海洋生物活性肽的制备与应用研究进展

海洋生物活性肽(marine bioactive peptides,MBPs)是天然存在或从海洋蛋白组分经酶解获得的具有特定氨基酸序列与生物功能的短肽[1-2]。海洋生物活性肽可以通过调控机体生理代谢通路,发挥抗氧化、抗高血压、免疫调节活性和抗菌作用等重要的生理功能[3],这些功能的特异性强、毒副作用小[4],这使其在食品科学、药学和保健品等领域展现出巨大的应用价值。

当前针对海洋活性肽资源的系统化发掘已取得显著进展,研究人员借助整合多组学技术的系统发掘策略,从20余种不同门类的海洋生物中鉴定出超过10 000条多肽序列,其中90%以上为首次发现,充分说明海洋生物活性肽资源的巨大储备量与挖掘潜力,并为后续的功能研究提供丰富的候选分子库[5]。然而,面对这些丰富的资源,从序列发掘到实际应用的转化仍存在瓶颈。例如传统制备方法普遍存在制备效率较低、靶向性差、难以精准构建稳定的活性结构、规模化生产难等问题;在筛选与鉴定环节,传统体外活性检测方法难以高效、准确地从海量候选多肽序列中筛选到目标肽段。如何在确保规模化生产稳定性的前提下,建立高效靶向制备与高通量精准鉴定相耦合的技术体系,系统解决传统制备方法所存在的问题,以及面对海量候选序列时筛选鉴定手段滞后、对特有修饰结构位点分析能力不足等关键瓶颈,从而突破海洋生物活性肽从实验室发掘走向产业化应用的核心技术壁垒。针对以上问题,人工智能(artificial intelligence,AI)与合成生物学技术的发展可突破这些瓶颈,其中AI技术通过深度学习算法,配合先进的生物信息学工具和分子对接手段,可实现对于目标肽段的精准筛选,为生物活性多肽的精准酶解提供指导。近年来,利用合成生物学技术构建微生物细胞工厂,也已初步实现目标肽的合成,有望破解传统制备技术所面临的难题。

本综述系统梳理近年来海洋生物活性肽的酶解制备和分离方法、功能特性与作用机制解析等研究进展,探讨生物信息学工具以及合成生物学在海洋生物活性肽开发中的创新应用,分析当前面临的挑战与未来发展方向,为海洋生物活性肽资源的深度开发与高效利用提供理论支撑与技术参考。

1 海洋生物活性肽的提取与制备技术

海洋活性肽的获取方式是制约产量与活性的一大瓶颈,不适宜的制备工艺常存在产率低、活性差、靶向性不足、产物纯度不均一等问题,而合成生物学等新技术的应用可对活性肽的合成路径进行优化,突破传统制备工艺在效率、纯度、稳定性及规模化生产方面的局限。目前常用的海洋生物活性肽制备方法主要有直接提取法、化学合成法、酶解法、发酵法等[6],各方法原理及优缺点等见表1。

1.1 直接提取法制备技术

直接提取法是指利用分离纯化技术从海洋生物组织中直接分离天然存在的活性肽,主要步骤包括组织匀浆、酸提取、离心、层析分离等。其优势在于操作难度小,设备要求较低,原料适应性广。如SEO等[7]先对美国牡蛎(Crassostrea virginica)的鳃组织进行酸化处理,再通过制备型酸性尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳和(reversed-phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)法进行直接分离纯化,得到了一种新型的美国牡蛎防御素(American oyster defensin,AOD),该肽由38个氨基酸残基组成,分子质量为4 265 Da,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均表现出显著的抗菌活性。该方法的局限性主要在于含量较低导致提取效率低、产物纯度较差,提取的活性肽完整性和功能易受环境因素的影响,且提取工艺中需要使用有机溶剂,存在环境污染和产品有机溶剂残留风险,目前常作为初步分离手段,难以实现大规模生产[10]。

1.2 化学合成法制备技术

化学合成法包括固相合成法和液相合成法,其中,固相合成法的后处理操作步骤简单,且收率和产物纯度较高,应用更加广泛。该方法依据已知的活性肽序列,将目的肽的C端氨基酸羧基连接在固相载体上,经脱保护、缩合、洗涤的等步骤的循环延长肽链,最终裂解纯化,可实现单一结构肽段的精准合成[11]。该方法无需依赖海洋生物原料,避免了资源限制以及天然提取或酶解过程中难以克服的杂质问题,可以实现结构明确、活性已知的小分子海洋活性肽的精准合成。吴小英等[12]利用固相合成法合成了芋螺毒素线性肽,经氧化折叠后通过质谱鉴定确认产物成功形成了2对特征二硫键,表明该方法可以精准构建海洋来源的芋螺毒素ImI的天然结构。SHEN等[13]利用核糖体图谱测序与深度学习模型预测出341个候选抗菌肽的氨基酸序列,对其中60个具有潜在抗菌活性的抗菌肽进行化学合成,验证后发现其中90%(54个)具有抗菌活性,对多种耐药病原菌具有较强的抑制作用。但该方法的局限性也十分显著:成本高昂,在合成较长肽段时,步骤繁琐且试剂消耗量大,难以应用于规模化生产中。因此,该方法目前的应用场景仍以实验室研究和高附加值医用肽制备为主,在食品、保健品等大规模生产领域的应用中十分有限。

