聚苹果酸[poly(β-L-malic acid),PMLA]又名聚羟基丁二酸酯,是一种具有良好生物相容性及生物降解性的水溶性脂肪族聚酯类化合物,具有极强的水溶性、生物相容性、可降解性、化学衍生性、无毒性、无免疫原性等生物化学性质,使得PMLA成为一种具有广泛应用前景和发展前景的新型医用高分子聚合物原料[1-3]。短梗霉菌属是一种高产PMLA的菌种,出芽短梗霉产PMLA的发酵液大部分呈黄色,少数为黑色或粉色[4]。QIAO等[5]建立了离子交换-膜分离集成工艺提取PMLA的研究,但含PMLA的树脂洗脱液仍然含有大量的色素,色素的存在影响PMLA的外观特征。目前已经报道了多种脱色方法,如H2O2氧化法、大孔树脂吸附法、活性炭吸附法等[6-7],对于PMLA的脱色方法的研究主要为H2O2氧化法,但其对PMLA有强氧化作用,不利于PMLA纯化后的应用研究[8]。

从工业角度看,除了脱色剂的种类外,热稳定性、pH稳定性、脱色效率、生产规模和成本等因素对PMLA的脱色也起着重要作用,活性炭是常用的脱色剂并且可以多次脱附再生,符合绿色工艺的要求[9-10],低成本并且有效的脱色剂需要一种高效的优化程序来实现更高的脱色率和产物保留率。在这方面用于工艺参数优化的最常用的方法是单因素试验,它逐渐优化所有输入变量。但是这种方法有局限性,它需要大量的实验,耗时,并且无法找出输入变量和输出变量之间的相互作用效应。因此,将一些计算工具与单因素试验结合可以解决这一问题[11]。人工神经网络(artificial neural network,ANN)在建立非线性方面具有优越的性能[12]。ANN被广泛应用于各个领域的响应预测[13]。其中,反向传播人工神经网络(backpropagation artificial neural network,BP-ANN)被广泛应用在发酵条件优化当中。此外,非支配排序遗传算法(non-dominant sorting genetic algorithm-Ⅱ,NSGA-Ⅱ)等多目标优化进化算法可以同时优化多个目标产物并且平衡优化目标产物之间的关系。

本文基于QIAO等[5]的研究结果,针对离子交换树脂洗脱下的PMLA解吸液进行脱色工艺优化,采用单因素试验辅助BP-ANN-NSGA-Ⅱ法优化PMLA的脱色条件,旨在进一步优化PMLA的纯化工艺,为实验室研究PMLA纯化的科研人员提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

PMLA发酵液,北洋百川生物技术有限公司提供;L-苹果酸标品,赛默飞世尔科技;BCA蛋白浓度检测试剂盒,北京兰杰柯科技有限公司;活性炭,河南中聚净化材料有限公司;型号为D301、D113、LX-T5、D4020、D392的大孔树脂,上海源叶生物科技有限公司;编号为D296的孔树脂,天津兴南允能高分子技术有限公司。其他试剂均为分析级别。

1.2 仪器与设备

Aminex HP-X87H色谱柱,伯乐生命科学研究公司;P4紫外可见分光光度计,上海美普达仪器有限公司;LC-20AT高效液相色谱分析仪,日本岛津;Bio-Tek Gen酶标仪,美国伯腾仪器有限公司;SHA-C水浴恒温振荡器,巩义市予华仪器有限责任公司;H1850R高速台式冷冻离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 PMLA脱色率的测定

引用文献法测量样品脱色前后的色素变化[8]。采用不同方法对PMLA溶液进行脱色后,取等量的PMLA溶液测定其吸光度值。使用紫外可见分光光度计在450 nm处测量溶液的吸光度。PMLA脱色率计算如公式(1)所示:

脱色率

(1)

式中:C0和C1分别为脱色前和脱色后样品溶液的吸光度。

1.3.2 PMLA保留率的测定

用高效液相色谱测量PMLA的浓度。使用87 H色谱柱,柱温40 ℃,5 mmol/L H2SO4作为流动相,流速0.6 mL/min,紫外检测器为210 nm检测出峰时间和峰面积来测定聚苹果酸的浓度。PMLA保留率计算如公式(2)所示:

保留率

(2)

