抗菌肽设计优化策略与异源表达研究进展

抗生素滥用使得多重耐药菌不断增多,细菌的耐药性日益成为一个全球性的难题[1]。有研究表明,如果不及时研发新型抗菌剂,到2050年,全球每年将有1 000万人因细菌耐药而死亡。因此,寻找新的抗菌药物已成为当务之急。抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是通常由10～50个氨基酸组成并在生物体内广泛存在的一类小分子寡肽,天然AMPs存在于原核生物和真核生物中,如图1所示,AMPs的来源与应用广泛。与抗生素通过特定方式直接影响细菌生命活动发挥杀伤作用不同,AMPs可直接作用于细胞膜,其膜靶向机制如图2所示。AMPs因其作用靶点广、不易产生抗药性,是抗生素的理想替代品。

然而,AMPs的实际应用仍面临多重深层挑战,现有研究尚未充分破解设计与表达两大核心环节中的根本性瓶颈。在设计层面,天然AMPs的 “结构-活性” 关联机制尚未完全阐明,关键结构特征如α-螺旋/β-折叠的比例、两亲性分布、正电荷密度的最优阈值与抗菌活性、酶解稳定性、宿主毒性之间的量化关系缺乏系统规律,导致传统改造多依赖经验试错,设计效率低下;同时,计算机辅助设计虽已取得进展,但训练样本多集中于少数经典AMPs家族,如天蚕素类和防御素类,对极端环境来源与新型拓扑结构的AMPs覆盖不足,样本普适性缺陷导致预测模型在非经典序列设计中的精度大幅下降,难以实现 “按需定制” 高性能AMPs。在表达层面,AMPs的膜破坏特性易对宿主细胞产生非特异性毒性,其阳离子性与疏水性还可能导致自身聚集或被宿主蛋白酶降解,严重限制产物积累;更核心的矛盾在于翻译后修饰的精准性与规模化成本的失衡,原核表达系统如大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli),虽培养成本低、生长迅速,但无法实现糖基化、酰胺化等关键修饰,导致产物活性不足;真核系统如毕赤酵母(Pichia pastoris,P.pastoris),虽具备修饰能力,但修饰类型与程度存在异质性,可能导致产物活性不均一,同时其高密度发酵工艺复杂、成本较高;植物表达系统虽兼具成本与安全性优势,但修饰效率有限且面临严格的转基因监管,监管不确定性和高昂的合规成本是阻碍其快速发展的主要因素,这些因素直接导致了漫长的开发周期[3]。此外,现有研究多聚焦于实验室水平的活性验证,对上述设计与表达瓶颈引发的后续问题,如产物批次差异、规模化纯化困难关注不足,进一步阻碍了AMPs的临床转化。

基于此,本文将从AMPs的设计改造与异源表达两大核心方向展开系统综述,深入剖析各环节的具体瓶颈与解决方案,旨在为推动AMPs在抗菌领域的实际应用提供理论支撑与实践思路。

1 AMPs的设计改造

1.1 传统化学改造与修饰

AMPs性能优化中,传统化学改造策略应用广泛。这些策略可根据其作用机制与修饰特点进行系统梳理,如表1所示。氨基酸修饰方面,非天然氨基酸取代可增强AMPs抗蛋白酶水解能力。例如,D-氨基酸通过诱导左手α-螺旋构象降低蛋白酶识别度,工程化阳离子抗菌肽WLBU2的D8对映体(肽链中全部8个L-缬氨酸替换为D-缬氨酸)对中性粒细胞弹性蛋白酶的抗性显著提升。α,α-二取代氨基酸,如α-氨基异丁酸及β/γ-氨基酸则通过稳定二级结构或增加化学多样性提高酶的稳定性[4]。端基修饰中,N端乙酰化可增强对血清氨基肽酶的耐受性,C端酰胺化通过提高正电荷密度提升抗菌活性。肽链引入芳香族氨基酸,能借其侧链苯环的高膜界面亲和力,改善盐敏感性并延长体内半衰期。环化策略通过空间位阻减缓蛋白酶切割,类片球菌素以二硫键环化稳定结构;cycloCP-11(环化多肽CP-11)在CP-11基础上引入二硫键,显著提升蛋白酶稳定性与抗菌活性;还有利用铜(I)催化芳香环加成、N-烷基化或特定位置引入非天然氨基酸环化来稳定α-螺旋,如mag(i+4)15(A9K)(GIGKFLHSKKKFGAXVGEXBNS)在蛋白酶K中孵育200 min未降解[4]。