1.3 酶解法制备技术

酶解制备法是利用不同蛋白酶的特异性水解作用,将海洋生物蛋白质水解成具有生物活性的小分子肽段[14],是目前应用最广泛、技术最成熟的海洋生物活性肽制备技术。该方法兼具了特异性强、无有害物质产生、产物稳定性好等优点[15]。相较于直接提取法,酶解法大大提高了制备效率以及对海洋生物原料的利用率;相较于化学合成法,酶解法的反应条件温和,无需依赖化学试剂从头合成,对环境更加友好,更适于产业化和大规模应用。在酶解制备海洋生物活性肽过程中,关键参数主要有酶的种类、酶底物比、pH值、温度和反应时间等水解过程控制,这些因素将显著影响活性肽的得率和生物活性[16]。常用的酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶等。

根据酶解步骤的差异,酶解法可以分为一步酶解和分步酶解技术。一步酶解技术是指在酶系同步反应条件下一步完成对蛋白质原料的水解。其优势在于工艺简单、操作便捷,经过前期单因素实验、响应面优化确定最佳酶解参数后,在操作过程中便无需频繁调整反应参数,适合规模化生产。FANG等[17]使用5种蛋白酶(胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和风味蛋白酶)水解从飞鱿鱼副产物中提取的鱿鱼肌肉蛋白,发现木瓜蛋白酶水解产物抗氧化活性最优,并采用响应面法对酶与底物(E/S)比、反应温度、水解时间等条件进行了优化,使抗氧化活性显著提升,DPPH自由基清除率达到74.25%。在王雪芹等[9]以鮟鱇鱼糜为原料制备活性肽的研究中,比较了胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶的水解效果,发现木瓜蛋白酶的水解产物对DPPH自由基的清除率最高,并通过响应面法确定其最佳酶解条件为:加酶量829.51 U/g、pH值7.37、酶解温度47.09 ℃、酶解时间5.86 h、液固比5.79∶1,在此条件下DPPH自由基清除率可达(80.22±0.63)%。一步酶解技术的局限在于不同蛋白酶作用位点互相影响,造成蛋白质降解效率低、活性肽种类单一,无法充分发挥原料生物活性。

为弥补一步酶解技术的不足,分步酶解技术应运而生。朱勤等[18]报道了以海洋低值小杂鱼为原料,先使用动物蛋白水解酶进行第一步酶解,再用胰蛋白酶进行第二步酶解的方法。这种分步酶解策略可将水解度提高至45%左右,且酶解产物的分子质量全部为200～800 Da,更利于机体吸收利用。LIU等[19]根据活性多肽偏好氨基酸序列分析,选择了脯氨酰内肽酶、α-糜蛋白酶、蛋白酶K等具有特定酶切位点的蛋白酶对鲍鱼粗酶解产物进行二步酶解,在水解温度37 ℃,水解时间3 h,料液比1∶30,加酶量1%(配比为1∶2∶1)的条件下,使二步酶解产物血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)抑制活性提高了2.3倍,达到72.14%。

1.4 发酵法制备技术

发酵法制备技术是指利用微生物自身蛋白酶,特异性地切割海洋生物原料中大分子蛋白质,将其降解为小分子活性肽[20]。发酵法的优势突出,相较于化学合成法,发酵法利用微生物自身的代谢活动降解蛋白质,无需额外添加化学试剂,绿色环保;相较于直接提取法,发酵法更加温和,不会破坏肽的活性基团,保持更好的生物活性;相较于酶解法,发酵法无需外源添加蛋白酶,微生物代谢产生的复合酶系可实现蛋白质的降解。HASHEM等[10]利用益生菌益生菌芽孢杆菌SNGC菌株(Bacillus sp.SNGC)发酵红腹巴鱼(Piaractus brachypomus)肉蛋白,制备出具有高抗氧化活性的肽类。吴海滨等[21]以鳕鱼皮为原料,利用米曲霉进行液态发酵,先用单因子实验确定了影响发酵的重要因素,主要包括碳氮比、底物浓度和接种量,又采用响应面法对这些因素进行优化,使发酵水解度达到36%,最终得到了功能性低分子质量多肽,其DPPH自由基清除活性的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)为1.3 mg/mL,ACE抑制的IC50值为2.53 mg/mL。发酵法虽在活性肽制备领域展现出独特优势,但其工业化应用仍存在挑战,如发酵过程中蛋白质降解过程难以精确调控,微生物发酵所产生的次级代谢产物与活性肽混合提高了分离纯化难度等。

