魏斯氏菌(Weissella spp.)隶属于乳杆菌科,是一类兼性异型发酵的革兰氏阳性乳酸菌,广泛存在于传统发酵食品及自然生态环境中。近年来,随着功能性益生菌的研究不断深入,魏斯氏菌因其在多糖合成、代谢产物生成及潜在健康效应方面的独特优势而逐渐受到关注[1]。已有研究表明,部分魏斯氏菌能够产生具有免疫调节、抗氧化和抗炎活性的胞外多糖与次级代谢产物,并在改善肠道菌群稳态方面展现出潜力[2]。
在魏斯氏菌属中,Weissella bombi是近年来新报道的一种物种,最初分离自昆虫与发酵食品[3]。虽然对于其生态学特征已有一定认识,但其代谢活性物质谱及对肠道微生物群落的潜在调控作用仍缺乏系统研究。由于益生菌的健康效应往往依赖其代谢产物及与宿主肠道菌群的互作机制,因此解析W.bombi的代谢特征及其对肠道生态的影响,对评估其益生潜力及拓展其应用价值具有重要意义。代谢组学作为揭示微生物代谢网络及生物功能的重要工具,能够对菌株在特定环境下的代谢产物进行系统性分析,已被广泛应用于乳酸菌功能探索。同时,体外模拟发酵体系为研究益生菌与人类肠道菌群的互作提供了可控平台,有助于揭示益生菌干预对群落结构和功能的短期影响。
基于此,本研究以传统发酵鱼酱酸中分离的W.bombi Y133为研究对象,结合非靶向代谢组学与体外模拟发酵实验,系统分析其代谢物特征及对肠道菌群的调控作用。通过LC-MS检测和多组学数据解析,本研究旨在:a)揭示W.bombi Y133在培养条件下的代谢产物谱;b)评估其对体外人类肠道菌群结构及多样性的影响;c)探讨其潜在益生机制与应用价值[4-5]。研究结果为W.bombi的功能开发及其在食品和健康领域的应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
W.bombi Y133菌株(登录号:NR-136437.1)来源于传统发酵鱼酱酸[6],由本实验室分离鉴定,并于-80 ℃条件下保存。MRS培养基,上海博微生物科技有限公司。
代谢组学分析相关试剂:甲醇、乙腈、异丙醇、甲酸、L-2-氯苯丙氨酸(内标)、复溶液[V(乙腈)∶V(水)=1∶1],国药集团化学试剂有限公司。
体外发酵培养基成分:KCl、NaHCO3、KH2PO4、NaCl、胆盐、MgSO4·H2O、CaCl2、K2HPO4、FeSO4·7H2O、L-半胱氨酸、维生素K1、吐温-80、血红素、刃天青溶液,国药集团化学试剂有限公司。
DNA提取与测序相关试剂:粪便基因组DNA提取试剂盒(Omega Bio-tek)、PCR扩增引物338F和806R、NEXTFLEX快速DNA建库试剂盒。
鱼酱酸发酵原料:新鲜辣椒、泥鳅、生姜、食盐、白酒,购于贵阳市花溪区农贸市场。
1.2 仪器与设备
SPX生化恒温培养箱,上海科恒实业发展有限公司;H1-16KR高速冷冻离心机,可成科技股份有限公司;PHS-3E pH 计,上海仪电分析仪器有限公司;超高效液相色谱仪(ultra-high performance liquid chromatography,UHPLC),美国赛默飞公司;TripleTOF 5600+三重四极杆飞行时间质谱仪,美国艾克斯公司;NanoDrop 2000微量分光光度计,美国赛默飞公司;MiSeq测序平台,美国因美纳公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌株活化与鉴定
在实验开始前,为进一步确认该菌株种属的准确性,对该菌株进行了16S rRNA基因序列分析。按照PENINGTON等[7]的方法对菌株进行活化,将保存于-80 ℃超低温冰箱中的W.bombi Y133甘油菌种进行梯度复苏,首先以100 μL 1.0×107 CFU/mL接种量转移至含10 mL灭菌MRS液体培养基的厌氧管中,随后置于37 ℃恒温培养箱中进行静置培养24 h完成活化。随后,采用平板划线法将活化菌液连续传代培养3代,即在MRS固体琼脂平板上进行3次连续划线分离,以获得形态均一的单一菌落。挑取单个典型菌落,提取其基因组DNA,并扩增16S rRNA基因序列。将该菌株标记为Y133,测序结果与NCBI数据库中的序列进行比对,进一步确认该菌株的种属信息,以确保实验所用菌株的准确性和可靠性。
1.3.2 代谢组学样品制备与检测