化学修饰中,脂化修饰通过脂肪酸以酯键/酰胺键连接肽链,显著增强膜透性、生物利用度及抗酶解能力,如十六烷酸修饰的三分支精氨酸-脯氨酸重复肽树状分子在生理盐环境中展现出良好的稳定性和抗菌活性[5];聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)修饰效果因蛋白而异,可稳定溶菌酶与酒精脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)、延长半衰期,且不影响溶菌酶活性,还能保护ADH免受变性剂影响[6];N和C端乙酰化也能在维持构象及活性的同时提升肽的稳定性。此外,也可结合蛋白酶抑制剂,例如将膜蛋白A1活性肽嵌入向日葵胰蛋白酶抑制剂环状支架,可强化螺旋结构并提升治疗效果;通过优化正电荷、两亲性、稳定二级结构及疏水性,可显著改善AMPs在高盐环境中的耐受性,例如一种新型耐盐抗菌肽RR12(其序列为RRLIRLIRLLRL)在300 mmol/L NaCl中仍能保持对革兰氏阳性菌和阴性菌的杀菌活性[7]。

1.2 计算机辅助设计

AMPs理性设计涉及序列分析、结构预测等多方面,是复杂系统工程。近年来生物信息学与计算生物学的发展推动了计算机辅助设计抗菌肽数据库(antimicrobial peptide database,APD)、抗菌肽合集数据库(collection of anti-microbial peptides,CAMP)、抗菌肽数据存储库(data repository of antimicrobial peptides,DRAMP)等权威数据库含丰富序列、结构及活性数据,可支撑构效关系分析与模板选择。表2列出了AMPs预测和分子设计的常用在线分析工具,利用在线工具以天然AMPs为模板,对衍生肽进行设计和活性预测,是开发新型AMPs的常用方法。WANG等[8]利用APD数据库实现了候选多肽抗人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)活性、抗疟疾、抗癌等的预测。APD在筛选 AspPro(DP)序列作为重组肽切割位点的研究中也发挥了关键的作用。通过以上专业数据库获取天然AMPs的序列-活性-结构多维数据,结合通用蛋白质资源库(universal protein resource,UniProt)挖掘跨种序列特征,再以CAMPR4、第三代抗菌肽预测工具(antibacterial peptide predictor 3,AntiBP3)为基础用机器学习高通量筛选多肽,并联合多肽毒性预测工具(designing and prediction of toxic peptides,ToxinPred)、溶血多肽识别器(hemolytic peptide identification server,HemoPI)评价溶血毒性,同时还可利用蛋白质理化参数分析工具(protein parameters,ProtParam)解析等电点、疏水性等关键理化参数。如图3所示,其展示了计算机辅助设计AMPs的流程。

近年来,在AMPs结构与功能上的优化研究取得了重要的进展。AlphaFold2可构建高精度3D模型以快速预测蛋白质结构,YUAN等[9]利用其预测 β-折叠构象与镍离子修饰七肽纳米酶 Ni-IH-7合理结构,重建β-螺旋纳米管的三维结构。MWANGI等[10]通过研究证实,以人工神经网络(artificial neural network,ANN)为基础框架的深度神经网络(deep neural network,DNN)模型,可显著提升AMPs结构与活性关系的预测精准度,对AMP抗菌潜力的预测精度达90%;该模型结合AMPs的理化特性与结构特征,能够协同优化AMPs的结构与活性关系,进而为高活性AMPs的定向设计提供关键的技术支撑。

