲液为超纯水,于-50 ℃进行真空冷冻干燥。
1.3.4 甲基丙烯酰化重组胶原蛋白的制备
该合成方法基于已报道的实验方案[18]进行部分修改。将冻干后的重组胶原蛋白精确溶解于磷酸盐缓冲液(10 mmol/L,pH 7.4)中,反应初始蛋白浓度为2 mmol/L。待完全溶解后,在35 ℃恒温、200 r/min磁力搅拌的条件下,以每10 min加入14 μL的速度添加MA。每隔30 min使用200 mmol/L NaOH溶液将反应体系pH值回调至约7.4,以确保反应的稳定性。反应结束后,加入10倍体积的PB缓冲液对样品体系进行置换,以去除未反应的MA及杂质。随后,采用3 000 Da分子质量截止值的分子筛浓缩管对蛋白质进行分段浓缩,残留的MA则通过HPLC进行定量分析。
1.3.5 甲基丙烯酰化重组胶原蛋白光交联水凝胶的制备
向超滤后的甲基丙烯酰化重组胶原蛋白溶液中添加光引发剂-苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂,光引发剂的工作质量浓度为10 mg/mL。在此基础上,水凝胶的形成通过使用工作距离为5 cm、波长为405 nm的蓝紫色可见光在常温常压条件下辐照30 s达成。最终形成的水凝胶在4 ℃环境下贮存,直至后续使用。
1.3.6 SDS-PAGE
将每一步所得的重组胶原蛋白利用SDS-PAGE对重组胶原蛋白的表达纯度进行验证。取待测蛋白样品40 μL与loading buffer 10 μL在100 ℃加热5 min后取出,小型离心机离心1 min后,加样于预制胶的凹槽中。利用垂直蛋白电泳仪,设置电压为130 V,定时70 min。当溴酚蓝指示线移动至预制胶底部时,停止电泳。取出预制胶放置于R250染色液中,利用微波炉加热1 min后,放置于水平摇床上染色30 min。将染色完成的预制胶用水冲洗掉多余的染料后,倒入适量的脱色液,放置于微波炉中加热2 min后放置摇床上进行脱色。当染色液的颜色完全脱去后,即可观察条带的纯度。
1.3.7 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱用于确认目标胶原蛋白的分子质量。将1 μL的1 mg/mL样品溶液滴加至600 μm AnchorChip靶板表面,静置干燥。所用基质包括:2,5-二羟基苯乙酮(5 mg/mL)、乙醇(25%,体积分数)及氢氧化二铵柠檬酸盐(1.5 mg/mL),工作模式为线性模式,外部校准采用牛血清白蛋白,最终数据通过AB Sciex 4800质谱仪以正模式线性中等质量范围采集。
1.3.8 圆二色光谱表征
将冻干胶原蛋白粉末溶于10 mmol/L PB缓冲液,配制成1 mg/mL的均质胶原蛋白溶液后,在4 ℃冷藏环境中静置24 h。采用1 mm光程的石英比色皿作为样品池,结合Peltier型温控系统进行圆二色光谱检测。在低温检测模式(4 ℃)下,波长扫描范围设置为190～260 nm,光谱分辨率为1 nm/步,每步数据采集间隔5 s。热变处理通过在220 nm特征吸收峰附近实施温度梯度控制,设定升降温范围4～80 ℃,采用恒定升温速率10 ℃/h,每个温度点保持8 s平衡时间以确保测量精度。通过圆二色光谱在220 nm扫描得到热变曲线后,利用Origin软件对热变曲线进行一阶求导[20],通过差分函数拟合确定胶原蛋白的熔融温度(Tm),该参数用于表征其热稳定性特征。拟合所用的差分函数如公式(1)所示:
(1)
式中:i取整数且为4～80。
1.3.9 傅里叶变换红外光谱
将冻干完成的胶原蛋白粉末放置于傅里叶变换红外光谱仪置物台上,将样品完全覆盖红外光路后,将反应釜旋下压紧样品后开始测试。首选测试样品加背景的红外谱图,测试完成后,将样品移除,测试背景谱图的同时最终呈现出扣除背景的样品谱图。以此谱图进行样品分析。
1.3.10 NMR
采用质子NMR仪对甲基丙烯酰化前后的液体样品进行表征。分析在室温条件下实施,样品溶液浓度为0.5 mmol/L。为消除溶剂中氢信号的干扰,采用重水作为溶剂。在14.1 T超导磁体产生的强磁场下,配54 mm石英样品管检测装置,1H核信号信噪比(S/N)均达850∶1以上,确保信号检测的精度与稳定性。
1.3.11 取代度
