合生元对盐酸洛哌丁胺诱导便秘小鼠肠道菌群和短链脂肪酸的影响

便秘是一种全球高发的功能性胃肠病,流行病学调查显示其全球成人患病率约为14%[1],其临床危害不仅有腹胀、腹痛等躯体不适,还易引发结直肠疾病及焦虑、抑郁等心理障碍,显著降低患者生活质量[2]。近年来研究证实,肠道菌群失调是便秘发生的关键环节,患者常表现为微生物多样性改变、产短链脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)的有益菌丰度下降,而条件致病菌增殖,导致SCFAs水平降低,进而通过“菌群-肠-脑轴”影响肠道运动、分泌与屏障功能,形成恶性循环[3-4]。

基于肠道微生态的干预策略为缓解便秘提供了新思路。合生元是一种由益生菌以及可促进益生菌生长的活性物质共同构成的混合物,并且两者之间具有互补或者协同作用[5]。植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)益生菌通过调节免疫反应、改善肠黏膜屏障、促进肠道蠕动及改变肠道菌群等多种机制改善肠道功能[6-8]。益生元如低聚木糖(xylooligosaccharide,XOS)能选择性促进宿主有益菌(尤其是双歧杆菌)的增殖,通过改善菌群组成间接发挥通便效应[9]。

本研究团队前期研究发现,由L.plantarum CCFM8661、动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacteriumanimalis subsp.lactis)XLTG11与XOS组成的合生元能显著缩短盐酸洛哌丁胺诱导的便秘小鼠首次排黑便时间并提高肠道推进率,预示其良好的通便潜力[9]。然而,该合生元对便秘状态下肠道菌群结构重构及SCFAs代谢谱的影响仍有待深入揭示。

因此,为系统阐明该合生元的干预机制,本研究利用宏基因组测序技术与超高效液相色谱-电喷雾电离-串联质谱技术,旨在探究该合生元对便秘小鼠肠道菌群组成、结构及SCFAs产生的影响,以期为合生元临床应用提供坚实的理论依据与实验支撑。

1 材料与方法

1.1 复合菌及药物

L.plantarum CCFM8661,河北一然生物科技股份有限公司,活菌数为 8×1011 CFU/g;B.animalis subsp.lactis XLTG11,浙江金华银河生物科技有限公司,活菌数为 1×1011 CFU/g;XOS,山东龙力生物科技股份有限公司;盐酸洛哌丁胺,美国MedChemExpress公司。

1.2 仪器与设备

FA2104B电子天平,上海越平科学仪器有限公司;Wonbio-E全自动样品快速研磨仪,上海万柏生物科技有限公司;F-060SD超声波清洗机,深圳福洋科技集团有限公司;HMTD203水浴锅,上海科析仪器厂;TYXH-I漩涡振荡器,上海汗诺仪器有限公司;TGL-16MS台式高速冷冻离心机,上海卢湘仪离心机仪器有限公司;AB Sciex Qtrap 5500/Nexera UHPLC LC-30A超高效液相色谱-质谱仪,AB Sciex/日本岛津。

1.3 实验动物

30只2～3周龄(20±2.0)g SPF级健康雄性ICR小鼠,饲养温度(22±2)℃,12 h明暗交替,自由饮水、进食。本研究所有动物实验程序经黑龙江中医药大学动物伦理委员会批准(批准号:2024032915)。

1.4 实验方法

1.4.1 药液的配制

1.4.1.1 盐酸洛哌丁胺溶液的配制

精密称取20 mg盐酸洛哌丁胺,用蒸馏水定容到100 mL,配成质量浓度为0.2 mg/mL的盐酸洛哌丁胺溶液。

1.4.1.2 合生元的配制

根据本实验室前期研究确定的剂量[9],按4∶1的比例将CCFM8661和XLTG11混合,各剂量组均添加2 mg XOS,使用蒸馏水将合生元配制为目标浓度:低剂量组(3×105 CFU复合菌剂+2 mg XOS)、中剂量组(3×106 CFU复合菌剂+2 mg XOS)、高剂量组(3×107 CFU复合菌剂+2 mg XOS)。