AMPs的传统化学改造直接可控,通过修饰氨基酸或引入官能团,可精准调控多肽理化性能,改善其稳定性与抑菌性,但相关生物信息学分析成本高、试验周期长、设计空间小,结构改造还可能引发细胞毒性升高、选择性降低等未预期的毒副作用。计算机辅助设计能为AMPs研发提供高效筛选、多属性优化的能力,借助机器学习、基于ANN的定量构效关系模型(quantitative structure-activity relationship,QSAR)、AlphaFold2等工具,可快速筛选潜在有效序列、精准预测三维结构,减少试验次数并平衡多指标,不过其预测效果依赖训练样本、结构多样性覆盖不足、标注偏差明显等问题,限制了模型泛化能力。为缓解该瓶颈,当前研究正积极探索多种策略,在数据层面,通过系统性地整合UniProt、美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)等跨物种数据库的序列,并利用自然语言处理(natural language processing,NLP)技术挖掘文献中的非结构化数据,以扩充高质量样本库[11-12]。在算法层面,基于Transformer架构的蛋白语言模型采用‘无监督预训练+少量监督微调’的半监督范式,充分利用大规模未标注序列数据和少量结构标注,验证了生成式模型在创造具有新颖结构约束的人工序列方面的潜力[13]。通过利用AlphaFold2、基于进化尺度建模的蛋白质结构预测模型(evolutionary scale modeling fold,ESMFold)等高精度结构预测模型,提取蛋白质的3D结构特征,并与序列信息结合,构建‘序列-结构-活性’多层次预测框架,这一方法提升了在低样本或全新序列区域的活性推断能力,有效扩展了设计空间。

2 AMPs的异源表达

化学法制备AMPs起步早、技术成熟,但存在纯化与操作繁琐、消旋产物多、侧链基团易断裂、难形成复杂立体结构等问题,且成本高、对长链及翻译后修饰肽无效,制约规模化应用。相比之下,基因工程异源表达AMPs成本低、提取工艺简单、产量高,是目前最具前景的方法,其异源表达系统含原核、真核、植物系统等,图4为不同异源表达系统。以E.coli作为宿主的占80%以上,适配多数无需修饰的AMPs。酵母菌由于具有利于分子折叠、二硫键形成及翻译后修饰等优势,也成为常用宿主。表3为部分异源表达成功案例。本文后续将综述AMPs异源表达研究及系统最新进展,为相关研究应用提供理论依据。

2.1 原核系统

E.coli是重组蛋白及AMPs表达的首选原核系统,核心优势在于遗传操作简便、培养成本低、生长速度快,且具备成熟的工业化应用基础,生产效率在原核宿主中最高,在产量与成本控制方面极具规模化竞争力。但该系统表达AMPs仍面临四大关键难题:1)AMPs的抑菌特性可能对宿主产生毒性,导致宿主在表达过程中死亡,无法积累足量产物;2)肽的小尺寸和高阳离子特性使它们极易受到蛋白水解降解;3)难以实现复杂结构AMPs的正确折叠与翻译后修饰,限制了其应用范围;4)AMPs大多富含疏水残基,易形成包涵体或与细胞膜结合,导致可溶性表达困难。通过分子设计与载体优化可有效解决上述问题,REN等[29]采用抗菌肽K3K7(即LAH4的A3K/L7K双突变体)和SARS-CoV-2 Spike蛋白来源的膜融合肽(fusion peptide,FP)的N、C端分别融合硫氧还蛋白(TrxA)标签,借助空间位阻效应与酶保护作用,同步解决了AMPs的宿主毒性与短肽稳定性问题;WANG等[30]采用pMAL-c2X载体与麦芽糖结合蛋白融合表达,通过30 ℃低温诱导减少包涵体形成,并以0.4 mmol/L低浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导,避免高浓度诱导剂引发的蛋白过载与包涵体聚集;S

BØ等[31]对大肠杆菌ShoB毒素进行改造,插入赖氨酸增强水溶性、进行阳离子化修饰,同时截去N端冗余疏水区域与降解位点、替换D-氨基酸,既增强蛋白酶抗性,降低对宿主膜的非特异性作用,又维持α-螺旋构象以提升结构稳定性与抗菌活性;Origami系列菌株通过硫氧还蛋白还原酶基因和谷胱甘肽还原酶基因双突变并结合TrxA等折叠伴侣,营造胞内氧化环境,促进二硫键形成,降低蛋白折叠毒性。

基于上述研究,已形成AMPs从理性设计到工程化表达的协同解决方案。设计阶段可通过计算机辅助优化,利用ToxinPred模型筛选低毒高效变体,或通过替换疏水残基为亲水性氨基酸,改善溶解性以减少包涵体形成。化学修饰可弥补表达局限,优化脂化修饰脂肪酸链长度,平衡活性与毒性、避免疏水性过强相关问题,与N端乙酰化联用,提升酶解稳定性并降低宿主毒性。此外,可借助AlphaFold2评估二硫键形成可行性,表达时选用Origami等氧化型菌株保障正确折叠,优化可溶性表达。但E.coli系统固有的内毒素问题增加了医疗应用的合规成本,而B.subtilis凭借其非致病性、无内毒素及卓越的分泌能力,成为一种极具潜力的替代宿主。表4系统对比了2种原核宿主的关键性能指标。

