明胶是一类由胶原蛋白经过部分水解获得的天然高分子材料,具有良好的成胶性能、生物相容性和可降解性,广泛应用于糖果、乳制品、肉制品及功能性食品中,可以赋予产品理想的质构、口感和稳定性[1]。 其中,牛皮明胶因来源稳定、胶原含量高、成胶性能良好被广泛采用。 然而,天然明胶存在凝胶强度不足、热稳定性较差、极端条件下凝胶网络易破坏等缺陷,制约了其在高端食品领域的应用。
为改善明胶的结构与功能特性,糖类与明胶的复合改性逐渐成为研究热点。 根据分子结构和聚合程度的不同,糖类可分为单糖、低聚糖和多糖,不同类型糖通过氢键作用、疏水相互作用及糖基化反应等方式,调控明胶分子链构象及空间排列,从而影响凝胶的力学与物理性能[2]。 单糖(如木糖、D-半乳糖)在明胶改性中表现出较高的反应活性,可显著提高凝胶强度与储能模量,其中木糖(xylose, Xyl)促进蛋白链之间的交联与结构重组,增强凝胶的弹性和结构稳定性;D-半乳糖(D-galactose,D-Gal)也能够增强凝胶网络的均匀性,形成更致密的微观结构[3]。 低聚糖兼具反应活性与空间结构优势,在凝胶调控中表现出良好的协同作用。 研究发现,低聚木糖(xylooligosaccharides, XOS)可显著提高乳清蛋白及牛乳体系的热凝胶性能,改善凝胶的致密性和储能模量[4]。 低聚果糖(fructooligosaccharides, FOS)与明胶复配后,可有效提升凝胶强度和持水性,从而改善凝胶结构稳定性[2]。 多糖分子质量较大、链结构复杂,往往通过物理缠结和多点相互作用参与凝胶网络构建。 研究发现,银耳多糖(tremella fuciformis polysaccharide, TFP)可改善明胶体系的黏性和保水性,改变了明胶的螺旋结构,结晶特征和微观结构[5]。 此外,魔芋葡甘聚糖(konjac glucomannan, KGM)与蛋白质体系复配后,可促进分子链重排,使凝胶网络更加致密均一,显著提高其耐剪切性与结构稳定性[6]。 然而,糖-明胶复合体系在加工过程中网络结构容易被破坏,导致凝胶性能下降,仍需进一步探索增强凝胶稳定性的方法。
近年来,酶法改性因反应条件温和、专一性强而受到广泛关注。 转谷氨酰胺酶(transglutaminase, TG 酶)是一种催化酰基转移反应的酶,能够催化蛋白质分子间形成ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸异肽键,有效增强蛋白质的网络结构稳定性和机械强度[7]。 此外,TG 酶可以与糖类发挥协同作用提升凝胶品质。 Wahlström 等[8]制备TG 酶诱导的阿拉伯木聚糖-谷蛋白凝胶时发现,糖类可以通过提供反应性氨基或调控蛋白构象提升TG酶介导的交联效率,促进杂化凝胶的形成。 Shen 等[9]发现,β-乳球蛋白在TG 酶作用下与氨基葡萄糖或壳寡糖交联及糖基化改性后,凝胶热稳定性、结构致密性及凝胶强度等方面均显著提升,表明糖类在TG 酶改性过程中具有协同增强凝胶特性的作用。
基于此,本研究以牛皮明胶为基础,探究不同类型糖类(木糖、D-半乳糖、低聚木糖、低聚果糖、银耳多糖、魔芋葡甘聚糖)及TG 酶对牛皮明胶在凝胶强度、热稳定性、流变、微观结构等方面的影响,分析糖和TG 酶的协同作用机制,为开发高性能明胶基食品材料提供理论依据和技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜牛皮,兰州小西湖市场;木糖,浙江华康药业股份有限公司;D-半乳糖,云浮市新金山生物科技有限公司;低聚木糖,山东百龙创园生物科技股修有限公司;低聚果糖,山东百龙创园生物科技股修有限公司;银耳多糖,上海名达生物科技;魔芋葡甘聚糖,湖北强森魔芋科技有限公司;TG 酶,泰兴市东圣生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