式中:其中R0和R1分别为脱色前后溶液中的PMLA质量浓度,mg/mL。

1.3.3 蛋白质清除率的测定

使用BCA试剂盒测定蛋白质的吸光度,并用酶标仪在562 nm下检测脱色前后蛋白质的吸光度。蛋白质清除率计算如公式(3)所示:

蛋白质清除率

(3)

式中:P0和P1分别为脱色前后溶液中蛋白质的吸光度。

1.3.4 多糖清除率的测定

使用硫酸苯酚法测定多糖的吸光度。在1 mL PMLA稀释液中加入1 mL 50 g/L的苯酚,然后快速加入5 mL的硫酸。反应完全进行30 min。使用紫外可见分光光度计在490 nm处测量溶液的吸光度。多糖清除率计算如公式(4)所示:

多糖清除率

(4)

式中:L0和L1分别为脱色前后多糖的吸光度。

1.3.5 选择系数的测定

根据文献法,分布系数(Kd)和选择性系数(Kc)计算如公式(5)～公式(7)所示[14]:

(5)

(6)

(7)

式中:AD0和AD1分别为色素在样品溶液中脱色前和脱色后的吸光度(450 nm);AR0和AR1分别为PMLA在样品溶液中脱色前后的吸光度(210 nm);Kd1和Kd2分别为色素和PMLA在活性炭上的分布系数;Kc为活性炭的选择性系数;M,活性炭的质量。

1.3.6 吸附等温线实验

将相同浓度的PMLA上清液20 mL加入不同质量的活性炭,在50 ℃下150 r/min摇匀12 h。吸附后测定发酵液中色素的吸光度,并对其符合Langmuir方程和Freundlich方程的程度进行评价。Langmuir模型可以用公式(8)和公式(9)来描述[15]:

(8)

(9)

式中:KL,Langmuir常数;Qmax,最大吸附量;Qe,吸附平衡时的吸附容量;A0和Ae分别为溶液中色素的初始吸光度和平衡吸光度;V0,初始样品溶液的体积,mL;W,活性炭的质量,g。

Freundlich 模型可以用公式(10)表示:

(10)

式中:KF,吸附容量指标 Freundlich常数;1/n,吸附驱动力大小相关的经验常数。

1.3.7 单因素试验

引用QIAO等[5]的方法将PMLA发酵液用D296树脂进行吸附解吸附实验得到的PMLA上清液。通过比较PMLA脱色率、PMLA保留率、蛋白质清除率、多糖去除率并计算选择系数探究活性炭添加量、溶液pH、温度、时间对静态脱色的影响。

1.3.8 混合智能优化方法

本文利用Matlab平台,以高PMLA脱色率和高PMLA保留率为目标,使用混合智能优化方法,实现PMLA的部分纯化。首先,使用单因素试验构建ANN训练模本,从而评估脱色条件对PMLA脱色率和PMLA保留率的影响。随后,将这些训练样本应用于BP-ANN预测和NSGA-Ⅱ相结合的方法进行多目标优化[16-18]。

1.3.8.1 基于ANN模型的PMLA的脱色率和保留率预测

为获得人工神经网络模型,利用单因素试验对模型数据进行训练验证,并在Matlab平台上实现。采用4个输入变量(pH、温度、时间、活性炭添加量)和输出变量(PMLA脱色率和PMLA保留率)构建预测神经网络模型。使用反向传播算法训练人工神经网络并确定其拓扑结构。最后,选择相关系数(correlation coefficient,R2)最高、均方根误差(root mean square error,RMSE)最低的网络进行响应预测。

1.3.8.2 BP-ANN隐藏层数的选择

BP-ANN结构包括输入层、隐藏层和输出层,各层之间通过权重和阈值建立连接[19-20]。隐藏层中的神经元数量是一个至关重要的参数,它会显著影响模型的学习性能。当这个数字过低或过高时,都会对预测模型的准确性和泛化能力产生不利影响。因此,采用基于交叉验证法的试错法来确定BP-ANN隐藏层的最优节点数据集进行了预处理,并被划分为80%的训练集和20%的测试集。通过RMSE的大小来评估不同隐藏层数对预测精度的影响。RMSE越小,表示预测值与真实值之间的差距越小,有利于通过网络进行准确的数据预测。