采用2,4,6-三硝基苯磺酸比色法对甲基丙烯酰化重组胶原蛋白的取代度进行定量分析。将化学修饰前后的样品分别溶于0.1 mol/L NaHCO3溶液中,配制终质量浓度为1.6 mg/mL的待测溶液。向每份样品中加入2 g/L的2,4,6-三硝基苯磺酸试剂,37 ℃恒温反应3 h。反应终止时,加入1 mol/L盐酸与100 g/L SDS溶液终止化学反应。最终在335 nm波长处测得样品的吸光度值,并通过与梯度浓度的甘氨酸标准溶液建立的工作曲线进行比对分析。
1.3.12 微流变
将样品与含有荧光小球的溶液进行混合,混合均匀后将其加入2块1 mm厚玻璃中间的空隙,毛玻璃的头和尾分别用封口膜进行塑封。样品制作完成后将待测玻片放置于显微镜下,通过电脑识别并记录其中小球的运动轨迹计算出其储能模量(G′)和耗能模量(G″)后分析样品状态。
1.4 数据处理
实验数据采用Excel进行处理,Origin 2021软件进行图形的绘制。
2 结果与分析
2.1 重组胶原蛋白的表征
基于胡金远等[17]和HU等[20]的研究结果,选用2种不同序列长度的重组胶原蛋白V-P5BP5和V-P10BBP10作为模式分子,其中V-P5BP5的序列长度为V-P10BBP10长度的0.5倍,序列结构如图1-a所示。以此通过E.coli BL21(DE3)/pColdⅢ表达重组胶原蛋白。
泳道M-Marker;图b和c中,泳道1～3-分别对应咪唑洗脱浓度为50、400、500 mmol/L;泳道-4:P5BP5;泳道5-P10BBP10。
a-重组胶原蛋白序列结构;b-V-P5BP5咪唑梯度洗脱SDS-PAGE图;c-V-P10BBP10咪唑梯度洗脱SDS-PAGE图;d-胰蛋白酶酶切V-domain
图1 重组胶原蛋白序列结构及表达纯化、酶切验证
Fig.1 Recombinant collagen sequence design,expression purification,and digestion verification
将发酵后的重组胶原蛋白菌体V-P5BP5和V-P10BBP10利用高压匀浆机进行破碎,离心后收集上清液,利用在序列N端设计的His标签进行纯化。设计不同梯度的咪唑浓度洗脱蛋白样品,通过SDS-PAGE对洗脱样品进行验证。V-P5BP5和V-P10BBP10重组胶原蛋白的SDS-PAGE电泳图如图1-b和图1-c所示,在50 mmol/L的咪唑浓度下洗脱下大量杂蛋白,500 mmol/L咪唑浓度下蛋白量很少。在400 mmol/L梯度下洗脱得到大量目标蛋白。因此后续将富集400 mmol/L梯度洗脱下的样品进行胰蛋白酶酶切。酶切结果如图1-d所示。在经过25 ℃、时间12 h的酶切情况下,杂蛋白被切碎,目标蛋白切除折叠域(V-domain),通过SDS-PAGE电泳图判断重组胶原蛋白纯度达到95%以上。将胡金远等[17]和HU等[20]的实验结果进行重复验证并进行对比,证明与其结果保持一致。
2.2 重组胶原蛋白分子质量的验证
进一步利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对所制备的重组胶原蛋白P5BP5和P10BBP10进行分子质量的验证。质谱结果显示如图2所示,P5BP5胶原蛋白的分子质量为10 400.042 Da,理论分子质量为10 462.365 Da;P10BBP10胶原蛋白的分子质量为20 600.83 Da,理论分子质量为20 649.43 Da。2种蛋白的理论分子质量和实际分子质量相吻合。因此确定所制备的为目标蛋白P5BP5和P10BBP10。将结果与胡金远等[20]的研究进行对比,得到一致性结果。
a-P5BP5;b-P10BBP10
图2 重组胶原蛋白的飞行时间质谱鉴定
Fig.2 Time-of-flight mass spectrometry identification of recombinant collagen
2.3 重组胶原蛋白三螺旋和热稳定性