B.subtilis作为革兰氏阳性模式菌株,因生物安全性高、获得美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)公认安全(Generally Recognized As Safe,GRAS)认定、遗传背景清晰、增殖迅速(代时约30 min)及强分泌能力,成为AMPs重组表达的理想宿主,其无内毒素特性显著降低了监管难度,而强大的天然分泌能力在简化下游纯化、控制生产成本方面展现出巨大潜力。其核心优势在于天然分泌途径可将目标蛋白直接释放至培养基,既避免胞内表达导致的包涵体形成与细胞壁破碎步骤,又显著简化下游纯化流程,降低污染风险。相较于E.coli,该系统无脂多糖内毒素污染风险,且分泌型表达可维持蛋白天然构象,更契合医疗级AMPs的制备需求。同时凭借无内毒素特性与天然分泌能力,B.subtilis已成功应用于淀粉酶、脂肪酶等工业酶及多种AMP的规模化生产,规避了E.coli包涵体复性及真核系统高成本发酵的问题。

工业应用中,蛋白酶缺陷型菌株,如WB800 N缺失8种胞外蛋白酶,能有效解决外源蛋白降解问题,搭配高效启动子系统可进一步提升表达效率[19,32-35],其中麦芽糖诱导型Pglv启动子兼具强驱动性、安全性与成本优势,较传统P43组成型启动子、Pgrac(IPTG诱导型)启动子更具工业化潜力。然而,该系统存在部分AMPs表达效率低于E.coli的局限,如plectasin(菌丝霉素抗菌肽)产量仅为后者的1/3,整体产量不具优势,且对复杂翻译后修饰的能力依然有限。

针对上述瓶颈,用计算机辅助设计优化AMPs在B.subtilis中的分泌时,应结合其信号肽偏好性。首先从CAMPR4等数据库筛选基础序列,再通过理性分析,以评估和确保其与宿主分泌系统的兼容性;进一步地,可借助AI模型对成熟肽N端的净电荷、疏水矩等关键理化属性进行优化设计,以克服分泌瓶颈。针对其蛋白酶缺陷型菌株特性,可减少环化修饰的依赖,重点通过机器学习优化序列的酶解抗性位点。传统化学修饰中,PEG化宜优先选用低分子质量变体,以减小空间位阻[36];脂化修饰可优先选择酰胺键连接方式,增强修饰稳定性以适配胞外分泌环境;此外,在构建融合表达载体时,可在标签与AMPs之间引入肠激酶切割位点,以便在纯化后高效释放出具有天然序列的成熟AMPs,最大程度地恢复其抗菌活性。

2.2 真核系统

在真核表达系统中,酵母表达系统是目前AMPs研究应用最广泛的系统,其宿主菌株主要为P.pastoris和S.cerevisiae。酵母具有生长迅速、易于基因工程改造的优点,且能对外源蛋白进行正确加工与翻译后期修饰,是基因工程中优良的表达宿主菌。