FA2004B 电子天平,上海平轩科学仪器有限公司;TA-XT2 Express 质构仪,合肥安科环境试验设备有限公司;H1850R 高速台式冷冻离心机,长沙湘怡离心机仪器有限公司;Nicolet iS20 傅里叶红外光谱仪,北京科美润达仪器有限公司;Discovery X3 差示扫描热量仪,美国TA 公司;WB100-6F 水浴锅,常州越新仪器制造有限公司;SHJ-6D 磁力搅拌水浴锅,常州未来仪器制造有限公司;S-3400 N 扫描电镜,日本Hitachi 公司;X 射线衍射仪,北京嘉德利达科技有限公司;低场核磁共振成像分析仪,苏州纽迈分析仪器股份有限公司;耐驰NETZSCH4 热重分析仪,德国耐驰仪器制造有限公司;安东帕MCR 102e 流变仪,柜谷科技发展(上海)有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 牛皮明胶的制备
用清水清洗新鲜牛皮表面残留血液及污物,经脱毛、去脂、去杂蛋白等预处理后,与水按照质量比为1∶4混合、高压炖煮45 min,然后在80 ℃下水浴5 h。 提取结束后,过滤掉皮渣。 所得滤液在8 000 r/min,4 ℃条件下离心20 min,取上清液,冷冻干燥。
1.3.2 复合凝胶的制备
取1 g 冷冻干燥的牛皮明胶加入18 mL 超纯水中,55 ℃水浴至完全溶解。 将6 种糖(木糖、D-半乳糖、低聚果糖、低聚木糖、银耳多糖、魔芋葡甘聚糖)溶液分别按照不同质量浓度(1、2、4、6、8 g/L)混合均匀,冷却形成凝胶。 选择比例为6 g/L 的低聚果糖和银耳多糖进行复配,复配质量比为2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4,冷却成胶。 然后在低聚果糖与银耳多糖复配比为1∶3的条件下制备TG 酶质量浓度为1、2、4、6、8 g/L 的复合凝胶,调节pH 至7。 复合凝胶在4 ℃下贮藏12 h 后测定指标。
1.3.3 凝胶强度测定
使用质构仪在凝胶模式下测定。 采用P/0.5 探头,参数设定：触发力为5 g,测试前速度为1 mm/s,测试速度1 mm/s,测试后1.5 mm/s。
1.3.4 水分分布
根据Li 等[10]的方法,在32 ℃条件下,将复合凝胶放置在聚四氟乙烯圆柱管中,并插入40 mm 的射频线圈中。 所使用的参数是对于90 μ 脉冲P1 的27°S和对于180 μ 脉冲P2 的54°S。 利用SIRT 算法对CPMG 数据进行了反演。
1.3.5 流变学测定
使用旋转流变仪测定复合凝胶样品的动态流变学行为,平行板直径为40 mm,间隙为1 mm。 选择振荡模式,应变为0.05%,频率扫描范围0.1 ～100 Hz,记录扫描过程中储能模量(G′)、损耗模量(G″)和损耗角正切tanδ。
1.3.6 热稳定性
取复合凝胶冻干样品2 ～3 mg 置于铝锅中密封,记录好样品质量,在氮气气氛下以5 ℃/min 的扫描速度从20 ℃加热至160 ℃,以空坩埚作为对照,记录冷凝胶的热变性温度(Td)、热变性峰温(Tp)和焓值(ΔH)。
1.3.7 分子间作用力
根据高永芳[11]的方法,将1 g 复合凝胶分别溶于9 mL 5 种不同的溶液匀浆。 5 种溶液分别为：0.05 mol/L NaCl (S1)、0.6 mol/L NaCl (S2)、1.5 mol/L尿素+0.6 mol/L NaCl (S3)、8.0 mol/L 尿素+0.6 mol/L NaCl (S4)和8.0 mol/L 尿素+0.5 mol/L β-巯基乙醇+0.6 mol/L NaCl (S5)。 样品匀浆后,在4 ℃下以8 000 r/min 离心15 min。 用双缩脲法测定上清液中蛋白的浓度。 S2 与S1、S3 与S2、S4 与S3、S5 与S4的浓度差分别表示静电相互作用、氢键、疏水相互作用和二硫键的含量。
1.3.8 X 射线衍射光谱(X-ray diffraction, XRD)
使用X-射线衍射仪(Cu-Kα 辐射)在25 mA 和35 kV 下测定冷凝胶冻干粉的结晶性质。 扫描的速率设为8°/min,扫描的范围是5° ～40°(2θ)。
1.3.9 傅里叶红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)
使用傅里叶红外光谱仪测定复合凝胶冻干样品的红外光谱性质。 在400 ～4 000 cm-1扫描32 次,光谱的分辨率为4 cm-1。