实验组(Wb_Y133_MRS)为接种W.bombi Y133的MRS肉汤培养基,对照组(MRS_Control)为未接种的空白培养基,2组均于37 ℃培养24 h。培养结束后,取5 mL菌液于4 ℃条件下以32 000×g高速离心5 min,弃菌体后收集离心上清液。上清液经0.22 μm滤膜过滤,取100 μL滤液与预冷V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1混合液(含0.02 mg/mL L-2-氯苯丙氨酸内标)充分涡旋混匀,5 ℃低温超声处理30 min(40 kHz)。混合液于-20 ℃静置30 min沉淀杂质,4 ℃下13 000×g离心15 min后取上清液氮吹浓缩,残留物以复溶液[V(乙腈)∶V(水)=1∶1]溶解,经5 ℃ 二次超声萃取(40 kHz,5 min)及离心(13 000×g,10 min),最终上清液转移至进样瓶并于-80 ℃冻存。利用UHPLC,ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm,粒径为1.8 μm)完成代谢组分分离分析。柱温控制在40 ℃,每次进样量设为1 μL。所使用的流动相A为含V(1 g/L甲酸的水溶液)∶V(乙腈)=95∶5混合液;流动相B为由乙腈、异丙醇和水按47.5∶47.5∶5的体积比组成并加入1 g/L甲酸的混合溶剂。洗脱程序如下:0～2 min用2% B起始,2～15 min内逐步递升至98% B,15～17 min维持该浓度,17.1～20 min恢复至2% B,流速设置为0.40 mL/min。质谱分析采用SCIEX出品的TripleTOF 5600+平台,数据同时采集于正负电离状态。正离子模式参数设定如下:喷雾电压5 000 V,去簇电压80 V,气帘气为30 psi,喷雾与辅助气体各50 psi,源温为550 ℃,碰撞能在20～60 eV间自动切换。负模式中,喷雾电压设为-4 000 V,其他设定与正离子方式保持一致。
1.3.3 体外发酵实验
称取5.0 g KCl、1.5 g NaHCO3、0.5 g KH2PO4、5.0 g NaCl、0.4 g胆盐、0.7 g MgSO4·H2O、0.08 g CaCl2、0.5 g K2HPO4、0.005 g FeSO4·7H2O、0.5 g L-半胱氨酸、0.01 g维生素K1、1 mL吐温-80、0.05 mg血红素和刃天青溶液(4 mL,0.25 g/L),用蒸馏水配制成1 L的肠道微生物培养基(g/L),用HCl(1 mol/L)调节培养基pH值在6.8左右。使用前将培养基在121 ℃高压灭菌20 min,并在厌氧条件下保持至少2 h。
体外发酵实验已经得到贵州大学人体医学实验伦理审查委员会的同意(项目编号:HMEE-GZU-2024-T041)。本实验的人类粪便材料采集于无胃肠道疾病、采样前72 h内禁酒禁辛辣、近3个月未使用抗生素的6名健康志愿者(3男3女,年龄22～26岁),将采集到的新鲜粪便进行混样处理,然后均匀分为3份,采用方差分析(analysis of variance,ANOVA)分析组间差异。将每份新鲜粪便与无菌PBS(0.01 mol/L,pH=7)以等重混合,搅拌均匀后用无菌纱布进行过滤,得到粪便悬浮液(100 g/L)[8]。在50 mL培养基中加入1 mL 1.0×105菌液样品和5 mL粪便悬浮液,混合均匀。空白对照(control,Con)无需添加菌液。为了确保厌氧环境,所有操作均在厌氧手套箱中完成。在厌氧条件下,37 ℃下孵育48 h。发酵过程中,在0、12、24 h时取适量的发酵液在无菌EP管中备用,并立即在-80 ℃下保存以供进一步分析。一旦厌氧手套箱被打开采集样品,需要更换新的厌氧气体,以确保厌氧环境。
1.3.4 DNA提取与16S rRNA分析
将发酵48 h后的培养沉淀物(离心10 min,12 000 r/min)用于16S rRNA测序。使用粪便基因组DNA提取试剂盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)提取粪便中的总DNA。测序前采用NanoDrop 2000 10 g/L琼脂糖凝胶电泳分别检测DNA浓度及完整性。采用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对细菌16S rRNA基因V3～V4区进行PCR扩增。纯化产物经NEXTFLEX快速DNA建库试剂盒制备后,通过Illumina MiSeq平台完成文库定量与混合测序。原始双端序列经样本拆分后,依次执行以下分析:①基于质量评估值进行Reads过滤;②通过双端序列重叠区拼接获得优化序列;③应用DADA2/Deblur等降噪算法处理[9],最终获取ASV特征序列及其丰度矩阵。