S.cerevisiae是酵母异源表达重组蛋白的主要宿主之一,具有无需甲醇诱导、遗传背景清晰、安全、操作简单等优势,可对异源蛋白进行必要修饰加工,维持其结构稳定与生物学活性。如XIA等[37]将AMPsCecropinXJ基因插入质粒pYES2-CT-a并导入S.cerevisiae INVSc1,诱导发酵120 h后分泌蛋白总量达1.437 g/L,纯化后的蛋白对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌均有抑菌活性;刘东亮等[38]发现S.cerevisiae在选择培养基中呈典型S型生长曲线,在诱导培养基中呈波浪式缓慢上升曲线,诱导过程中补加少量半乳糖会明显抑制酵母生长,其发酵液上清液对E.coli的最大抑菌圈直径达52 mm,对金黄色葡萄球菌抑菌活性较弱,最大抑菌圈直径20 mm;马利娟等[39]构建重组质粒pYES2-α-LfcinB并电转化入S.cerevisiae INVSc1,半乳糖诱导表达的LfcinB对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌均有显著抑制效果。然而,S.cerevisiae存在发酵产酒精可能影响表达产物、无法完整加工信号肽、产物易过度糖基化等缺陷,且作为发酵型酵母,一些碳源定向用于产生乙醇,会导致生物产量和蛋白产率低,限制了其在异源AMPs大规模发酵生产中的应用。其过度糖基化可能影响产物均一性与活性,增加了质控复杂度,尽管高安全性在监管方面具有优势,但较低的产量与生产成本效益制约了其规模化潜力。例如,抗菌肽PA-1虽在S.cerevisiae中成功表达但产量未报道,而在P.pastoris中产量达74 μg/mL;抗菌肽植物乳杆菌素423在S.cerevisiae中表达也无法定量。SADEEQ等[40]利用S.cerevisiae作为宿主表达肠菌素L50A和L50B,虽成功实现了这2种AMPs的表达,但对比P.pastoris的产物,S.cerevisiae生产的肠菌素L50A和L50B生物活性较低,分别仅为P.pastoris产物的1/6和1/60。S.cerevisiae因安全性高,早期已应用于食品领域且最早建立异源表达系统,1981年HITZEMAN等[41]首次在其体内重组表达人干扰素基因,但综合其优缺点,P.pastoris系统在AMPs大规模生产中可能更具潜力。

针对S.cerevisiae表达系统的优化策略,在计算机辅助设计阶段,应采用酵母糖基化预测工具(YeastGlyco)等专业工具精准预测N-糖基化位点,并针对其易产生高甘露糖修饰的特性,通过点突变理性敲除非人源化位点,以降低免疫原性风险。在序列设计时,应避免引入可能导致疏水聚集的复杂脂化修饰。若需体外修饰,可考虑采用短链PEG化以在增强稳定性的同时减少对活性的干扰,且需评估所有化学修饰与天然糖基化结构的空间兼容性。此外,为增强结构稳定性而引入非天然二硫键时,必须严格控制其数量与拓扑结构,以规避因内质网折叠压力过载导致的表达效率下降。

P.pastoris是高效的真核表达系统,在AMPs异源表达中优势显著,应用涵盖植物防御素、动物AMPs及人源AMPs等多种类型。已有多项研究证实其表达效果,CABRAL等[42]将豌豆防御素与酵母分泌信号肽重组,通过pPIC9质粒转化P.pastoris,优化培养后获得63 mg/L具有生物活性的重组蛋白,首次构建大量表达活性植物防御素的异源表达系统;ZHAO等[43]利用柔性连接子Gly-Ser-Gly构建编码二聚体抗菌肽LIG的DNA序列,通过 pPIC9K-6×His-3×FLAG-LIG质粒在AOX1启动子调控下,在P.pastoris GS115中获得了5.9 mg/L的纯化重组抗菌肽rLIG。DONG等[44]通过pPICZαA载体成功在P.pastoris GS115菌株中重组表达出突变型猪髓样抗菌肽37(F34-R),证实了P.pastoris系统对该AMPs的适用性。此外,P.pastoris在表达抗黄曲霉毒素B1时产量较E.coli提高1.3倍,且能成功表达原核系统难以表达的AMPs,如植物豆薯种子防御素SPE10,在E.coli AD494/pET22b中未成功表达,但在P.pastoris中则纯化出7.0 mg/L的重组肽。

相较于S.cerevisiae,P.pastoris的优势体现在多维度:1)启动子效率更高,AOX1强诱导型启动子的蛋白表达水平可达S.cerevisiae GAL1启动子的10～100倍,例如人血清白蛋白在P.pastoris中表达量达10 g/L,木葡聚糖内转糖苷酶达5 g/L [45],S.cerevisiae则难以企及;2)糖基化程度低,N-连接糖链仅含8～14 个甘露糖残基而S.cerevisiae为50～150个,且O-连接糖基化极少,这对维持AMPs的天然活性至关重要;3)遗传稳定性强,通过整合型质粒将外源基因稳定插入染色体,无需抗生素筛选即可维持表达,而S.cerevisiae依赖游离型质粒,易因复制丢失降低稳定性;4)分泌效率突出,外源蛋白占培养基总蛋白量的80%～90%,内源性分泌蛋白少,如来源于蜜蜂的Apidaecin型抗菌肽在P.pastoris中表达量高达1.76 g/L[46],显著优于S.cerevisiae;此外,P.pastoris可实现高密度发酵,细胞浓度可达100～200 g/L,培养基成本低廉,使其在产量、成本与产物质量间取得了良好平衡,规模化潜力突出。