2 海洋生物活性肽的功能特性与作用机制

海洋生物活性肽功能特性与其氨基酸组成、序列结构、分子质量以及空间构象等密切相关,深入了解这些生物活性类型及其作用机制,对于海洋生物活性肽的应用与开发具有重要意义。活性肽的功能特性与作用机制的精准解析高度依赖高效的制备技术与灵敏的筛选方法,而传统制备与筛选手段存在效率低、精准度不足、特殊结构解析能力不足等问题,制约了活性肽的高效获取、机制阐释与产业化应用。生物信息学分析、蛋白大语言模型与分子对接等策略可在预测、筛选与解析活性肽结构功能方面提升效率与准确度,突破传统筛选手段的局限。目前海洋生物活性肽的主要功能特性及应用前景见表2。

2.1 抗氧化活性

氧化应激主要与衰老、癌症、心血管疾病等多种慢性疾病密切相关[22],然而合成抗氧化剂存在着安全性等潜在问题。抗氧化活性是海洋生物活性肽最为常见的生物活性之一[23-24],且源于天然海洋生物原料的抗氧化肽具有低毒性、环境友好等优势,可为解决合成抗氧化剂的诸多弊端提供一种优质、可替代的方案。其主要是通过清除自由基、螯合金属离子以及增强体内抗氧化酶系统等多种机制发挥抗氧化作用[25]。LYU等[26]以发酵后的刺参(Stichopus japonicus)肠蛋白作为水解对象,通过液相色谱-串联质谱液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)结合虚拟分子对接筛选,最终分离鉴定出一条氨基酸序列为丙氨酸(Ala)-Ala-Ala-苯丙氨酸(Phe)-谷氨酸(Glu)-甘氨酸(Gly)-赖氨酸(Lys)-色氨酸(Trp)(AP3)的新型八肽,该多肽表现出显著的抗氧化活性,其对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基的清除能力分别为(52.99±1.05)%、(65.10±0.70)%、(54.17±0.85)%。AHN等[27]对鲑鱼副产物中的胸鳍蛋白进行水解,发现了一段具有较好的抗氧化活性的多肽,对羟基自由基诱导的DNA损伤和过氧化氢诱导的肝细胞损伤具有显著的保护作用。HASHEM等[10]的研究发现,从红腹巴鱼鱼肉蛋白水解物中分离纯化的2个肽段[组氨酸(His)-天冬酰胺(Asn)-亮氨酸(Leu)-Gly-Leu-Leu-His-Gly-天冬氨酸(Asp)-甲硫氨酸(Met)和Asp-Ala-脯氨酸(Pro)-丝氨酸(Ser)-Met-Asn-Asp]表现出显著的DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力以及铁离子还原/螯合能力。目前已鉴定出的部分海洋来源抗氧化肽如表3所示,这些抗氧化肽多为短肽,通常包括3～8个氨基酸,大多以Phe、Trp等芳香族氨基酸和His为核心活性位点,推测芳香环的共振效应可以稳定自由基[31];ZHANG等[32]对含该类标志性氨基酸的松子肽谷氨酰胺(Gln)-Trp-Phe-His经脉冲电场处理后,肽链构象展开使芳香残基Trp、Phe暴露,其活性氢与共轭结构可高效淬灭自由基,直接提升抗氧化活性。LIU等[19]研究的16种化学合成肽中,含半胱氨酸(Cys)的肽表现出良好的DPPH清除活性,含酪氨酸(Tyr)的肽表现出显著的ABTS阳离子自由基清除活性,而同时含有Cys和Tyr的肽(如鲍鱼内脏肽)具有较强的体外和细胞抗氧化作用[33]。综合来看,芳香族氨基酸(Phe、Tyr、Trp)和含硫氨基酸(Cys、Met)是决定抗氧化活性的关键氨基酸。其中,Trp和Tyr的酚羟基可直接提供氢原子清除自由基,Phe的苯环通过共振效应稳定自由基中间体,Cys所含的巯基具有强亲核性,是清除体内活性氧的重要功能基团[34]。氨基酸的序列排布也会影响多肽的活性,活性氨基酸位于肽链末端时侧链更易暴露,与疏水性氨基酸相邻时则更易穿透细胞膜,而短肽结构因无空间位阻,活性远优于易折叠包裹活性位点的长肽[35]。这些发现为深入了解活性肽的抗氧化机制以及后续制备高活性、高安全性的抗氧化肽提供了重要的理论依据。