圆二色光谱验证P5BP5和P10BBP10的二级结构和热稳定性。全波长图谱如图3-a所示,波长扫描范围为190～260 nm,P5BP5和P10BBP10在220 nm附近存在胶原蛋白二级结构的正特征峰,在200 nm附近存在负特征峰,说明所表达的重组胶原蛋白正确折叠形成三螺旋结构。相比较来看,P10BBP10的分子椭圆率(2.62)略低于P5BP5(3.17),可能由于P10BBP10肽链较长,纯化过程三螺旋结构受到影响。进一步利用圆二色光谱在220 nm,温度为4～80 ℃扫描热变曲线。热变温度图谱如图3-b所示,一阶求导拟合得到图3-c,拟合结果显示P5BP5的Tm值为44 ℃,P10BBP10的Tm值为49 ℃,热稳定性高。将二级结构程度与热稳定性与胡金远等[20]的研究进行对比,结果保持一致。
a-全波长;b-热变曲线;c-热变曲线一阶导
图3 重组胶原蛋白的圆二色光谱
Fig.3 Circular dichromatic spectra of recombinant collagen
2.4 验证MA插入重组胶原蛋白
将MA逐滴加入反应的蛋白体系中,过程中利用200 mmol/L的NaOH溶液调节pH。当测定pH不再发生改变时,则证明反应终止。将得到的混合溶液以1∶10的体积置换缓冲液PB以除去未反应的MA和杂质。即得到具有光活性的P5BP5-MA和P10BBP10-MA样品,将样品进行冷冻干燥以备后续检测使用。
将冻干的样品溶解在重水中,过夜平衡后,在室温下进行1H NMR分析,记录每个样品的化学位移,结果如图4所示。相较于未进行化学修饰的样品,经过化学修饰的重组胶原蛋白样品在5.4 ppm附近和5.8 ppm附近均检测到新的特征峰,根据文献中的报道[21],这2个峰是甲基丙烯酰胺质子峰,可表明甲基丙烯酰化成功。在此范围内衍生出其他的小峰可能是胶原蛋白其他的一些侧链基团也发生了衍生化反应。进一步利用傅里叶变换红外光谱进行检测,光谱记录在4 000～400 cm-1,使用傅里叶变换红外光谱分光光度计进行32次扫描。结果如图5所示。对比未经过化学修饰的红外光谱图,经过甲基丙烯酰化的重组胶原蛋白在1 730 cm-1附近出现新的吸收峰,这是由于形成的酰胺键C
O(特别是酸酐开环后形成的特征酰胺峰)。并且,甲基丙烯酰化后的重组胶原蛋白在1 130 cm-1附近出现新的特征峰,这是由于MA与重组胶原蛋白侧链氨基发生取代反应后生成的酯基(C—O—C)。
a-P5BP5化学修饰前后对比;b-P10BBP10化学修饰前后对比
图4 重组胶原蛋白化学修饰前后核磁氢谱
Fig.4 1H NMR spectra before and after chemical modification of recombinant collagen
a-P5BP5化学修饰前后对比;b-P10BBP10化学修饰前后对比
图5 重组胶原蛋白化学修饰前后傅里叶红外光谱图
Fig.5 Fourier transform infrared spectra before and after chemical modification of recombinant collagen
因此,通过1H NMR和傅里叶变换红外光谱在化学修饰后的图谱中出现的新的特征峰能证明MA成功插入重组胶原蛋白。
2.5 甲基丙烯酰化重组胶原蛋白取代度
采用三硝基苯磺酸法分析量化重组胶原蛋白分子侧链氨基的取代程度(图6),利用甘氨酸浓度标准曲线(图6-a)的拟合结果,计算得出P5BP5-MA和P10BBP10-MA的取代度分别为91.2%和91.3%(图6-b)。实验结果表明,2种蛋白的侧链氨基反应程度均较高,证实了其在甲基丙烯酰化过程中实现充分的转化。这一取代水平为后续材料的结构与功能调控提供重要的参数依据。
a-甘氨酸标准曲线;b-甲基丙烯酰化重组胶原蛋白取代度
图6 甲基丙烯酰化重组胶原蛋白取代度
Fig.6 Substitution degree of methacrylated recombinant collagen
2.6 甲基丙烯酰化重组胶原蛋白水凝胶微流变
为进一步验证不同序列形成的水凝胶机械强度,将得到的甲基丙烯酰化重组胶原蛋白P5BP5-MA和P10BBP10-MA置于2 mL的塑料管中,向其中加入光交联剂(苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂)后,在405 nm蓝紫色可见光的共同作用下交联形成水凝胶,并通过微流变实验进行表征。将经过光照的样品与含有荧光小球的溶液进行混合,混合均匀后将其加入2块1 mm厚玻璃中间的空隙,毛玻璃的头和尾分别用封口膜进行塑封。样品制作完成后将样品放置于显微镜下,通过电脑识别并记录其中小球的运动轨迹计算出其G′和G″。