1.4.2 分组、给药及造模

ICR小鼠随机分为空白组(C组)、模型组(M组)、低剂量组(LG组)、中剂量组(MG组)、高剂量组(HG组),每组6只。每天上午8点灌胃给药,给药组小鼠连续14 d按照0.2 mL/10 g相应剂量灌服受试样品,C组和M组灌服等体积的蒸馏水。第14天灌胃结束后,对小鼠进行16 h禁食,期间允许自由饮水,除C组外,其他各组小鼠灌服盐酸洛哌丁胺溶液(4 mg/kg),C组灌服等体积的蒸馏水。灌服盐酸洛哌丁胺溶液0.5 h后,收集5 h内各组小鼠的粪便,进行宏基因组测序肠道菌群和SCFAs分析。

1.4.3 宏基因组测序及分析

宏基因测序委托上海欧易生物医学科技有限公司完成。首先使用MagPure Soil DNA LQ Kit试剂盒提取样本总DNA,并通过琼脂糖凝胶电泳和分光光度计对DNA的完整性和浓度进行严格质控。随后采用酶解法对DNA进行片段化处理(37 ℃ 10～12 min)和末端修复(65 ℃ 30 min),反应体系包含Neutralization Buffer和FEA Enzyme Mix等关键组分。文库构建阶段,使用Vazyme公司的Universal PLUS DNA Library Prep Kit进行接头连接,根据初始DNA投入量(30～500 ng)优化Adapter使用浓度(摩尔比20∶1～200∶1)以确保连接效率。通过双轮磁珠分选[室温结合5 min,80%(体积分数)乙醇洗涤]纯化连接产物后,采用高保真酶进行指数扩增(5～9个循环),最后通过Qubit 3.0荧光定量和Agilent 2100 Bioanalyzer对文库进行双重质控,确保文库浓度>10 nmol/L且片段分布符合测序要求(主峰300～500 bp)。通过物种观测数、Chao1 指数、ACE指数和Shannon指数来评估肠道菌群α多样性。通过主坐标分析(principal co ordinates analysis,PCoA)进行β多样性分析,随后进行线性判别分析(linear discriminant analysis effect size,LEfSe),以确定不同组间中有显著差异的肠道菌群。

1.4.4 SCFAs的测定

1.4.4.1 样品的前处理和衍生化

取适量样本,加入300 μL乙腈溶液(含内标[2H9]-戊酸,[2H11]-乙酸)(4 ℃预冷);样本研磨3 min(样品盘-20 ℃预冷),冰水浴中超声提取10 min;离心10 min(4 ℃,12 000 r/min),取上清液用乙腈(含内标[2H9]-戊酸,[2H11]-乙酸)稀释5倍;样品衍生化:向装有提取液的进样玻璃瓶中加入40 μL 200 mmol/L 3-硝基苯肼(50%乙腈水溶液配制,体积分数)和40 μL 120 mmol/L 1-乙基(3二甲基氨基丙基)碳二亚胺-6%(体积分数)吡啶(50%乙腈水溶液配制,体积分数),40 ℃下反应30 min;冰上冷却1 min,用注射器吸取160 μL的上清液,使用0.22 μm的有机相针孔过滤器过滤后,转移到透明进样瓶,-80 ℃ 下保存,直到上机分析,标准品与样品操作方法一样。

1.4.4.2 色谱和质谱条件

本实验采用超高效液相色谱-电喷雾电离-串联质谱分析方法,对目标代谢物进行定性定量检测,具体分析条件和分析方法如下:

色谱方法:进样量:1 μL;流速:0.4 mL/min;流动相:A[0.1%(体积分数)甲酸-水溶液],B[V(乙腈)∶V(甲醇)=2∶1];梯度洗脱方法:0 min V(A)∶V(B)=75∶25,2 min V(A)∶V(B)=75∶25,11 min V(A)∶V(B)=45∶55,12 min V(A)∶V(B)=25∶75,13 min V(A)∶V(B)=25∶75。

质谱方法:气帘气:35 psi;碰撞诱导电离参数:medium;负离子喷雾电压:-4 500 V;离子源温度:450 ℃;柱温:40 ℃;喷雾气:50 psi;辅助加热气:50 psi。

1.5 统计学方法

采用SPSS 26.0软件和Graphpad Prism9.5对数据进行处理分析和绘制图表。使用Shapiro-Wilk检验数据是否服从正态分布,Levene检验方差齐性,数据符合正态分布且方差齐性时,用单因素方差分析,并采用Tukey法进行多重比较。不符合正态分布或者方差不齐时,使用非参数检验,多组间采用Kruskal-Wallis检验。P<0.05表明差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 合生元对便秘小鼠肠道菌群α多样性的影响

通过ACE、Chao1、Simpson及Obs指数评估各组小鼠肠道菌群的α多样性(图1)。结果显示,与C组相比,M组的ACE指数、Chao1指数、Shannon指数、Obs指数虽无显著差异(P>0.05),但各指数均有明显上升,说明M组改变了肠道菌群的多样性。合生元干预后,肠道菌群α多样性呈现剂量依赖性变化。与M组相比,LG组和MG组的Obs、Shannon和Simpson指数均无显著差异(P>0.05),但HG组的ACE指数与Obs指数具有显著差异性(P<0.05)。LG组和MG组随着剂量的上升,各指数水平均与空白组相接近,而HG组各指数水平均有下降。

2.2 合生元对小鼠肠道菌群β多样性的影响

通过PcoA图分析可见合生元对小鼠肠道菌群β多样性的影响(图2),第1主成分(PC1)的贡献率为27.2%,第2主成分(PC2)的贡献率为15.2%。从分组水平看,C组和M组明显分开,说明小鼠肠道菌群发生了明显改变,LG、MG、HG组有大部分重合,说明其物种群落更为接近,而HG组更明显分开,说明其组间物种群落分布差异更大。

2.3 合生元对小鼠肠道菌群组成的影响

2.3.1 合生元对小鼠肠道菌群群落组成的影响

各组小鼠肠道菌群门、纲、科、属水平下top 15相对丰度组成见图3。

在门水平上(图3-A),与C组相比,M组中拟杆菌门(Bacteroidota)、厚壁菌门(Bacillota)和放线菌门(Actinomycetota)的相对丰度降低,而弯曲菌门(Campylobacterota)、脱硫杆菌门(Thermodesulfobacteriota)、支原体门(Mycoplasmatota)和假单胞菌门(Pseudomonadota)的丰度升高。在纲水平上(图3-B),各组以拟杆菌纲(Bacteroidia)、梭菌纲(Clostridia)和芽孢杆菌纲(Bacilli)为主。与C组相比,M组中Bacteroidia、Clostridia和放线菌纲(Actinomycetes)丰度降低,而ε-变形菌纲(Epsilonproteobacteria)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)和柔膜菌纲(Mollicutes)丰度升高。