2.2 抗高血压活性

抗高血压活性是海洋生物活性肽的另一重要功能特性[36]。ACE在肾素-血管紧张素系统中起着关键作用,它能将血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)转化为具有强烈血管收缩作用的血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)[37],同时降解具有血管舒张作用的缓激肽[38],最终导致血压升高。而与之相反,ACE2则是高效水解AngⅡ生成具有降压作用的血管紧张素1-7(Ang1-7)[39]。海洋生物活性肽可通过抑制ACE的活性来发挥降压作用,还能增强ACE2活性以促进Ang Ⅱ降解。SUO等[40]从紫贻贝(Mytilus edulis)蛋白水解物中分离得到17种ACE抑制肽,其中异亮氨酸(Ile)-Lys、Tyr-Glu-Gly-Asp-Pro、Trp-Phe和丝氨酸(Ser)-Trp-Ile-Ser-Ser表现出最强的ACE抑制活性,这些肽段主要通过氢键、静电力及疏水相互作用与ACE活性位点有效结合。李萌等[41]以鲍鱼肌肉为原料,经分离纯化、LC-MS/MS鉴定以及分子对接筛选出6条具有降压作用的核心肽段,并通过研究发现这些肽段通过调控ACE/ACE2双靶点发挥作用。其中Pro-Ile-Ile-Thr-Lys与Pro-Val-Gly-Arg对ACE表现出较强抑制活性,分别为混合性抑制和竞争性抑制,且具有高结合稳定性。SUN等[42]从菲律宾蛤仔中提取制备生物活性肽Arg-Pro-Pro,证实该肽段可显著改善原发性高血压和醋酸脱氧皮质酮(deoxycorticosterone acetate,DOCA)-盐诱导的继发性高血压,缓解高血压引起的心肾损伤,其作用机制是通过降低血清 TNF-α、IL-2、IL-6等炎性细胞因子水平来发挥抗高血压及心肾保护作用。研究人员还发现该肽段具有抗氧化活性,可以缓解氧化应激对主动脉、心脏及肾脏的损害,这类兼具ACE抑制与抗氧化作用的活性肽研究价值较高,可为多功能降压产品提供新的思路与理论依据。进一步研究发现,海洋源ACE抑制肽的活性与其氨基酸组成及序列位置呈现特定的构效关系。C端含有Lys或Tyr的肽段比含有Phe或Trp的肽段ACE抑制活性更强,且Pro和Cys可以通过正向调控肽段与ACE的结合过程,增强抑制活性[43]。在N端序列特征方面,富含疏水性氨基酸(Leu、Ile、Val)的肽段表现出更强的膜穿透能力和靶标亲和力[44],N端为Pro的肽段可通过改变ACE结合位点的取向增强抑制特异性[45]。高ACE抑制活性与丰富的疏水性氨基酸含量密切相关[46]。HU等[47]制备的Ser-Glu-Gly-Pro-Lys、Phe-Asp-Gly-Pro-Tyr和Ser-Pro-Gly-Pro-Trp具有显著的ACE抑制活性,并发现这些肽段通过氢键、疏水相互作用和静电力与ACE的活性口袋和/或活性位点相连。

2.3 免疫调节功能

海洋生物活性肽的免疫调节功能同样备受关注,已有研究证实,从章鱼、海螺和扇贝等海洋生物中分离提取的活性肽能够通过精准调节免疫细胞功能、减少促炎细胞因子产生、修复肠道屏障完整性等多种途径发挥免疫调节作用[48-49]。例如,这类多肽可以通过抑制关键炎症通路(如NF-κB和TLR-4信号通路),调节先天性和适应性免疫反应,对炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)等疾病发挥治疗作用[50]。GUO等[51]发现牡蛎肽Ops可以抑制溃疡性结肠炎小鼠的TLR-4/NF-κB通路,改善肠道微生物菌群,进而缓解葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎。在增强免疫活性方面,部分活性肽可通过适度激活NF-κB通路实现免疫调控。ZHANG等[52]使用超滤法从日本黄姑鱼蛋白水解物中纯化得到一种低分子质量肽NJP,该活性肽通过上调IKKα/β表达、促进IκBα降解,进而激活NF-κB信号通路(诱导p65活化与核转位)发挥免疫调节作用,且无明显细胞毒性。ALI等[53]研究发现从章鱼、海螺和扇贝中提取的海洋源生物肽能够提高紧密连接蛋白(如ZO-1和闭合蛋白)的表达,促进黏蛋白分泌,并利于有益菌(乳酸杆菌和毛螺菌科)的生长,以缓解肠道屏障紊乱、菌群失衡的问题。ZHAO等[54]发现,黄鳍金枪鱼碎肉来源的蛋白水解物(TPA,含有109种具有潜在抗癌和抗炎活性的肽)可协同增强5-氟尿嘧啶抗肿瘤效果,同时改善化疗引发的营养不良,保护肠黏膜、缓解肠损伤。上述研究表明,海洋生物活性肽在调节肠道免疫功能、维持肠道屏障完整性和菌群平衡方面具有重要潜力,可作为膳食补充剂或辅助疗法用于胃肠道疾病和癌症相关问题。