1.3.8.3 基于BP-ANN-NSGA-Ⅱ的多目标优化

采用BP-ANN-NSGA-Ⅱ算法提高PMLA脱色率和PMLA保留率。其输出的pH、温度、时间、活性炭添加量的一组柏拉图最优解。使用BP-ANN-NSGA-Ⅱ算法获得柏拉图边界图的关键步骤如下:

1)生成大小为N的初始种群,然后使用非支配排序和3种机制(选择、交叉和突变)获得后代的第一个种群。

2)将后代种群与亲本种群合并,并使用非支配排序和拥挤度计算创建新种群。

3)重复步骤1(非支配排序和3种机制)和步骤2,直到后代群体达到预定义的最大遗传代数,以获得柏拉图最优解集。

1.3.8.4 评价指标

采用2种常用的误差评估指标R2和RMSE来评估BP-ANN模型的预测精度。R2表示预测值与真实值的拟合程度,而RMSE量化预测值与真实值之间的离散度,计算如公式(11)和公式(12)所示:

(11)

(12)

式中:yobs,数据集中的一个观测数据点;yperd,BP-ANN估计的对应值;n,数据点总点。

基于BP-ANN-NSGA-Ⅱ的多目标优化。

BP-ANN训练的回归预测模型作为多目标遗传算法的目标函数。这种方法能够适应复杂的非线性关系和函数表达式不是预先确定的情况。优化PMLA脱色率和PMLA保留率的目标函数分别用 f1 和 f2 表示,计算如公式(13)和公式(14)所示:

max·f1=max[ANN1(X1,…,X4)]

(13)

max·f2=max[ANN2(X1,…,X4)]

(14)

式中:X1,…,X4是用于预测BP-ANN输入变量;ANN1和ANN2分别表示PMLA脱色率和PMLA保留率的预测模型。

1.3.9 PMLA分子质量的检测

根据文献法检测PMLA的分子质量[21]。

2 结果与分析

2.1 脱色剂的选择

如图1-a所示,随着活性炭目数的增加料液中的色素、蛋白、总糖含量在减少,而PMLA保留率则随着目数的减小而降低,粒度减小到200目,200目和325目其脱色、脱蛋白、脱总糖的效果相似,并且活性炭颗粒越小其价格越贵,结合成本和PMLA保留率应选择200目的活性炭。如图1-b所示,随着200目活性炭的添加量的增加,脱色、脱蛋白、脱总糖的效果加强,但是PMLA的保留率也大幅下降,综合上述选择5.0 g/L的活性炭添加量其脱色率为72%,PMLA保留率为92%。如图1-c所示,本文采用5种大孔树脂进行筛选吸附,其脱色率的增加顺序为D311D4020>D113>LX-T5>D329。综合PMLA脱色率和PMLA保留率应选择D392大孔树脂。如图1-d所示,随着D296树脂的添加量的增加,脱色、脱蛋白、脱总糖的效果增加,PMLA的保留率下降。其中树脂添加量为100 g/L,D392脱色率为60%,PMLA保留率为84%。如表1所示,筛选出的活性炭在PMLA脱色率、PMLA保留率和成本上均优于筛选出的大孔树脂,因此200目活性炭是本研究中最佳的脱色材料。

2.2 等温线吸附

如图2-a、图2-b所示,Langmuir和Freundlich方程都很好地描述了实验平衡吸附数据,通过比较相关系数[22](Langmuir R2=0.98;Freundlich R2=0.96),Langmuir方程更符合实验数据,表明色素以单层形式吸附在活性炭表面[23]。Freundlich模型拟合结果1/n≈0.5,表明活性炭吸附为一般吸附。如图2-c、图2-d所示,透过拟合线性化的Langmuir和Freundlich模型并比较相关系数R2可知Freundlich模型拟合程度优于Langmuir模型,表明色素多层吸附在大孔树脂上。