1.3.10 微观结构
取少量凝胶冻干样品粘在样品台上,进行喷金处理,随后使用扫描电镜在5 kV 的加速电压下观察样品。
1.4 数据处理
所有实验至少重复3 次。 使用IBM SPSS Statistics 27 对数据进行方差分析(ANOVA)和邓肯多重范围检验,并对显著性差异进行评价,显著性水平设为P ＜0.05。 所有图表均使用Origin 2022 绘制。
2 结果与分析
2.1 不同糖的质量浓度对牛皮明胶凝胶强度的影响
如图1 所示,添加不同种类糖的复合凝胶,其凝胶强度均呈现先升高后降低的趋势。 低浓度糖类可通过氢键与明胶分子形成物理交联点,增强网络稳定性。 随着糖浓度从2 g/L 增加至6 g/L,FOS、TFP、木糖、D-半乳糖、魔芋葡甘聚糖的凝胶强度持续升高,并在6 g/L 达到峰值;当浓度继续升高,凝胶强度开始降低。 低聚木糖在2 ～4 g/L 略有升高,但在6 ～8 g/L时,凝胶强度显著降低,这可能是由于过量的糖分子占据了交联位点,从而影响了凝胶网络的交联密度和结构完整性[12]。 结果表明,不同糖种类对凝胶性能的作用存在差异,其中FOS 和TFP 在6 g/L 时表现出最佳增强效果,说明糖的分子结构及其与明胶分子间的相互作用对提高复合凝胶的凝胶强度具有关键作用。 因此,选择TFP 与FOS 进一步研究其复配比例对凝胶强度的影响。
图1 不同糖及其质量浓度对复合凝胶凝胶强度的影响
Fig.1 Effects of different sugars and their mass concentrations on the gel strength of composite gels
注：不同小写字母表示差异显著(P ＜0.05)(下同)。
2.2 FOS 与TFP 最佳复配比例的确定
由图2 可知,随着银耳多糖比例的增加,凝胶强度呈现先升高后降低的变化趋势,在FOS∶TFP =1∶3时(质量比),凝胶强度达到最高值,显著高于其他配比组(P ＜0.05)。 该结果表明FOS 与TFP 在明胶复合体系中具有协同增强效应,其中银耳多糖在增强凝胶三维网络结构与稳定性方面发挥主导作用,适当提高其比例可显著改善复合凝胶的力学性能。 然而,当FOS∶TFP=1∶4(质量比)时凝胶强度降低,这可能是由于TFP 含量过高时,体系中多糖对水分的竞争性结合增强,会削弱蛋白质分子间的有效交联,甚至引发局部相分离或网络结构不均一,最终导致凝胶强度下降。
图2 低聚果糖与银耳多糖复配比例对凝胶强度的影响
Fig.2 Effect of the blending ratio of fructooligosaccharides and Tremella fuciformis polysaccharides on gel strength
2.3 TG 酶质量浓度对复合凝胶凝胶强度的影响
如图3 所示,在TG 酶质量浓度为1 ～4 g/L 时,凝胶强度随酶浓度的增加而升高,并在4 g/L 时达到最高值,其中FOS + TFP 组凝胶强度最高(P ＜0.05),当酶浓度继续升高,凝胶强度出现下降趋势。这可能是由于TG 酶催化蛋白质分子间产生ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸共价异肽键,提高了三维交联密度并增强了网络结构稳定性,但当酶浓度过高,蛋白质分子间过度交联,会导致凝胶强度下降[13]。 相关研究表明,适当浓度的TG 酶,可提高凝胶体系的凝胶强度,而在过高酶浓度条件下,由于过度交联和蛋白再聚集导致网络不均一,从而使凝胶强度趋于平稳甚至下降[14],与本实验结果一致。
图3 TG 酶质量浓度对复合凝胶的凝胶强度的影响
Fig.3 Effect of TGase mass concentration on the gel strength of composite gels
2.4 水分分布