1.3.5 鱼酱酸发酵及评价
新鲜辣椒清洗干净切碎,泥鳅切成小块。然后,将10%(质量分数)泥鳅和4%(质量分数)生姜加入切碎的辣椒中,搅拌均匀并称重。随后,将7%(质量分数)的盐和3%(质量分数)的白酒放入并混合,然后将10 μL/g的107CFU/mL W.bombi Y133菌液加入,放入罐中,并在25 ℃下发酵。没有添加W.bombi Y133的自然发酵鱼酱酸是对照组。发酵16 d后收集样品进行分析。
pH值通过pH计进行测量。总挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)的测定采用Conway微扩散法。将复合指示剂(0.5 mL,1 g/L甲基红溶液+1 g/L溴甲酚绿溶液,体积比1∶5)与1 mL 20 g/L硼酸溶液置于Conway的内室中。体积为1 mL的饱和K2CO3溶液和1 mL样品滤液加入Conway的外室中。密封后将Conway在37 ℃下贮存120 min。之后,向内室中加入0.01 mol/L HCl溶液,以诱导其变为淡粉红色。TVB-N含量计算如公式(1)所示:
TVB-N含量
(1)
式中:V1,用于样品的0.01 mol/L盐酸溶液的消耗量,mL;V2,用于空白对照的0.01 mol/L盐酸溶液的消耗量,mL;V0,样品的体积,mL;c,盐酸溶液的浓度,mol/L。
1.4 数据处理
所有实验均以3次独立重复进行,采用Excel软件计算各组数据的平均值及标准差,并以“平均值±标准差”形式进行表达。显著性差异分析通过IBM SPSS Statistics 26软件完成,P<0.05时视为差异具有统计学意义。图表制作采用Origin 2022软件完成。
2 结果与分析
2.1 W.bombi Y133的生长特性
为研究W.bombi Y133的生长特性,在37 ℃下连续监测其48 h的OD600值动态变化(图1-a)。结果显示,该菌株的生长曲线呈典型的四阶段特征:0～12 h为延滞期(平均OD600值=0.12±0.02),表明菌体处于代谢活化与适应阶段;14～22 h进入对数生长期,OD600值由0.38±0.01迅速升至1.05±0.02,计算得比生长速率为0.127 h-1,对应倍增时间约5.46 h。此阶段细胞代谢活跃,碳源利用效率高。22～30 h达到稳定期(峰值OD600值=1.23±0.02),30 h后出现轻微衰亡趋势(OD600值下降至1.21±0.03),可能与营养物质耗尽或代谢产物积累相关。整体来看,W.bombi Y133的生长规律与典型乳酸菌相似,显示出良好的发酵适应性和生理稳定性。
a-37 ℃下生长曲线;b-不同初始pH值下48 h生长状态
图1 W.bombi Y133的生长特性
Fig.1 The growth characteristics of W.bombi Y13
初始pH值对菌株生长的影响如图1-b所示。在pH值4.0条件下菌体生长受到显著抑制(OD600值=0.176±0.00),说明强酸环境对其代谢活性有明显抑制作用。当pH值升至5.5时,生物量较pH值4.0提升约5倍(OD600值=0.88±0.03),表明菌体可在弱酸条件下恢复正常增殖。pH 6.0时生物量进一步上升至1.16±0.01,为最适生长区间之一。当pH值升至7.0时,OD600值仍保持在较高水平(1.24±0.01),说明W.bombi Y133对中性环境具有较强适应性。综合分析,该菌株在pH值6.0～7.0范围内生长最为旺盛,表明其具备较好的耐酸与酸碱调节能力。该特性对于其在酸性或中性发酵体系(如鱼酱酸、乳酸发酵食品)中的应用具有潜在优势。
2.2 W.bombi Y133代谢组分析
基于非靶向代谢组学对W.bombi Y133的代谢特征进行解析,以37 ℃放置24 h的空白MRS肉汤培养基作为对照组(MRS_Control),并以接种W.bombi Y133后培养24 h的发酵液作为实验组(Wb_Y133_MRS),利用LC-MS对2组样品进行全面代谢物检测与分析。主成分分析(principal component analysis,PCA)结果(图2-a)显示,2组样品在PC1方向呈显著分离且各自组内聚集,表明组间代谢差异显著且重复性良好;PC2方向上实验组的离散度略大,可能源于不同平行培养体系中菌体生长速率及代谢活性存在自然波动。整体分布模式清晰反映W.bombi Y133生长前后代谢产物组成差异巨大,提示其在生长过程中发生了显著的物质利用、转化与新陈代谢活动。