2.4 抗菌活性

具有抗菌活性的海洋生物活性肽大多来源于海洋生物原料的体表黏液、皮肤、鳃、血液、血清等组织[55]。抗菌肽通常具有双亲性且带正电荷,可与带负电的细胞膜结合,破坏膜完整性,导致膜内磷脂和蛋白质结构受损,发挥其杀菌效果。抗菌肽功能及稳定性与氨基酸序列紧密相关,N端区域往往富含His、Lys等亲水性氨基酸,C端区域常含有Ala、Val等非极性疏水性氨基酸[56]。ZHOU等[57]在拟穴青蟹中鉴定出Scyampcin44-63的新型抗菌肽,该肽对真菌和细菌具有广谱抗菌活性,且对哺乳动物细胞(HaCaT、RAW264.7)及小鼠红细胞无细胞毒性。进一步研究发现,该抗菌肽是通过抑制麦角固醇的生物合成、诱导细胞凋亡、干扰细胞周期和促进自噬性细胞死亡等多种机制来发挥作用的。从美国牡蛎鳃组织中分离的防御素AOD对革兰氏阳性菌(如乳酸乳球菌和金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性菌(如大肠杆菌和副溶血弧菌)均表现出显著的抗菌活性,最低有效浓度(minimum effective concentration,MEC)分别为 2.4、3.0、7.6、15.0 μg/mL[7]。在序列结构上,N端亲水阳离子区域与C端疏水区域构成的两亲性结构,是膜靶向型抗菌肽的典型特征。其中,N端第2～4位富含精氨酸(Arg)和Lys的阳离子区域,在抗菌肽与细胞膜的初期结合过程中起到重要作用[58]。在氨基酸组成方面,抗菌肽通常富含His,其抗菌活性和空间结构易受pH的影响,合理的结构柔性以及不完全的两亲性分布,更有利于提升其抗菌效果[59]。海洋生物活性肽的抗菌功能作用机制特殊,且不易诱导细菌产生耐药性,已成为新型抗生素研发的重要资源。已实现产业化的部分海洋生物活性肽见表4。

3 海洋生物活性肽标志性成分的挖掘鉴定

针对海洋生物活性肽从实验室走向产业化所面临的高效靶向制备与高通量精准鉴定的核心技术瓶颈,标志性成分的挖掘与鉴定是解决这一困境的关键。这类标志性成分并非普通肽段,而是特指在特定海洋生物中含量较高、具有特征性结构且与生物活性密切相关的肽类成分,对其展开系统研究能够阐明构效关系,为产品创新研发与质量控制提供依据。首先,分离纯化技术是富集目标肽、挖掘海洋生物活性肽标志性成分的前提,其次,生物信息学分析筛选可缩小筛选范围,初步筛选高活性肽段,以便进行结构鉴定与构效关系研究。构效关系研究可明确肽段的氨基酸序列、空间结构与生物活性的关系,为后续活性评价和成分鉴定提供理论依据。最后,通过活性评价验证候选肽段的价值,从而确定海洋生物活性肽的标志性成分。

3.1 分离纯化技术

海洋生物原料经发酵或酶解等工艺处理后,得到的活性组分中常存在分子质量分布范围广泛的肽类混合物与其他有机成分,无法直接使用,还需要经过多步分离纯化以获得纯度更高的活性肽。根据多肽的极性、分子质量大小以及电荷状况等理化性质差异,常通过膜分离法、凝胶过滤色谱(gel filtration chromatography,GFC)、离子交换色谱(ion exchange chromatography,IEC)、RP-HPLC、亲和色谱法、电泳技术等进行生物活性肽的分离与富集[68]。相关技术的原理、优缺点及应用阶段如表5所示。

在分离纯化海洋生物活性肽的实际应用中,通常采用膜分离与多种色谱技术或其他技术组合的策略,利用不同色谱技术分离机制的不同,分步剔除杂质、富集目标肽,最终实现对海洋生物活性肽高纯度分离。以红腹巴鱼鱼肉抗氧化肽的纯化为例[10],研究人员首先通过超滤(3 kDa MWCO膜)将水解物分为不同分子质量的组分,发现分子质量小于3 kDa的组分(RPMPH-IF)表现出最高的抗氧化活性,又将该组分经Sephadex G-25 GFC进一步分离,获得抗氧化活性更强的RPMPH-1亚组分,最后通过RP-HPLC进行精细分离,得到活性最高的RPH-8组分。在美国牡蛎抗菌肽美国牡蛎防御素(American oyster defensin,AOD)提取中[7],研究人员采用了制备性酸性尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳和RP-HPLC的组合纯化策略,最终获得了高纯度的抗菌肽。KIM等[70]在对膨腹海马蛋白酶解物中的多肽进行分离时,采用超滤技术分离出特定组分,进一步用Sephadex G-10 GFC进行分离,最终得到了分子质量最小、IC50值较低[(0.044±0.005)mg/mL]的ACE抑制组分。HU等[71]将GFC与RP-HPLC、液相色谱/电喷雾电离串联质谱(liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry,LC/ESI-MS/MS)联合使用,从圆鲹(Decapterus maruadsi)蛋白酶解产物中成功纯化并鉴定出序列为Lys-Gly-Phe-Arg(506 Da)的抗氧化肽。INTARASIRISAWAT等[69]通过超滤、阳离子交换柱色谱和RP-HPLC的连续纯化步骤,从鲣(Katsuwonus pelamis)鱼籽蛋白水解物中分离纯化出了2个活性组分。这些研究表明,多种分离技术的组合应用是获取高纯度海洋活性肽的有效手段。