采用低场核磁共振(low-field nuclear magnetic resonance, LF-NMR)技术对复合凝胶网络中的水分分布状态进行分析。 如图4 所示,不同复合凝胶样品的弛豫时间分布曲线呈现3 个特征峰,分别对应于T21(0.1 ～1 ms)、T22(1 ～100 ms)和T23(100 ～10 000 ms),依次代表结合水(分子内紧密结合水)、固定水(被限制在凝胶网络中的水)和自由水(存在于凝胶网络外部的水)[15]。 由表1 可知,不同复合凝胶中各组分水所占比例,其中结合水、固定水和自由水在凝胶中所占百分比,分别记为P21、P22、P23。 自由水P23 在各样品中占主导地位,其次是固定水P22。 与对照组相比,添加FOS 与TFP 后,T21、T22 和T23 的弛豫时间缩短,P21占比增加、P22与P23 值减小,表明糖分子通过形成氢键与明胶链结合,凝胶中水分流动性降低,从而增强了对水分的束缚能力[16]。 经TG 酶处理后,CK +TG、TFP + TG、FOS + TG 及TFP + FOS + TG 组的T22峰均明显增强且整体向短弛豫时间方向移动,这可能是由于TG 酶催化的共价交联提高了凝胶网络的紧密性和弹性,使水分分布更加均匀且束缚更强[17]。李先保等[18]发现TG 酶诱导猪肉肌原纤维蛋白凝胶聚合交联,使得T2弛豫峰左移,证实了更加致密的凝胶网络结构能有效限制水分子的自由度。 本研究发现TFP +FOS +TG 组的峰值最强且分布最宽,说明复合凝胶在氢键与酶促共价交联的双重作用下形成更加致密和稳定的网络结构,使水分子受到更强的束缚,促进自由水向固定水与结合水转化。
表1 不同复合凝胶的弛豫时间(T2)及对应的峰面积百分比(P2)
Table 1 Relaxation time (T2) and corresponding peak area percentage (P2) of different composite gels
样品T21 /msT22 /msT23 /msP21 /%P22 /%P23 /%CK1.5 ±0.52a36.09 ±3.26a1 317.07 ±17.81a4.31 ±0.16d7.30 ±0.15c89.64 ±0.11a TFP1.28 ±0.10a35.64 ±1.91ab1 193.81 ±16.79b5.83 ±0.13b6.28 ±0.25d89.42 ±0.39ab FOS1.20 ±0.14a34.78 ±2.31ab1 174.44 ±20.68bc4.75 ±0.19c6.27 ±0.24d87.90 ±0.11c TFP +FOS1.11 ±0.21ab32.95 ±1.30bc1 158.02 ±16.81c4.97 ±0.14c6.89 ±0.18c88.36 ±0.66bc CK +TG1.36 ±0.30a34.43 ±1.97ab1 080.02 ±15.98d6.07 ±0.10ab8.24 ±0.22b86.78 ±0.24d TFP +TG0.56 ±0.13b32.10 ±3.24bc1 060.11 ±15.50d5.15 ±0.14c8.62 ±0.35b85.31 ±0.45e FOS +TG0.92 ±0.60ab31.38 ±2.20bc1 019.01 ±13.58e6.46 ±0.09a8.50 ±0.39b86.35 ±0.53de TFP +FOS +TG0.57 ±0.02b29.49 ±2.13b990.50 ±23.48e4.31 ±0.16d9.69 ±0.18a83.84 ±0.24f
注：不同小写字母表示差异显著(P ＜0.05)。
图4 不同复合凝胶的低场核磁共振T2 弛豫时间分布曲线
Fig.4 T2 relaxation time distribution curves of different composite gelatin gels obtained by low-field nuclear magnetic resonance
2.5 流变学性质