通过UPLC-MS/MS共检出2 163种代谢物,采用P<0.05且|log2(Fold Change)|>1的标准筛选显著差异代谢物,最终获得145种显著上调物质与375种显著下调物质(图2-b),表明该菌株在MRS基质中具有强烈的代谢改造能力。对显著上调代谢物进行化学分类后发现,organic acids and derivatives(有机酸及衍生物)为丰度最高的类别(共36种),其中amino acids and peptides(氨基酸及肽)占据主体(27种),说明氨基酸代谢是W.bombi Y133代谢活动的核心路径之一;lipids and lipid-like molecules(脂质及类脂分子)亦占较大比例(27种),其中fatty acids(脂肪酸)有18种(图2-c),提示脂质分解与脂肪酸生成在其能量供给与细胞结构合成中具有重要地位。结合这些代谢模式可推断,W.bombi Y133在发酵过程中主要依赖氨基酸与脂肪酸类物质的生物合成与积累,从而塑造其特定的代谢指纹图谱。已有研究报道同属魏斯氏菌的融合魏斯氏菌(Weissella confusa)在灰腐乳发酵中能显著促进氨基酸生成[10],与本研究结果相一致,进一步印证魏斯氏菌属普遍具有旺盛的蛋白水解及氨基酸代谢潜力。
a-代谢物主成分分析图;b-差异代谢物火山图;c-差异代谢物分类;d-主要上调差异代谢物;e-代谢富集通路
图2 W.bombi Y133的代谢组学分析
Fig.2 The metabolomics analysis of W.bombi Y133
在具体的代谢物变化中,上调代谢物中差异倍数最大的物质包括UDP-glucose、UDP-galactose、osthenol、1-hydroxy-2-naphthoic acid和ibotenic acid等。这些物质可能参与了糖代谢、信号传导或次级代谢产物的合成过程。而在下调代谢物中,差异倍数最大的物质包括myricatomentoside I、Thr-Phe、desmethyldoxepin、L-valyl-L-phenylalanine。这些代谢物的减少可能反映了W.bombi Y133在特定生长条件下某些代谢途径的抑制或转变。这些下调代谢物的减少可能反映了W.bombi Y133在特定生长条件下某些代谢途径的抑制或转变。
在代谢组数据分析中,显著上调的代谢产物可以被视为W.bombi Y133在特定生长条件下的主要代谢产物。如图2-d所示,多种具有重要生物学功能的物质被发现显著上调,这些物质可能与其生理功能或环境适应性密切相关。deferasirox是一种已知的铁螯合剂,能够通过特异性螯合Fe2+来降低体内铁的含量,从而减少细胞铁死亡的发生。这一机制使其在减少炎症反应方面具有潜在的应用价值[11]。euparin作为一种苯并呋喃的单体化合物,因其能够抑制由不良应激引起的活性氧生成而受到广泛关注。另一种显著上调的代谢物是psoralen,这是一种香豆素类化合物。研究表明,psoralen能够通过抑制神经炎症反应发挥保护作用,这使其在神经退行性疾病的研究中具有重要意义。此外,psoralen也被发现具有显著的抗炎能力,其机制可能与抑制体内脂肪沉积有关。这些代谢物的上调不仅反映了W.bombi Y133在特定环境下的代谢特征,也为其潜在的抗炎活性提供了新的研究依据。
通过对代谢组数据的通路富集分析,共富集了35种显著富集的代谢通路(图2-e)。这些通路涵盖了多种关键的代谢过程,反映了W.bombi Y133在特定生长条件下的代谢特征。其中,有7种代谢通路的富集显著性达到了P<0.05的水平,包括amino sugar and nucleotide sugar metabolism(氨基糖和核苷酸糖代谢)、pyrimidine metabolism(嘧啶代谢)、fructose and mannose metabolism(果糖和甘露糖代谢)、valine,leucine and isoleucine biosynthesis(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成)、O-antigen nucleotide sugar biosynthesis(O-抗原核苷酸糖生物合成)以及TCA cycle(三羧酸循环)[12-13]。这些显著富集的通路在菌株的代谢活动中扮演了重要角色。氨基糖和核苷酸糖代谢涉及氨基糖和核苷酸糖的合成与分解,可能与细胞壁合成和能量代谢密切相关;果糖和甘露糖代谢及半乳糖代谢则参与单糖的代谢过程,为细胞提供能量和碳骨架。嘧啶代谢作为核酸合成的重要组成部分,直接影响细胞的生长和繁殖;而缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成在蛋白质合成和能量代谢中具有关键作用。值得注意的是,这些显著富集的代谢通路中,多数与氨基酸代谢相关。这一发现与之前的全基因组分析结果高度吻合,进一步支持了氨基酸代谢在W.bombi Y133生理功能中的核心地位。此外,糖类代谢通路(如果糖、甘露糖和半乳糖代谢)的富集也表明,糖类物质可能是W.bombi Y133生长和代谢的重要能量来源。