3.2 生物信息学分析筛选

在高活性生物活性肽的挖掘后期,以传统分析手段从成千上万条肽序列中筛选出活性最高、毒副作用最小、稳定性最佳的目标肽段,会浪费大量的时间和精力,而生物信息学的持续发展与多肽数据库的日渐完善,极大推动了生物活性肽的筛选与开发进程。虚拟筛选(virtual screening,VS)是一种基于计算机辅助药物设计(computer-aided drug design,CADD)的高通量筛选技术,可运用强大的算法进行计算机模拟,从海量海洋生物候选肽库中高效率、低成本地筛选出具有潜在生物活性的肽分子[72]。虚拟筛选的主要流程包括:构建海洋生物活性肽候选库、确定筛选靶标与构建评价模型、分子对接与活性预测、体外/体内实验验证活性。常见的海洋生物活性肽虚拟筛选策略见图1。

近年来,蛋白质大语言模型(protein large language models,PLLMs)的发展为海洋生物活性肽的筛选带来了突破。如基于Transformer架构的ESM-2(Evolutionary Scale Modeling 2)模型,该模型通过掩码语言建模的方式,在海量蛋白质序列上完成预训练,不仅可以直接从氨基酸序列预测出原子级分辨率的三维结构,还能有效挖掘序列中的潜在功能信息[73]。相较于传统预测方法,蛋白质大语言模型能够识别序列中远距离氨基酸残基间的非线性作用和传统算法难以发现的隐式功能基序,为新型海洋生物活性肽的开发提供了新的研究思路。

在对筛选出的肽段进行活性预测时,常用到PeptideRanker[74]工具,该软件可对肽序列的生物活性进行评分,快速缩小候选肽库。它主要依托新型N-1神经网络,以已知活性或非活性肽的n-gram(n一般为1～3)序列特征为输入,输出0～1的活性概率得分,得分超过0.5的肽段即被认定具有生物活性,分数越接近1表示肽段具有生物活性的可能性越高。PURCELL等[75]从掌状海带蛋白水解物的3 kDa渗透物中鉴定出130条肽序列,借助PeptideRanker工具进行评分,结合Expasy、BIOPEP数据库等计算机模拟策略预测其生物活性,成功筛选并化学合成了Tyr-Ile-Gly-Asn-Asn-Pro-Ala-Lys-Gly-Gly-Leu-Phe与Ile-Gly-Asn-Asn-Pro-Ala-Lys-Gly-Gly-Leu-Phe两种具有ACE抑制活性的肽。类似的还有BIOPEP-UWM[76]、PeptideDB[77]、PepDraw[78]和ToxinPred[79]等生物信息学工具,都在虚拟筛选中发挥了重要作用。姜玉等[80]以菲律宾蛤仔原肌球蛋白为底物,利用多种筛选工具并结合分子对接技术,通过BIOPEP-UWM虚拟酶解、PeptideRanker活性评分、ToxinPred毒性过滤成功筛选出8种潜在的新型活性肽。因此,充分运用各类高效、准确的生物信息学分析工具,可以降低生物活性肽筛选分析的时间成本,提高筛选工作的效率。

3.3 结构鉴定与构效关系研究

海洋生物活性肽的结构鉴定通常借助质谱技术(如LC-MS/MS、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)、核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)等获得肽的氨基酸序列以及空间构象等信息。在构效关系研究方面,某些氨基酸残基或结构特征与特定生物活性密切相关,如含有His、Cys、Tyr等残基的肽通常具有较强的抗氧化能力,因为这些残基的侧链可以作为质子供体或金属离子螯合剂[81]。而抗菌肽中丰富的碱性氨基酸(如Lys和Arg)和疏水性氨基酸(如Phe、Leu等)[82]使其能够与带负电荷的细菌膜相互作用并破坏膜完整性。

分子对接技术的核心是借助计算机模拟,来预测不同分子间相互作用及结合方式,并预测配体(小分子)与受体(如蛋白质等大分子)的结合形态及亲和程度[83],广泛应用于药物设计、蛋白质间相互作用探究等领域。在生物信息学发展背景下,依托分子对接开展的多肽功能虚拟筛选,相较于传统筛选手段更加迅速,已成为生物活性肽构效研究领域的热点。MAO等[84]利用分子对接与BLAST技术,基于太平洋白虾的蛋白质组数据,开展黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XO)抑制肽的虚拟筛选工作,最终成功筛选出7种全新的XO抑制肽序列。在ACE抑制肽与抗氧化肽的筛选中,已有不少关于分子对接的研究报道。1994年WILLIAMS等[85]首次阐明人ACE的N/C双活性口袋关键氨基酸残基,奠定了其双活性结构基础,基于这一明确的结构特征,目前该酶常作为大分子蛋白受体用于肽类的模拟对接筛选。Keap1/Nrf2通路是细胞应对氧化应激、维持氧化还原平衡的关键信号通路,主要包含 Keap1(Kelch-like ECH-associated protein 1)和Nrf2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2)2种核心蛋白。在正常情况下,Keap1会与Nrf2相结合,推动后者泛素化并降解,使Nrf2维持在较低水平;在氧化应激状态下,Keap1的构象会发生改变,无法再促进Nrf2泛素化,导致其在细胞内积累并进入细胞核,进而诱导抗氧化基因的表达[86]。开展分子对接时,经过能量最小化处理的肽构象会作为小分子配体,与ACE或Keap1蛋白进行对接。通过计算对接结合能,同时观察对接构象中氢键形成的具体位点,就能更深入地探究ACE抑制肽、抗氧化肽等功能多肽与对应蛋白质受体之间的构效关系。