尽管优势显著,P.pastoris仍面临甲醇诱导的安全性风险、部分AMPs表达水平有限等挑战。针对甲醇诱导的安全性问题,目前已有非甲醇依赖型表达系统的开发与应用。如WANG等[47]在P.pastoris中构建了乙醇诱导型表达系统,经信号肽等优化,在3 L发酵罐中使α-乳白蛋白的产量达到0.60 g/L。LIN等[48]在P.pastoris系统中以组成型启动子pGAP驱动异源蛋白表达,通过对转录因子的调控,使木聚糖酶表达量较对照菌株最多提升2.43倍。未来研究也需在传统遗传操作基础上,进一步融合前沿的计算机辅助理性设计,如可借助AlphaFold2预测AMPs的三维结构,为二硫键的理性设计与优化提供模型,并结合分子伴侣共表达以改善其折叠正确性,从而提高可溶性表达水平,同时,可通过密码子优化工具,如OptimumGene调整序列密码子偏好性以提升表达效率。在化学修饰方面,引入正电荷残基可有效增强其与带负电微生物膜的结合能力与穿透性[49];而纯化后的PEG化,如采用PEG5000通常是延长其体内半衰期的有效策略。此外,开发非甲醇依赖型新型启动子,如组成型GAP启动子、优化分泌途径以减少糖基化异质性也是重要的方向。作为首个获FDA批准用于生产重组蛋白药物的异源表达系统,其监管路径相对清晰,为工业化应用奠定了基础。

2.3 植物表达系统

植物系统是AMPs生产中极具潜力的平台,可有效弥补原核与真核表达系统的不足。原核系统虽产量高、培养成本低,但无法完成AMPs所需的正确翻译后修饰(posttranslational modification,PTM),如糖基化、羟基化等,导致产物稳定性差、活性低,且需借助谷胱甘肽S-转移酶、生物素羧基载体蛋白、绿色荧光蛋白、硫氧还蛋白和小泛素样修饰剂等融合伴侣防止降解,后续去除融合蛋白的步骤会增加生产复杂度与成本。酵母系统虽具备部分PTM能力,但其修饰类型与高等真核生物存在差异,仍可能影响AMPs的功能活性。

植物系统作为真核表达体系,其核心规模化优势在于能完成真核生物样式的复杂翻译后修饰,且生物安全性高。为实现这一优势,计算机辅助设计需结合植物的PTM特性,利用NetNGlyc/NetOGlyc(N-/O-糖基化位点在线预测工具)等工具预测糖基化位点,确保关键修饰可行;针对植物细胞毒性这一常见挑战,可通过ToxinPred工具进行初步筛选低毒性序列,并结合机器学习模型优化正电荷密度以降低对植物细胞膜的损伤,但需注意计算预测结果需通过植物细胞实验进一步验证。在传统化学修饰策略中,脂化修饰需选择植物细胞易于代谢的脂肪酸(如棕榈酸),避免引入植物无法代谢的官能团;环化修饰可优先采用二硫键环化,以适配植物细胞的氧化环境;同时,可借助信号肽预测(SignalP)等工具预测并筛选高效信号肽,提升分泌表达产量。例如苔藓,不仅能进行适当糖基化,还可在光生物反应器的简单无机液体介质中培养,是大规模生产异源AMPs的理想宿主。此外,植物系统在成本效益、生物安全性和规模化生产方面也颇具竞争力,可通过农杆菌或植物病毒介导的载体系统,在水稻、马铃薯、烟草等多种植物的种子、块茎、叶片及叶绿体、愈伤组织中表达;且植物并非人类或动物病原体的宿主,降低了污染风险。