氨基糖和核苷酸糖代谢涉及氨基糖和核苷酸糖的合成与分解,可能与细胞壁合成和能量代谢密切相关;果糖和甘露糖代谢及半乳糖代谢则参与单糖的代谢过程,为细胞提供能量和碳骨架。嘧啶代谢作为核酸合成的重要组成部分,直接影响细胞的生长和繁殖;而缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成在蛋白质合成和能量代谢中具有关键作用。值得注意的是,这些显著富集的代谢通路中,多数与氨基酸代谢相关。这一发现与之前的全基因组分析结果高度吻合,进一步支持了氨基酸代谢在W.bombi Y133生理功能中的核心地位。此外,糖类代谢通路(如果糖、甘露糖和半乳糖代谢)的富集也表明,糖类物质可能是W.bombi Y133生长和代谢的重要能量来源。这表明糖类为菌株提供主要能量来源,同时氨基酸代谢在细胞生长、蛋白质合成及代谢产物生成中发挥核心作用,为其在发酵体系中的功能特性和风味贡献提供了基础。
2.3 W.bombi Y133体外发酵
肠道菌群与宿主健康的互作机制是当前营养学和微生物学研究的核心议题之一,而益生菌在调节肠道稳态、抗氧化防御及代谢调控中展现出巨大潜力。发酵过程中的α多样性结果如图3-a所示。在第12、24 h,2组样品中的Chao1指数与Shannon指数无显著差异。加入W.bombi Y133并不会影响菌群结构。
a-α多样性指数;b-属水平上的物种组成
图3 W.bombi Y133体外发酵微生物群落
Fig.3 The microbial community in in vitro fermentation of W.bombi Y133
注:N.S.表示P>0.05。
为了评价微生物群落结构的变化,本研究分析了发酵过程中单个微生物物种属的丰富度。在属水平上,共检测到22种丰度大于1%的细菌(图3-b),其中,志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)、拟杆菌属(Bacteroides)、梭菌属(Fusobacterium)、巨单胞菌属(Megamonas)等是确定的主要属。0 h,微生物群落最丰富的细菌属是Bacteroides、Megamonas、Escherichia-Shigella。12 h,丰度最高的细菌属依旧是是Escherichia-Shigella、Fusobacterium、Bacteroides与Megamonas,但组间已经存在属水平上的显著差异,其中,毛螺旋菌属(Lachnospiraceae)、Fusobacterium在实验组显著高于空白组,Escherichia-Shigella、Bacteroides在实验组显著低于空白组。24 h,丰度最高的微生物属依然是Escherichia-Shigella、Fusobacterium、Bacteroides与Megamonas。Fusobacterium、嗜胆菌属(Bilophila)在实验组显著高于空白组,Lachnoclostridium、Escherichia-Shigella、艰难梭菌属(Clostridioides)、Bacteroides在实验组显著低于空白组。
毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)是人类肠道常见的共生菌群,以分解膳食纤维并产生短链脂肪酸,尤其是丁酸而著称[14-15];丁酸不仅是结肠上皮细胞的重要能量来源,还能强化肠道屏障功能,促进调节性T细胞分化,维持免疫稳态,并通过调节胆汁酸代谢和能量平衡参与宿主代谢健康,从而在预防炎症性疾病、代谢综合征及结直肠癌等方面发挥积极作用,因此被普遍认为是一类对机体健康极为重要的有益菌群。