如图5 所示,所有凝胶样品的储能模量(G′)均高于损耗模量(G″),表明凝胶体系的弹性特征占主导地位[11]。 随着频率增加,所有凝胶样品的G′和G″均逐渐升高,说明凝胶在高频下分子链运动受限、凝胶弹性增强。 与对照组相比,添加低聚果糖或银耳多糖的复合凝胶G′显著升高,这是由于多糖与明胶之间通过氢键相互作用增强了网络结构的稳定性[19]。当TG 酶参与交联后,G′和G″进一步增加,尤其是TFP +FOS +TG 组,表现出最强的弹性模量与储能模量,说明酶促共价键的引入进一步提升了凝胶的结构致密性与弹性回复能力。 汪倩等[20]研究发现,多糖的引入及TG 酶介导的共价交联可显著提高明胶体系的储能模量并降低tanδ,使凝胶结构更加致密稳定,与本研究中复合凝胶体系黏弹特性的变化趋势一致。 此外,TFP +FOS +TG 组的tanδ 值最低,说明体系能量损耗最小、弹性贡献占主导,表现出较好的结构稳固性与弹性回复特征。 综上所述,FOS 与TFP 的协同作用在TG 催化下进一步增强了凝胶体系的能量储存能力,使复合凝胶具有更好的黏弹特性和稳定性。
图5 不同复合凝胶的G′、G″和tanδ 的变化
Fig.5 Changes in storage modulus (G′), loss modulus (G″), and loss factor (tanδ) of different composite gels
2.6 热稳定性
差示扫描量热法(differential scanning calorimetry, DSC)可以从热力学角度有效揭示复合凝胶体系中蛋白质结构的变化及其稳定性。 其中,峰值温度(Tp)或变性温度(Td)是反映蛋白质凝胶热稳定性的关键参数,其数值的高低直接体现了凝胶网络抵抗热变性的能力;而焓变(ΔH)则表征蛋白质有序结构转变或解聚所需的热量,其变化可间接反映蛋白质分子间聚集或交联的程度[21]。 如图6 和表2 所示,所有复合凝胶样品均表现出明显的热转变峰,其Td、Tp 及ΔH 值存在显著差异(P ＜0.05)。 与对照组相比,添加TFP 或FOS 后,凝胶的热转变温度上升,说明糖类分子的引入能够提高凝胶的热稳定性。 这可能是由于糖与明胶分子间形成氢键相互作用,限制了链段运动,使凝胶结构更加稳固[13]。 Binsi 等[22]发现天然多糖显著提高了明胶复合凝胶的热转变温度并增强其对热诱导解聚的抵抗能力,主要是由于多糖与明胶分子间形成的氢键及分子缠结作用,该变化趋势与本研究结果一致。
表2 不同复合凝胶的热特性
Table 2 Thermal properties of different composite gels
样品Td/℃Tp/℃ΔH/(J/g)CK35.59 ±1.48d59.76 ±2.32d34.17 ±1.76e TFP40.09 ±1.26ab67.52 ±2.00c43.32 ±1.95cd FOS38.26 ±1.39bc67.47 ±0.90c40.15 ±2.97d TFP +FOS38.96 ±1.30ab70.88 ±1.78b44.94 ±1.62bc CK +TG36.09 ±1.59cd65.41 ±1.72c41.35 ±1.61cd TFP +TG39.13 ±1.65ab74.74 ±1.47a47.07 ±2.58b FOS +TG40.38 ±1.58ab75.08 ±1.46a48.24 ±2.13b TFP +FOS +TG 41.41 ±1.30a72.38 ±1.61ab54.76 ±1.22a
注：不同小写字母表示差异显著(P ＜0.05)。
图6 不同复合凝胶的DSC 曲线图
Fig.6 DSC curves of different composite gels
加入TG 酶后,所有样品的热稳定性进一步增强,CK +TG 组的Tp提高至65.41 ℃,ΔH 从CK 组的34.17 J/g 增加至41.35 J/g;TFP +FOS +TG 组的Tp升高至72.38 ℃,ΔH 从TFP +FOS 组的44.94 J/g 增加至54.76 J/g。 这是由于酶促反应在凝胶网络中形成了额外的共价交联键,从而提高了其对热诱导解聚的抵抗力[23]。 此外,糖与TG 酶共同作用后的复合凝胶具有更高的热稳定性,说明两者在交联过程中存在协同效应,可以强化分子间作用并优化凝胶的三维结构。 其中,TFP + FOS + TG 组的热稳定性最为突出,表明多糖复配与酶交联的协同作用可显著提升凝胶的热稳定性。 这可能是TFP 与FOS 通过氢键与明胶相互作用的同时,TG 酶进一步促进形成更加致密的三维网络结构,强化了分子链间的相互约束,从而显著提高了凝胶的热稳定性[10]。