植物系统的AMPs表达策略多样,核心策略包括:1)稳定组成型表达:将外源基因掺入植物细胞核或叶绿体基因组,构建稳定转基因植株。例如表达抗真菌肽、异源皮隔膜蛋白和从紫花苜蓿种子中分离的紫花苜蓿抗真菌肽的烟草植物[50],通过稳定表达可提供全株抗病性;含天蚕素B的转基因水稻结合几丁质酶信号肽对黄单胞菌抗性强,5～15 μg/mL天蚕素B可抑制丁香假单胞菌、油菜黄单胞菌和胡萝卜欧文氏菌等植物病原菌的生长。2)叶绿体表达:通过粒子枪将转基因导入叶绿体基因组,如将MSI-99基因导入烟草叶绿体,构建了高表达水平的转基因植物,叶片提取物具有抗菌性;藻类叶绿体可表达经典猪瘟病毒肽E2和口腔疾病病毒的VP1肽等,紫球藻叶绿体表达的AMPs抑菌效果堪比水产抗生素[51]。3)瞬时表达系统:该系统基于植物病毒,如烟草花叶病毒或农杆菌介导的瞬时基因表达,也称为农杆菌过滤,具有快速、廉价和更高水平的生产特点,magnICON系统在烟草中产生猪源抗菌protegrin-1,纯化后除肺炎克雷伯菌外对金黄色葡萄球菌、E.coli、牛分枝杆菌卡介苗和白色念珠菌具有抗菌活性。4)单细胞光合生物表达:人LL-37在大麦中表达,活性维持了六代。雨生红球藻是一种绿色微藻,已被用作表达重组AMP的平台,成功表达了鱼类源抗菌肽鱼皮素4[52]。5)转基因食品重组表达:可食用植物表达AMP兼具抗病与治疗潜力,转基因技术可用于粮食作物以增强抗病性或作为口服药物来源。如转基因马铃薯中斯纳金1型抗菌肽的表达具备了对胡萝卜大肠球菌细菌感染的抗性,或转基因梨和苹果中的攻击素E表达显著增加了对麻黄球大肠球菌的抗性。6)融合蛋白策略:将AMP与其他蛋白融合以提升表达稳定性和产量,如烟草中AMPs与弹性蛋白样多肽(elastin-like polypeptide,ELP)融合表达,活性较E.coli 系统高10倍,且无需切割仍能保持高活性。由水稻18 kDa油体蛋白与人工抗真菌肽PAF102构建的融合蛋白可特异性积累提高产量但不影响种子发育[26]。7)植物悬浮细胞培养表达:利用生物反应器大规模培养细胞,第一个获得FDA批准的植物生产药物他利苷酶α就是在胡萝卜悬浮细胞培养物中产生的,几乎将传统治疗戈谢病的成本降低了75%[53]。烟草亮黄2(BY-2)和烟草NT-1(Nicotiana tabacum 1)细胞系可分泌目标蛋白至培养基,200 L反应器中BY-2细胞培养系统生产人源抗体M12产量达20 mg/L[54-55],该细胞系在优化培养条件下增殖能力极强,一周内可扩增100倍,倍增时间仅需16～24 h,符合药品生产质量管理规范,医用潜力大。8)组织特异性表达与亚细胞定位策略:通过启动子和信号肽调控AMP在特定组织或细胞区域表达,可避免细胞毒性。例如,稻谷壳质酶信号肽能引导AMPs分泌到细胞间隙,既保护AMPs免受细胞质中肽酶降解,又能让转基因植物抗病能力增强;OARD等[56]将CA启动子调节的叶片特异性启动子与胞外定位结合,构建的β-嘌呤硫素转基因拟南芥,无需高层次转基因表达就具备强抗真菌及细菌能力。植物系统表达AMP的不同策略通过优化表达效率、减少细胞毒性、简化纯化流程等,实现AMP在农业抗病和生物制药中的应用。

然而,植物系统也面临一些挑战。部分AMPs对植物细胞有毒性,可通过ELP融合解决且无需额外切割步骤。另外,其规模化生产面临产量波动较大的问题,且转基因植物严苛的监管审批流程极大地增加了商业化难度、周期与成本。在中国,产业化须依《农业转基因生物安全管理条例》完成中间试验等三阶段的安全评价,全程约5～8年,并综合评估非靶标生物影响、过敏性、毒性及基因漂移等风险。在政策更为严格的欧盟,审批遵循《Regulation(EC)No 1829/2003 on genetically modified food and feed》(《转基因食品和饲料条例》)与《Directive 2001/18/EC on the deliberate release into the environment of genetically modified organisms》(《转基因生物环境释放指令》),流程严谨,由欧洲食品安全局(European Food Safety Authority,EFSA)主导进行极高要求的食用与环境安全风险评估。相比之下,美国采用相对宽松的监管体系,由FDA、美国国家环境保护局(Environmental Protection Agency,EPA)和美国农业部(United States Department of Agriculture,USDA)三方协调监管,按用途分类审批,全流程约3～6年,并对转基因食品实施强制标识。这些显著的监管差异,增加了该技术全球商业化的复杂性与不确定性。