在科水平上(图3-C),优势菌科包括鼠杆菌科(Muribaculaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)和普雷沃菌科(Prevotellaceae)。M组中Lachnospiraceae、Prevotellaceae和理研菌科(Rikenellaceae)丰度降低,而螺杆菌科(Helicobacteraceae)和α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)丰度升高。在属水平上(图3-D),主要优势菌属包括鼠杆菌属(Muribaculum)、拟杆菌属(Bacteroides)、邓肯氏菌属(Duncaniella)和普雷沃氏菌属(Prevotella)。M组中Bacteroides、副拟杆菌属(Parabacteroides)和Prevotella丰度降低,而螺杆菌属(Helicobacter)、Muribaculum和副萨特氏菌属(Parasutterella)丰度升高。在种水平上(图3-E),优势菌种包括鼠杆菌科细菌(Muribaculaceae_bacterium)、产酸拟杆菌(Bacteroides_acidifaciens)、Muribaculum_sp.和鼠邓肯氏菌(Duncaniella_muris)。M组中Bacteroides_acidifaciens、Duncaniella_muris和肠副鼠杆菌(Paramuribaculum_intestinale)丰度降低,而Helicobacter_sp.和Muribaculum_sp.丰度升高。

2.3.2 合生元对小鼠肠道菌群差异物种的影响

各组小鼠的肠道菌群属水平和种水平top 30差异物种见图4。

与C组相比,M组的粪杆菌属(Faecalibaculum)的丰度显著降低(P<0.05),双歧杆菌属(Bifidobacterium)丰度降低,但无显著性差异(P>0.05);M组的Palleniella丰度显著升高(P<0.01),醋酸菌属(Acetobacter)和丁酸单胞菌属(Butyricimonas)、乳杆菌属(Lactobacillus)丰度升高,但无显著性差异(P>0.05)。与M组相比,LG组的Bifidobacterium和Faecalibaculum(P<0.05)丰度水平上升,Butyricimonas、Acetobacter和Palleniella、Lactobacillus的丰度水平下降;MG组Bifidobacterium与Faecalibaculum(P<0.05)丰度水平进一步升高,Lactobacillus(P<0.05)与Butyricimonas 丰度水平(P<0.001)降低;HG组则进一步升高了Bifidobacterium、Lactobacillus的丰度水平,降低了Acetobacter(P<0.01)和Palleniella(P<0.001)的丰度。

与C组相比,M组的Bacteroides_sp.丰度显著降低(P<0.05),Faecalibaculum_rodentium丰度显著降低(P<0.01),Bacteroides_acidifaciens、Bacteroides_caecimuris、Duncaniella_muricolitica丰度均降低,但无显著性差异(P>0.05),Xylanibacter_rodentium的丰度显著升高(P<0.05)。与M组相比,LG组显著提升了Faecalibaculum_rodentium(P<0.05)的丰度水平,Bacteroides_sp.、Bacteroides_acidifaciens、Bacteroides_caecimuris及Duncaniella_muricolitica丰度均有所升高,但无显著性差异(P>0.05),同时显著降低了Xylanibacter_rodentium的丰度(P<0.01);MG组进一步显著提高了Faecalibaculum_rodentium(P<0.05)及Bacteroides_acidifaciens的丰度;HG组则使Bacteroides_acidifacien与Faecalibaculum_rodentium(P<0.05)、Duncaniella_muricolitica(P<0.01)丰度显著升高,Bacteroides_sp.、Bacteroides_caecimuris丰度均升高,但无显著性差异(P>0.05),Xylanibacter_rodentium的丰度显著降低(P<0.05),发生了更具有显著性的变化。

2.3.3 合生元对小鼠肠道菌群组成的影响

通过LEfSe和线性判别分析(linear discriminant analysis,LDA),本研究在6个分类水平上共识别出58个具有组间显著差异的鉴别特征(LDA分数>3,P<0.05)。如图5所示,M组中富集的标志性生物主要来自Bacteroidota和Bacillota,包括Prevotellaceae、Prevotella、Muribaculaceae和肠副鼠杆菌属(Paramuribaculum),这些菌群通常与膳食纤维降解和SCFAs产生相关。

M组中富集的标志物包括Bacteroidaceae、Bacteroides、另枝菌属(Alistipes)、巴恩斯氏菌属(Barnesiella)和Alphaproteobacteria,这些菌群的变化往往与肠道炎症状态和功能紊乱有关。