Bilophila属为革兰氏阴性专性厌氧菌,以沃氏嗜胆菌(Bilophila wadsworthia)为代表,常定植于人类肠道,其特征在于能够利用牛磺酸结合型胆汁酸进行代谢并产生硫化氢,从而参与胆汁酸转化与硫循环[16-17];同时,Bilophila的丰度受膳食结构显著影响,在高脂饮食或富含乳制品的条件下常呈增加趋势,因而被视为连接饮食模式与肠道微生态变化的重要指示菌[18],在维持肠道代谢平衡及反映宿主营养状态方面具有独特的生态学意义。Lachnoclostridium属在部分研究中被发现能够产生潜在致癌代谢物(如次级胆汁酸和多胺类化合物),其过度增殖常与结直肠癌和代谢紊乱风险增加相关[19]。Escherichia-Shigella群中包含多种致病性大肠杆菌及志贺菌,能够分泌毒素或侵袭肠上皮细胞,引发腹泻、肠炎乃至全身感染,是肠道炎症和菌群失衡的重要指示菌[20]。Clostridioides属以困难艰难梭菌(Clostridioides difficile)最为典型,可在抗生素使用或菌群紊乱时迅速繁殖并释放毒素,导致艰难梭菌感染、伪膜性肠炎及严重的结肠损伤[21]。Bacteroides属虽然是肠道优势菌群,但在免疫力下降或肠道屏障功能受损时,部分成员可转变为条件致病菌,引起腹腔脓肿、菌血症等感染,其代谢产物亦可能促进炎症反应[22]。
图4展示各个细菌属的组间差异。Lachnospira的波动提示短链脂肪酸代谢与黏膜屏障状态的潜在差异[23];Bilophila的响应表明胆汁酸组成及脂质代谢压力的变化[24];而Lachnoclostridium、Escherichia-Shigella与Clostridioides的升高则多与炎症负荷、宿主屏障脆弱性及微生态稳定性下降相关。同时,Bacteroides虽为优势类群,其丰度偏移仍可能暗示代谢结构与炎症信号的改变[25]。总体而言,这些菌群在代谢调控、炎症放大及生态稳态维持中扮演互有协同与制衡的角色,以上结果表明肠道微生物对外界干预具有快速响应能力,不同菌属在群落中的增减可能反映其对营养、代谢环境及竞争压力的适应性反应。同时,这种短期内的菌群重塑可能影响代谢产物的生成和宿主健康状态,提示W.bombi Y133处理对肠道微生态功能具有潜在调控作用。综合来看,本研究揭示了W.bombi Y133的加入下肠道菌群的动态演替规律及其潜在生态意义,为后续探索其菌群功能及干预策略提供了理论依据。
a-Bacteroides;b-Bilophila;c-Clostridioides;d-Escherichia-Shigella;e-Fusobacterium;f-Lachnoclostridium;g-Lachnospiraceae
图4 显著差异的细菌属
Fig.4 Significantly different bacterial genera in each group
注:N.S.表示P>0.05,*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。
2.4 W.bombi Y133参与发酵鱼酱酸
pH值是影响发酵食品风味形成与微生物代谢活性的关键理化指标。本研究结果(图5-a)显示,未添加W.bombi Y133的鱼酱酸pH值为5.52±0.14,而添加菌株后样品的pH值显著降低至4.77±0.09(P<0.05),表明 W.bombi Y133具有较强的产酸能力并可在发酵早期迅速改变体系酸碱环境。该菌株在代谢过程中可能通过糖类发酵途径生成乳酸、乙酸等有机酸,从而抑制假单胞菌等腐败微生物的生长,维持发酵体系的微生态稳定性,并降低蛋白水解相关酶的非特异性活性,为后续风味物质的形成创造更可控的生化环境。淡水鱼原料因内源酶活性强和蛋白质含量高,易发生蛋白分解和腐败,而TVB-N含量常被用于评价水产制品的新鲜度与降解程度(图5-b)。本研究中,添加W.bombi Y133的样品 TVB-N值由(0.93±0.05)mg/100 g显著下降至(0.73±0.02)mg/100 g(P<0.05),说明该菌株可能通过与腐败菌竞争底物、产酸降低体系pH值或产生具有抑菌活性的代谢物,抑制蛋白质的过度分解及胺类物质的积累,从而有效减缓腐败过程并提升鱼酱酸的贮藏稳定性与整体品质。
a-pH;b-TVB-N;c-感官
图5 W.bombi Y133参与发酵的鱼酱酸理化与感官性质
Fig.5 The physicochemical and sensory properties of the Yu Jiangsuan fermented with W.bombi Y133
注:*表示P<0.05。