结果显示,频率为0.1～100 rad/s时,P5BP5-MA始终G″>G′,且G′和G″无交点(图7-a),说明在此制备环境下P5BP5-MA没有成胶的趋势。而P10BBP10-MA样品,在低频下,即小球振动缓慢的过程中,G′>G″,此时样品状态为水凝胶。随着频率的增加,G′逐渐下降,G″逐渐上升,2条线出现交点。图7-b显示频率-G′和G″在2.72 rad/s处交叠。该交点频率对应水凝胶从弹性主导(G′>G″)向黏性主导(G′<G″)过渡的临界频率,反映了凝胶网络在该频率下的动态解离行为。当频率继续增加,小球振动剧烈时,G′<G″,样品由凝胶状态转变为溶液状态。因此,P10BBP10甲基丙烯酰化重组胶原蛋白为水凝胶,而P5BP5为黏性溶液。
a-P5BP5-MA;b-P10BBP10-MA
图7 甲基丙烯酰化重组胶原蛋白水凝胶微流变
Fig.7 Microrheology of methylacrylatelated recombinant collagen hydrogel
2.7 甲基丙烯酰化重组胶原蛋白水凝胶宏观表现
P5BP5-MA水凝胶和P10BBP10-MA水凝胶制备结果如图8所示。倒置状态可以明显看出,P5BP5-MA水凝胶倒置明显快速滑落,没有水凝胶自持力,状态接近于溶液。而P10BBP10-MA样品可以黏附在管底不滑落,具有一定的水凝胶自持力。
a-P5BP5-MA水凝胶;b-P10BBP10-MA水凝胶
图8 甲基丙烯酰化重组胶原蛋白水凝胶宏观表现
Fig.8 Macroscopic performance of methylacrylated recombinant collagen hydrogel
3 结论与讨论
本研究基于前期的研究成果,选取重组胶原蛋白分子V-P5BP5和V-P10BBP10作为模式蛋白,其中V-P5BP5序列长度为V-P10BBP10长度的0.5倍,以此探究不同长度重组胶原蛋白序列对光交联制备水凝胶性能的影响。通过SDS-PAGE验证经过纯化酶切的重组胶原蛋白P5BP5、P10BBP10的纯度达到95%以上,通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱确定P5BP5、P10BBP10的理论分子质量和实际相吻合。通过圆二色光谱,对P5BP5和P10BBP10重组胶原蛋白进行二级结构和热稳定性的验证。发现在220 nm附近,P5BP5和P10BBP10均存在正峰,说明均正确折叠形成三螺旋结构。通过热变曲线的一阶导确定P5BP5的Tm为44 ℃、P10BBP10的Tm为49 ℃。将重组胶原蛋白进行甲基丙烯酰化,通过核磁氢谱在5.4 ppm和5.8 ppm附近出现新的特征峰以及红外光谱在1 130、1 730 cm-1附近出现新的吸收峰,从而确定甲基丙烯酸成功插入胶原蛋白。通过三硝基苯磺酸法检测甲基丙烯酰化重组胶原蛋白的取代度,发现2种模式蛋白的取代度接近,约为91%。P5BP5-MA和P10BBP10-MA在光交联剂和405 nm蓝紫色可见光的共同作用下交联形成水凝胶。发现P5BP5甲基丙烯酰化重组胶原蛋白仅形成了黏性溶液,而P10BBP10甲基丙烯酰化重组胶原蛋白形成了具有一定自持力的水凝胶。
实验结果表明,虽然P5BP5和P10BBP10均为胶原蛋白分子,但是由于其序列长度不同,从而经过甲基丙烯酰化后光交联制备的水凝胶的状态也不同。本实验结果说明重组胶原蛋白的序列越长,在光交联的辅助作用下重组胶原蛋白更能制备为水凝胶。实验所选取的P10BBP10序列长度为P5BP5的序列长度的2倍,初步揭示了其对水凝胶微观和宏观表现的机械强度影响,但尚未系统探究序列长度变化对材料性能的影响。未来将进一步研究不同倍数序列长度对胶原蛋白的交联密度、孔径结构及力学性能等方面的影响。这为制备具有一定机械性能的重组胶原蛋白水凝胶的序列长度设计提供了思路。
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