2.3 单因素试验优化

为了进一步优化200目活性炭的静态吸附条件,考察了溶液pH、吸附时间、吸附温度对PMLA保留率、脱色率和蛋白质清除率和脱总糖率的影响,以选择性系数为基础,综合筛选了最佳脱色条件。如图3-a所示,随着溶液pH的增加,PMLA保留率升高,脱色率、脱蛋白率、脱总糖率降低。溶液pH影响羟自由基的产生,其中羟自由基的氧化电位随着pH的升高而降低,降低了脱色率。溶液pH值会影响颜料和目标产物的电离度和溶解度,从而影响其吸附。pH值为6时,选择性系数最高(图3-b);如图3-c所示,随着温度的升高,脱色率、脱蛋白率、脱多糖率升高,这种现象的发生是由于发酵液温度升高黏度下降,温度升高,里面的分子随布朗运动增强,有利于里面的色素、蛋白、总糖和活性炭微孔结构结合,温度为50 ℃,选择系数最高(图3-d)。如图3-e所示,当静态吸附时间超过100 min时,由于大孔树脂的吸附能力达到平衡状态,低聚糖保留率、脱色率和蛋白质清除率趋于平缓。选择性系数越高,选择性吸附越高。选择系数在100 min时达到最大值(图3-f);因此,静态吸附的最佳脱色时间为100 min。最佳静态吸附条件为:脱色时间为100 min,活性炭添加量为5.0 g/L,吸附温度为50 ℃,溶液pH值为6。

2.4 基于BP-ANN模型的聚苹果酸色素去除率及保留率的预测

2.4.1 BP-ANN网络结构的确定

为了研究BP-ANN神经网络隐含层的理想节点数,构建了隐含层数从1～10的一系列网络结构进行评估。如图4和图5所示,当隐含层结构都由9个节点组成时,2个BP-ANN达到了最低的RMSE。因此,选择4-9-1来预测PMLA脱色率和PMLA保留率的最适网络构型。

2.4.2 对预测结果的评价

在确定的BP-ANN网络结构的基础上,建立了PMLA脱色率和保留率的预测模型。预测结果如图6所示,它表明BP-ANN准确地预测了训练集和测试集的真值。对于预测PMLA脱色率的BP-ANN模型,训练集的真实值和预测值的RMSE和R2分别为5.803 2和0.820 6。在测试集中,这2个值分别为3.744 1和0.908 5。对于预测PMLA保留率的BP-ANN模型,训练集的真实值和预测值的RMSE和R2分别为3.910 7和0.860 3,而测试集的RMSE和R2值分别为1.740 6和0.940 8。较低的RMSE和较高的R2表明BP-ANN预测模型更加准确。

2.5 基于BP-ANN-NSGA-Ⅱ的多目标优化

2.5.1 柏拉图解集的获取

利用BP-ANN-NSGA-Ⅱ模型优化已确定的PMLA保留率和PMLA脱色率的函数,考虑每种影响因素的合理范围,NSGA-Ⅱ算法的种群规模设为100,最大迭代次数设为200,选择算子使用的为二元锦标赛选择算法。交叉和变异算子分别设置为0.8和0.2。NSGA-Ⅱ算法旨在优化PMLA保留率和PMLA脱色率,经过200次迭代得到最优的活性炭添加量、溶液温度、溶液pH和静态吸附时间。结果表明,基于NSGA-Ⅱ模型双目标优化,PMLA脱色率的预测范围为109.44%～19.48%,PMLA保留率的预测范围为98.09%～43%。如图7所示,PMLA保留率和PMLA脱色率存在着一定的对应关系,PMLA保留率和PMLA脱色率总体呈相反的趋势,随着PMLA保留率的升高,PMLA脱色率在逐渐降低。

2.5.2 柏拉图解集的获取与比较

NSGA-Ⅱ算法生成柏拉图最优解集。根据非支配排序策略,柏拉图上的每个点都是最优的。这意味着没有单一的方案可以实现最大PMLA保留率和PMLA脱色率,相应地,必须根据实际需求和应用场景来选择合适的方案。为了更好地比较柏拉图最优解,选取了3个点:A点、B点、C点,分别代表:PMLA色素去除率的最高点;PMLA保留率的最高点;PMLA 色素去除率和PMLA保留率平衡的最优点。这3个点的参数如表2所示。通过试验验证了基于BP-ANN-NSGA-Ⅱ的PMLA多目标优化模型,结果如表2所示,预测值和实验值误差很小。A点、B点和C点的相对误差范围分别为0.2%～0.6%、1.1%～2%,这证实了基于NSGA-Ⅱ的多目标优化模型的可靠性。

2.5.3 验证多目标优化的有效性

结合实际需求,取柏拉图图中PMLA脱色率和保留率同样优秀的点。如表3所示,优化后的PMLA的保留率为91.05%,显著超过样品的最低值52.86%和平均值87.3%。这比最小值提高了38.19%,比平均值提高了3.75%。优化后的PMLA的脱色率为82.27%,最小值和平均值分别为30.58%和75.28%,比最小值提高了51.69%,比平均值提高了6.99%。