在感官评价方面(图5-c),受试者对2组样品的总体接受度无显著差异(P>0.05),表明W.bombi Y133的添加不会改变产品整体风味属性。然而,实验组呈现更突出的酸味与鲜味,而对照组的咸味更为明显(P<0.05)。这种差异可能与菌株产酸作用引起的味觉互作效应有关:酸度的提升能够增强产品的清爽感并突出鲜味,同时使咸味感知相对下降[26]。此外,腐败菌受到抑制后,三甲胺及硫醇类异味物的生成减少,使实验组香气更为干净,即便该差异未在统计学上显著体现(P>0.05)[27]。整体来看,W.bombi Y133在不影响消费者接受度的前提下,促进了氨基酸、短肽等鲜味物质的生成,提高了风味平衡度,并优化了口感表现。W.bombi Y133 在鱼酱酸发酵中展现出多维度的功能特性,其作用不仅体现在调节酸度、抑制腐败和改善风味,还通过加速优势菌群建立与优化蛋白降解路径提升产品安全性与质量稳定性。
3 结论与讨论
本研究利用非靶向代谢组学分析了W.bombi Y133的代谢特征及其对肠道微生物群落的影响。LC-MS检出2 163种代谢物,其中145种显著上调,主要为氨基酸、脂肪酸及有机酸,反映了菌株在能量代谢、细胞合成及信号传导方面的活跃性,同时包括潜在抗炎和抗氧化化合物(如deferasirox、euparin、psoralen)。代谢通路富集显示,氨基糖和核苷酸糖代谢、嘧啶代谢、果糖及甘露糖代谢和支链氨基酸生物合成等通路活跃,进一步确认氨基酸与糖类代谢在其生理功能中的核心地位。肠道菌群分析显示,Lachnospiraceae、Fusobacterium和Bilophila丰度升高,而Lachnoclostridium、Escherichia-Shigella、Clostridioides和Bacteroides丰度下降,提示W.bombi Y133能短期重塑肠道微生态,可能影响代谢产物生成及宿主健康。在鱼酱酸发酵中,该菌株显著降低pH值和TVB-N值,同时不影响感官接受度,提高了产品安全性。综合来看,本研究揭示了W.bombi Y133在代谢产物生成及肠道菌群调控中的双重作用,展示了其潜在的生态功能及健康相关价值,为未来益生菌应用、肠道微生态干预策略及代谢机制研究提供了理论依据。
[1] TEIXEIRA C G,FUSIEGER A,MILI
O G L,et al.Weissella:An emerging bacterium with promising health benefits[J].Probiotics and Antimicrobial Proteins,2021,13(4):915-925.
[2] LAKRA A K,DOMDI L,HANJON G,et al.Some probiotic potential of Weissella confusa MD1 and Weissella cibaria MD2 isolated from fermented batter[J].LWT,2020,125:109261.
[3] HAMMER T J,LE E,MARTIN A N,et al.The gut microbiota of bumblebees[J].Insectes Sociaux,2021,68(4):287-301.
[4] GALANIS A,PAPADIMITRIOU K,MOLONEY G M.Editorial:Omics technologies and bioinformatic tools in probiotic research[J].Frontiers in Microbiology,2025,16:1577852.
[5] ZHENG J S,WITTOUCK S,SALVETTI E,et al.A taxonomic note on the genus Lactobacillus:Description of 23 novel Genera,emended description of the genus Lactobacillus Beijerinck 1901,and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2020,70(4):2782-2858.
[6] PANTHEE S,PAUDEL A,BLOM J,et al.Complete genome sequence of Weissella hellenica 0916-4-2 and its comparative genomic analysis[J].Frontiers in Microbiology,2019,10:1619.