总体而言,植物系统为高活性AMPs生产提供新途径,随着瞬时表达技术、糖工程进步及监管完善,有望成为AMPs工业化生产核心平台,在对抗耐药病原体领域前景广阔。

3 总结与展望

AMPs作为替代传统抗生素的新一代候选生物活性分子,在抗感染治疗、农业绿色防控及食品防腐领域展现出不可替代的应用潜力。本研究系统综述了AMPs设计优化策略与异源表达系统的研究进展。在分子设计层面,传统化学修饰与计算机辅助设计的结合显著提升了AMPs的稳定性与活性;在异源表达领域,原核系统的高效性、真核系统的翻译后修饰能力及植物系统的成本优势形成互补,P.pastoris与烟草悬浮细胞体系展现出工业化应用的潜力。融合标签技术与强启动子的联用也可有效的缓解宿主毒性问题,同时跨系统协同表达策略也为突破产量瓶颈提供了新的思路。尽管如此,AMPs的大规模应用仍面临宿主毒性、翻译后修饰精度不足、规模化纯化工艺不成熟,以及转基因作物表达体系所涉及的生物安全与伦理审查差异等多重挑战,增加了其商业化进程的复杂性。

面向未来,应聚焦以下关键突破方向:一方面,针对当前多组学数据分析依赖大量高质量样本的局限,未来应推动AI辅助设计与多组学数据的深度融合,通过整合基因组、转录组、蛋白质组和代谢组等构建综合训练数据集,并借助迁移学习、域适应算法,如多组学迁移学习模型等方法[57]通过知识迁移和贝叶斯框架,显著提高有限样本多组学数据的分析效果,同时利用多组学小样本生存分析元学习框架等元学习策略[58],从相关任务中获取经验,提升小样本条件下的预测精度和泛化能力;开发基于深度学习和图神经网络的多模态AI模型[59-60],结合变分自编码器、生成对抗网络等生成式架构,构建“数据增强—知识迁移—预测验证”的闭环优化,显著提高小样本条件下的预测精度和样本利用效率,在有限样本情况下展现出优异的性能表现。另一方面,糖基化工程为AMPs的精准修饰提供了重要策略。糖基化作为最普遍的后翻译修饰形式,主要包括N-糖基化、O-糖基化、S-糖基化和C-糖基化4种类型,其中N-糖基化和O-糖基化在AMPs修饰中最为常见。天然糖基化AMPs主要来源于昆虫,如蝇抗菌肽、蚁抗菌肽等,多为O-连接型,糖基化通常发生在富含脯氨酸区域。糖基化工程通过共价连接特定糖基(如N-乙酰葡糖胺、葡萄糖、甘露糖等)到AMPs特定位点,能够显著提升肽段的稳定性和抗菌活性[61]。研究表明,N-糖基化修饰的抗菌肽LL-III在保持原有抗菌机制的同时,对蛋白水解酶抗性提高2～4倍,血清稳定性显著增强[62]。糖基化工程在维持AMPs的膜结合能力和构象灵活性的同时,还能通过精确调控糖基的类型与位点,实现对功能的定向优化[63],为解决AMPs体内稳定性差和生物利用度低的问题提供了有效途径。

此外,针对当前关注不足但影响深远的关键瓶颈,应重点布局规模化纯化技术与体内给药系统的研发。在纯化方面,需发展高效层析、膜过滤与相分离的耦合工艺,并探索利用智能响应材料以实现对AMPs的高选择性、低成本分离。在体内递送与疗效方面,需采取双管齐下的策略:一方面,开发基于纳米载体、脂质体或外泌体的药物递送系统,通过靶向修饰与控释设计以增强AMPs在感染部位的富集;另一方面,结合对AMPs分子本身的环化、PEG化等化学修饰,系统提升其在复杂生理环境中的稳定性与穿透效率。随着合成生物学、人工智能与精准医疗技术的持续融合,AMPs有望为应对全球耐药性危机提供更加可持续和高效的解决方案。

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