3.4 活性评价方法

经过虚拟筛选后得到的海洋生物活性肽需经过体外实验和体内实验对其活性进行评价。体外实验是在简化的生化体系中直接测定肽与靶点的相互作用,具有高效、简便、结果直观等特点,但无法反映体内真实的生理环境与复杂调控过程,因此适合对活性肽生物活性的初步评价。如抗氧化活性的评价通常采用DPPH自由基清除、ABTS阳离子自由基清除、铁离子还原能力和金属离子螯合等实验[87-88];ACE抑制活性通过体外模拟ACE反应系统进行评估;抗菌活性常通过抑菌圈法、最低抑菌浓度测定等方法评价[89]。ZHONG等[90]在刺参性腺中经分离纯化鉴定出了Glu-Ile-Tyr-Arg、Leu-Phe、Asn-Ala-Pro-His-Met-Arg三种具有ACE抑制活性的肽段,体外活性评价显示Asn-Ala-Pro-His-Met-Arg的ACE抑制活性最强,且该肽在模拟胃肠消化条件下稳定性良好,对Caco-2细胞无明显细胞毒性。值得注意的是,Caco-2细胞模型仅模拟了肠道上皮屏障,无法完全预测肽在完整机体中的生物利用度。这类体外检测手段能够快速锁定具有潜在活性的海洋生物活性肽组分,为后续深入研究提供高效的初筛依据。

与体外实验相比,体内实验则能够更全面地评估活性肽在生物体内的实际效果和安全性,能够评估活性肽的系统调控作用、组织分布特征和长期毒性,为海洋生物活性肽从基础研究走向临床应用提供可靠的科学依据。GAO等[91]发现生物合成牡蛎肽(SOPs)能够显著降低低密度脂蛋白水平及低密度脂蛋白胆固醇与高密度脂蛋白胆固醇的比值,其中的关键肽段Val-Ile-Ser-Asp-Glu-His-Gly-Ile-Asp-Pro-Thr-Lys能够激活过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)信号通路,调控脂质代谢相关基因表达从而改善肝脏脂质失调。ZHENG等[92]以斑马鱼毛细胞损伤模型开展体内实验,研究了管角螺活性肽对氨基糖苷类抗生素诱导耳毒性的保护作用。ZHOU等[57]利用小鼠外阴道念珠菌病模型,通过体内实验验证了海洋抗菌肽Scyampcin44-63的疗效与安全性,结果显示该肽在有效剂量下可显著降低真菌载量、减轻炎症反应,且无明显毒副作用,治疗效果与临床药物氟康唑相当。这些体内实验结果及其揭示的独特免疫调控机制为海洋生物活性肽的实际应用提供了重要科学依据。

4 人工智能与合成生物学在海洋活性肽开发中的创新应用

AI和合成生物学等新兴技术可为海洋生物活性肽的研究和开发带来新的方法与技术,解决传统方法面临的资源依赖性强、提取效率低、产物稳定性差等技术瓶颈,并提高其研发效率和产业化潜力。传统合成路径与AI驱动的海洋生物活性肽合成路径如图2所示。

4.1 AI在活性肽筛选与设计中的应用

传统活性肽挖掘方法存在周期长、提取率低且准确性差等问题,利用AI技术进行海洋生物活性肽的筛选、功能预测和优化设计,具有高效便捷的优势。在明确目标肽段的核心生物功能与作用靶点的基础上,构建序列数据库,利用长短期记忆网络(long short-term memory,LSTM)、Transformer等深度学习算法训练功能潜力预测模型,将该模型经过交叉验证后对数据库中的多肽进行评分,并添加分子质量、结构稳定性等约束条件,筛选出核心候选肽。对于得到的候选肽段,利用算法对收集到的海量非冗余蛋白质序列进行统计分析,提炼出自然选择偏好的氨基酸连接规律,对候选肽的多种组装模式进行稳定性评分,从而高效率、低成本地筛选出活性高、结构稳定性好的氨基酸序列。如GAO等[91]基于LSTM的机器学习模型,从160个候选天然牡蛎肽段中精准筛选出28个高抗氧化活性的肽段,并利用基于自然蛋白序列语言特性的AI组装方式,将肽段进行从头设计并组装成稳定的融合蛋白架构,最后通过计算重叠氨基酸片段在庞大天然蛋白数据库中的累积频率,高效预测并筛选出最稳定的肽段排序组合。当前,蛋白质语言模型(protein language models,PLMs)如ESM-2、ESM-3[93]取得重要突破,能够在不依赖多序列比对的情况下预测结构与功能的关联,与LSTM模型形成互补,提升预测的精确度。图神经网络(graph neural networks,GNN)通过对氨基酸残基间的非欧几里得相互作用进行建模,能够精准发现残基间的长程关联,在苦味肽、抗菌肽等活性预测中表现出了良好效果[94]。AlphaFold 3对蛋白-肽复合物的高精度结构预测为复合物结合后的稳定性评估提供了参考依据[95]。