[7] PENINGTON J S,PENNO M A S,NGUI K M,et al.Influence of fecal collection conditions and 16S rRNA gene sequencing at two centers on human gut microbiota analysis[J].Scientific Reports,2018,8:4386.
[8] CALLAHAN B J,GRINEVICH D,THAKUR S,et al.Ultra-accurate microbial amplicon sequencing with synthetic long reads[J].Microbiome,2021,9(1):130.
[9] WANG A L,DU Q Q,LI X M,et al.Intracellular and extracellular metabolic response of the lactic acid bacterium Weissella confusa under salt stress[J].Metabolites,2024,14(12):695.
[10] LI S T,YANG J F.Pathogenesis of Alzheimer’s disease and therapeutic strategies involving traditional Chinese medicine[J].RSC Medicinal Chemistry,2024,15(12):3950-3969.
[11] WU Y,RAN L,YANG Y,et al.Deferasirox alleviates DSS-induced ulcerative colitis in mice by inhibiting ferroptosis and improving intestinal microbiota[J].Life Sciences,2023,314:121312.
[12] LEE Y,HYUN C G.Anti-inflammatory effects of psoralen derivatives on RAW264.7 cells via regulation of the NF-κB and MAPK signaling pathways[J].International Journal of Molecular Sciences,2022,23(10):5813.
[13] RINNINELLA E,RAOUL P,CINTONI M,et al.What is the healthy gut microbiota composition? A changing ecosystem across age,environment,diet,and diseases[J].Microorganisms,2019,7(1):14.
[14] HUANG S B,CHEN J Z,CUI Z J,et al.Lachnospiraceae-derived butyrate mediates protection of high fermentable fiber against placental inflammation in gestational diabetes mellitus[J].Science Advances,2023,9(44):eadi7337.
[15] ABDUGHENI R,WANG W Z,WANG Y J,et al.Metabolite profiling of human-originated Lachnospiraceae at the strain level[J].iMeta,2022,1(4):e58.
[16] NATIVIDAD J M,LAMAS B,PHAM H P,et al.Bilophila wadsworthia aggravates high fat diet induced metabolic dysfunctions in mice[J].Nature Communications,2018,9:2802.
[17] DEVKOTA S,WANG Y W,MUSCH M W,et al.Dietary-fat-induced taurocholic acid promotes pathobiont expansion and colitis in Il10-/- mice[J].Nature,2012,487(7405):104-108.
[18] DAVID L A,MAURICE C F,CARMODY R N,et al.Diet rapidly and reproducibly alters the human gut microbiome[J].Nature,2014,505(7484):559-563.
[19] SMITS W K,GAREY K W,RILEY T V,et al.Clostridioides difficile should be considered a bacterial priority pathogen[J].The Lancet Microbe,2025,6(11):101184.
[20] CROXEN M A,LAW R J,SCHOLZ R,et al.Recent advances in understanding enteric pathogenic Escherichia coli[J].Clinical Microbiology Reviews,2013,26(4):822-880.
[21] TIAN S C,KIM M S,ZHAO J C,et al.A designed synthetic microbiota provides insight to community function in Clostridioides difficile resistance[J].Cell Host &Microbe,2025,33(3):373-387.e9.
[22] WEXLER H M.Bacteroides:The good,the bad,and the nitty-gritty[J].Clinical Microbiology Reviews,2007,20(4):593-621.
[23] VACCA M,CELANO G,CALABRESE F M,et al.The controversial role of human gut Lachnospiraceae[J].Microorganisms,2020,8(4):573.
[24] LARABI A B,MASSON H L P,B
UMLER A J.Bile acids as modulators of gut microbiota composition and function[J].Gut Microbes,2023,15:2172671.
[25] ZHONG Y J,CHANG X J,ZHAO Z H,et al.Bacteroides fragilis capsular polysaccharide A ameliorates ulcerative colitis in rat by recovering intestinal barrier integrity and restoring gut microbiota[J].Frontiers in Pharmacology,2024,15:1402465.
[26] WANG Y Q,WU Y Y,LI C S,et al.Genome-resolved metaproteomic analysis of microbiota and metabolic pathways involved in taste formation during Chinese traditional fish sauce(yu-lu)fermentation[J].Frontiers in Nutrition,2022,9:851895.
[27] RUAN L C,JU Y J,ZHAN C Y,et al.Improved umami flavor of soy sauce by adding enzymatic hydrolysate of low-value fish in the natural brewing process[J].LWT,2022,155:112911.