2.5.4 柏拉图解集的应用

如图8所示,挑取柏拉图解集上面的PMLA保留率和PMLA脱色率表现符合实际需求的点,脱色条件为pH 8,100 min,50 ℃,当活性炭添加量为5.0～14.5 g/L,PMLA脱色率和保留率分别为73%～88%、81%～96%。由图8可知,在其他脱色条件不变的情况下,当活性炭添加量为5.0 g/L时,其脱色率为73%的脱色效果在视觉上和活性炭添加量为14.5 g/L是一样的,从节省原料结合PMLA脱色率和PMLA保留率的角度,可以选择活性炭添加量为5.0～5.3 g/L,pH 8,100 min,50 ℃,其PMLA脱色率和PMLA保留率分别为73%～77%、93%～96%。

2.6 PMLA脱色前后分子质量的表征

如表4所示,分子质量Mw分布显示,脱色前后PMLA的分子质量没有明显差异,说明PMLA的分子质量在脱色过程中没有明显变化。SHAO等[7]研究发现活性炭脱色过程较温和,可较好地保留多糖的大分子结构。因此,活性炭是PMLA脱色和保留的良好选择。

3 结论与讨论

本文研究了脱色材料对PMLA脱色率、PMLA保留率、蛋白质清除率和多糖清除率的影响。通过等温线吸附模型,发现PMLA中的色素单层吸附在活性炭的表面,多层吸附在大孔树脂上。引用了一种基于单因素试验-BP-ANN-NSGA-Ⅱ的混合智能优化方法,该方法在多目标优化方面具有优越的预测性能并且利用柏拉图解集确定了符合本实验需求的吸附最佳条件。本研究为PMLA的纯化提供了一种新的方法。

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Decolorization process of poly(β-L-malic acid)using one-factor-at-a-time experiments integrated with artificial neural network and genetic algorithm

YANG Shuyu,LIU Xiaoqian,CAO Weifeng*,QIAO Changsheng*

(College of Bioengineering,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

ABSTRACT Poly(β-L-malic acid)(PMLA)is a biopolymer with promising applications in the food and medical fields.However,its industrial development has been constrained by the lack of mature downstream separation and purification techniques.In this study,the one-factor-at-a-time(OFAT)method was employed to optimize the decolorization of PMLA following resin-based desorption.The experimental results revealed a significant trade-off relationship between the decolorization rate and the retention rate of PMLA,highlighting the necessity for dual-objective optimization.To address this,a backpropagation artificial neural network(BP-ANN)combined with the non-dominant sorting genetic algorithm-Ⅱ(NSGA-Ⅱ)was introduced to systematically explore the multi-objective optimization solution set for the activated carbon decolorization of PMLA.The optimal process conditions were determined as follows,activated carbon dosage of 5.0-5.3 g/L,pH 8,processing time of 100 min,and temperature of 50 ℃.Under these optimized conditions,the decolorization rate of PMLA was 73%-77%(with color comparable to that of deionized water),while the retention rate remained at 93%-96%.This study not only extends the application of BP-ANN and NSGA-Ⅱ in the purification of PMLA but also provides a valuable reference for the further development of interpretable machine learning and intelligent optimization algorithms in the field of natural product extraction.

Key words poly(β-L-malic acid); decolorization; activated carbon; artificial neural network; genetic algorithm; model

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044893

引用格式：杨树宇,刘晓倩,曹伟锋,等.基于单因素试验结合神经网络和遗传算法的聚苹果酸脱色工艺研究[J].食品与发酵工业,2026,52(16):51-59.YANG Shuyu,LIU Xiaoqian,CAO Weifeng,et al.Decolorization process of poly(β-L-malic acid)using one-factor-at-a-time experiments integrated with artificial neural network and genetic algorithm[J].Food and Fermentation Industries,2026,52(16):51-59.

第一作者：硕士研究生(曹伟锋教授和乔长晟教授为共同通信作者,E-mail:weifcao@126.com;qiaochangsheng@163.com)

基金项目：国家自然科学基金项目(22278412)

收稿日期：2025-10-21,改回日期：2025-12-17