在合生元干预组中,不同剂量组呈现出不同的微生物标志特征。LG组中富集的标志物主要来自脱铁杆菌门(Deferribacterota)和候选梅拉菌门(Candidatus_Melainabacteria)。MG组则富集了Muribaculaceae、Muribaculum和Duncaniella等与碳水化合物代谢和肠道健康相关的菌群。HG组中富集的标志物主要来自Campylobacterota和变形菌门(Proteobacteria),包括Helicobacteraceae和Parasutterella,这提示高剂量干预可能促进了一些潜在致病菌的增殖。

2.4 合生元对肠道SCFAs含量的影响

合生元对肠道SCFAs含量的结果见图6。结果显示,与C组相比,M组中乙酸、丁酸、丙酸、乳酸含量水平均上升,但均无显著性,丙二酸含量水平显著上升(P<0.05),戊酸含量无明显变化。在合生元干预后相较于M组,LG组中乙酸、丁酸、丙二酸、乳酸含量水平均下降,但均无显著性,丙酸、戊酸含量水平均上升。MG组的趋势变化与LG组相同。HG组中,乙酸、丁酸、丙酸、丙二酸、戊酸含量水平均下降,乳酸含量水平上升。

3 结论与讨论

研究结果表明,合生元的干预能够改变便秘小鼠的肠道菌群的α多样性和β多样性,肠道菌群的组成及SCFAs的含量,从而缓解便秘的症状,具有润肠通便的效果。

在α多样性方面,与C组相比,M组各项指数升高,与王佳丽等[10]报道一致,但与其他研究[11-13]存在差异,可能与动物品系(本实验使用ICR小鼠)、洛哌丁胺剂量及造模时长有关。合生元中、低剂量干预可使α多样性恢复至接近C组水平,提示其在适当剂量下能恢复肠道菌群多样性,而高剂量则可能引起菌群结构失衡。

β多样性的结果显示,小鼠肠道菌群的β多样性发生了显著变化,C组和M组发生了明显区分,不同的是合生元干预各剂量组中LG组、MG组更接近于C组,可能是合生元组HG组对于肠道菌群的影响更大。

宏基因组测序结果显示门水平下便秘M组小鼠的Actinomycetota丰度均有下降,Proteobacteria丰度上升,而单艺等[14]的研究结果也与此相似。Bacteroidota、Bacillota的丰度下降,在益生菌干预组中都有不同程度的变化,Bacillota/Bacteroidota值发生了变化,在便秘患者中Bacillota/Bacteroidota值往往也发生了变化,通常可能与代谢紊乱及肠道蠕动减弱相关[15-18]。

在临床研究中便秘患者肠道菌群变化与本研究M组中观测到的结果相似[19]。合生元干预后,乳酸杆菌和Bifidobacterium的丰度显著回升,Bacteroides等也发生了变化。张晨玥等[20]单用L. plantarum CCFM 8661对于洛哌丁胺诱导的便秘小鼠给药后Bifidobacterium和Bacteroides等也发生了相似的变化,且XOS作为益生元也可以通过促进Bifidobacterium产生。普拉梭菌在M组显著降低,合生元给药后显著回升,而普拉梭菌被证实了与肠道健康有着密切的关系,具有抗炎的作用[21]。Prevotella和Helicobacter丰度显著升高,Prevotella已被发现具有促炎和影响肠道健康[22],Helicobacter作为致病菌可以引起结肠炎等各种肠道疾病[23],而合生元能够显著抑制其过度生长,表明益生菌可能在调节菌群稳态的同时,减少潜在致病菌的影响,从而改善便秘状态。

HG组在部分有益菌丰度恢复方面亦有一定效果,但同时也观察到诸如Campylobacterales、Helicobacteraceae等条件致病菌属的异常富集。该结果与LEfSe中高LDA值的“非典型”菌种一致,提示高剂量益生菌干预可能引发菌群结构的另一种失衡。