4.2 合成生物学与微生物细胞工厂

合成生物学是对生物系统进行定向设计与改造,以创造具有特定功能的人工生物系统的科学。在利用AI技术筛选获得的活性优异、结构稳定的氨基酸序列设计融合蛋白时,通过合成生物学手段可以在序列中嵌入特异性酶切位点,保证融合蛋白在宿主内的稳定表达,同时使后续活性肽的高效释放更加便利、精准。合成生物学的发展使得在微生物细胞工厂中高效合成海洋生物活性肽成为可能。选用大肠杆菌、毕赤酵母等典型工业微生物作为微生物细胞工厂,利用合成生物学手段,对微生物底盘进行合成路线构建、代谢途径优化及基因回路组装,筛选出高表达菌株。通过连续发酵、补料分批发酵等工艺优化,结合实时监测与调控系统,精准控制发酵过程中的重要参数,实现细胞工厂持续、高效地合成目的产物。在后续的分离纯化过程中,可借助酶工程改造引入融合标签,实现融合蛋白的快速分离与精准切割,最终实现目标肽的可持续、规模化生产,摆脱对天然海洋资源的依赖。GAO等[91]成功在毕赤酵母细胞工厂中实现了牡蛎肽的高水平异源表达,产量达到34 g/kg细胞干重,并且相较于天然牡蛎肽,生物合成牡蛎肽的ABTS阳离子自由基清除率、DPPH自由基清除率分别提升了7倍与5.26倍,充分证明了合成生物学策略在海洋活性肽生产中的优越性。这种绿色生产方式减轻了对海洋资源的压力,推动海洋生物活性肽在更广泛领域的应用,同时克服了传统海洋活性肽生产易受环境变化影响的局限性,为更高价值海洋活性肽的大规模生产提供了可行方案。

5 挑战与展望

海洋生物活性肽凭借其丰富的生理功能以及广阔的应用前景,已成为海洋生物资源开发领域的研究热点。传统制备方法是海洋生物活性肽的研究基础,但资源限制性强、原料利用率低、目标肽分离纯化效率差、制备成本较高等问题严重制约了海洋生物活性肽的规模化生产与实际应用。AI、合成生物学、生物信息学等快速发展的前沿技术,为解决这些问题提供了全新思路,并指明了未来海洋生物活性肽的研究方向。

未来海洋生物活性肽的研究应进一步加强虚拟筛选、AI技术以及合成生物学在海洋生物活性肽制备中的跨学科融合应用。虚拟筛选方面,基于深度学习的高通量虚拟筛选技术将成为活性肽挖掘的重要手段,通过进一步挖掘高活性肽段的氨基酸序列组成及其结构特征,明确结构与功能之间的关系,可以构建更加精准的预测模型,提升虚拟筛选的准确性。AI技术的应用方面,智能化过程控制将逐步升级传统的海洋生物活性肽生产模式。通过对反应温度、时间、底物浓度等关键参数进行优化,建立动态预测模型与智能发酵控制系统,结合实时监测与AI算法进行动态优化,提升目标活性肽的合成效率与产率,实现工业化生产的精准调控。同时,应重点发展多组学融合技术,整合基因组、蛋白质组、代谢组等多组学数据,构建跨尺度的海洋生物活性肽知识体系,为海洋生物资源的深度挖掘和功能开发提供支撑。合成生物学与微生物细胞工厂的构建将持续推动海洋生物活性肽的绿色、高效合成,微生物底盘细胞的改造将从单一基因编辑向全基因组理性设计发展,通过基因线路工程与代谢网络重构,进一步改造微生物底盘细胞,使工程菌株具备复杂活性肽的定向合成与后修饰能力,实现目标活性肽的高效异源表达,摆脱对天然海洋生物原料的依赖,并减少制备过程中污染物排放,实现环境友好。在此基础上,分子互作机制研究将从静态结构解析转向动态功能模拟,借助分子生物学等技术深入探究活性肽与靶标分子的相互作用机制以明确其构效关系,这将为海洋生物活性肽的精准应用提供更有效的理论依据。此外,目前大多数海洋活性肽的体内作用机制和药代动力学特性尚不明确,仍需开展更多高质量临床前研究和临床试验来验证其功效并确保其安全性。

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