SCFAs作为肠道微生物发酵膳食纤维的主要代谢产物,在维持肠道健康方面发挥着重要作用[24]。在肠道中丁酸、丙酸、乙酸占SCFAs含量的90%,而其中丁酸与乙酸与肠道菌群密切相关,合生元干预后丙酸与丁酸等SCFAs水平都与趋向于C组。由此推测,合生元可能通过重塑肠道微生态,改变SCFAs产生菌的增殖,进而改变代谢产物水平。丁酸作为结肠上皮细胞的主要能量来源,有助于维持肠道屏障正常生理功能[25],乙酸在肠道pH值调节中占主导作用,能够抑制条件致病菌的增殖[26]。M组中丁酸梭菌属和Acetobacter显著升高,且丁酸、乙酸含量水平降低,推测二者之间有某种密切关联。且HG组的SCFAs含量发生了与MG、LG组明显的变化,LEfSe分析显示HG组中Campylobacterota和Proteobacteria等条件致病菌异常富集,而ACE指数和Obs指数的显著降低(P<0.05)表明菌群多样性下降,这种微生态失调可能通过代谢竞争抑制了SCFAs产生菌的活性,尤其影响了丁酸盐合成途径,导致丁酸等关键代谢物生成受阻。这种变化具有重要生物学意义——虽然高剂量干预提升了部分有益菌丰度,但SCFAs整体谱系紊乱与潜在致病菌增殖共存,揭示出“更多益生菌未必更好”的微生态调节规律。

本研究推测,合生元缓解便秘的机制可能存在如下因果链条:首先通过益生元成分选择性促进L.plantarum CCFM8661、B.animalis subsp.lactis XLTG11等有益菌增殖,进而重塑肠道菌群结构;这一生态重塑直接促进SCFAs生成,其中丁酸可作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂,通过表观遗传调控增强肠道紧密连接蛋白表达,进而巩固肠道屏障功能。同时,SCFAs作为G蛋白偶联受体的天然配体,可通过激活该通路刺激胃肠激素分泌,从而调节肠道运动功能。且前期研究实验[9]已证实,合生元干预可上调SCF/C-Kit信号通路,提高C-Kit mRNA表达水平,提示其可能通过调控卡哈尔间质细胞功能,直接改善肠道蠕动节律。与此同时,胃肠调节肽水平呈现规律性改变:胃动素、胃泌素、P物质等兴奋性胃肠肽显著升高,血管活性肽、生长抑素等抑制性因子明显降低,从神经内分泌层面协同推动肠道运动功能恢复。值得关注的是,MG组在恢复菌群多样性、提升SCFAs水平及优化胃肠调节肽谱方面均表现最优,且肠道推进率显著改善、结肠组织病理损伤明显修复,提示合生元可能通过“菌群-代谢-宿主”轴发挥整体性调节作用。

当前的研究存在一些局限性。首先,本研究采用盐酸洛哌丁胺诱导的急性便秘小鼠模型,一方面难以完全模拟人类慢性功能性便秘的饮食、神经内分泌及长期微生态失衡等复杂特征,另一方面未能有充足的给药时间,观察药物的治疗作用,仅观察了药物的预防作用。其次,本研究虽然发现合生元对肠道菌群具有调节作用,但未进行验证。未来研究可采用与人类更为相似的便秘模型,并进行无菌动物模型及粪菌移植实验,以进一步验证合生元通过菌群调节便秘的作用机制。

综上所述,本研究证实,由L.plantarum CCFM8661、B.animalis subsp.lactis XLTG11与XOS组成的合生元,可通过调控菌群结构,促进SCFAs代谢以改善肠道功能,进而缓解便秘。综合菌群结构稳态与代谢功能指标,中剂量合生元干预组(3×106 CFU+2 mg XOS)在恢复菌群多样性、调节代谢产物及规避菌群失衡方面表现最优。

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