2.7 分子间作用力
蛋白质溶解度反映了系统内的蛋白质聚集,间接表征了分子间力的强度[24]。 由图7 可见,不同糖类及TG 酶处理对复合凝胶的分子间作用力均具有显著影响(P ＜0.05)。 与对照组相比,FOS 和TFP 的引入均增强了氢键和疏水相互作用,这是由于多糖通过羟基与明胶分子结合,形成紧密空间结构,促进网络稳定性[25]。 经TG 酶处理后,二硫键含量显著增加,说明共价交联在凝胶强化中起主导作用。 TG 酶诱导使蛋白质分子展开,暴露出更多疏水基团,从而增强了疏水相互作用[26]。 此外,二硫键的形成与TG 酶交联过程中蛋白质构象的变化相关。 氢键和疏水作用的进一步增强表明,TG 酶可在糖类作用的基础上促进非共价作用,从而增强凝胶的结构稳定性。 张根生等[27]研究发现,TG 酶诱导蛋清蛋白发生交联,显著增强了体系内疏水相互作用与二硫键等分子间作用力,促进高分子聚集体形成并稳定凝胶网络结构,这与本研究结果相似。
图7 不同复合凝胶的相互作用力
Fig.7 Interaction forces of different composite gels
2.8 XRD
由XRD 图谱(图8)可以看出,不同复合凝胶样品在约7°和20°处均出现了明胶的特征衍射峰,表明复合凝胶中存在晶体结构[28]。 与对照组相比,添加FOS、TFP 组的衍射峰强度减弱,且峰形趋于平缓,表明糖分子通过与明胶链形成氢键等相互作用,破坏了原有分子链的规整排列,使体系结晶度下降[29]。 经TG 酶处理后,各样品在约7°和20°处的特征衍射峰均有所增强,表明TG 酶催化形成的ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸共价交联增强了分子链间的连接作用,促进了分子链局部规整堆积,从而提高了体系晶体结构的有序性[30]。 其中,TFP + FOS + TG 组衍射峰增强最为明显,表明FOS、TFP 与TG 酶的协同作用促进了明胶分子链的聚集与有序排布,增强凝胶网络的稳定性。 该结果与低场核磁共振分析中TFP + FOS + TG 组表现出较强的水分束缚能力和更均匀的水分分布结果相互印证,共同揭示了其优异凝胶性能的结构基础。
图8 不同复合凝胶的XRD 图谱
Fig.8 XRD patterns of different composite gels
2.9 FTIR
傅里叶变换红外光谱用于复合凝胶二级结构及分子相互作用的表征[13]。 如图9 所示,3 300 ～3 500 cm-1区域(O—H/N—H 伸缩振动)整体表现为红移并伴随峰形增宽与峰强度减弱,表明糖的引入增强了与C==O 或N—H 的氢键作用,使体系氢键网络更加稳定[31];TG 酶处理后该现象更加明显,说明酶催化形成的ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸共价键减少了自由氨基数量,使氢键结合更加定向并促进网络致密化[17]。 在王成成等[32]的研究中,以鱼明胶为基质构建TG 酶-壳聚糖复合凝胶体系,TG 酶作用后酰胺A 带吸收峰发生红移,且峰强度减弱,表明TG 酶介导的共价交联与壳聚糖参与的氢键作用共同影响了明胶二级结构的稳定性,与本研究结果相似。 1 500 ～1 700 cm-1(酰胺Ⅰ与酰胺Ⅱ)出现红移并伴随峰强度降低,说明C==O与N—H 振动自由度受限,蛋白链之间形成更加紧密的氢键或共价交联。 1 200 ～900 cm-1 区域(多糖指纹区)在FOS、TFP 及其复配组中信号增强并峰形细化,说明多糖与明胶通过C—O/C—O—C 键形成非共价结合,进一步提升了疏水与范德华相互作用。 综上,糖类主要通过氢键和疏水作用增强网络稳定性,TG 酶则引入共价交联,两者共同构建了以共价键为骨架、非共价作用为补强的致密凝胶网络。
图9 不同复合凝胶的红外光图谱
Fig.9 FTIR spectra of different composite gels
2.10 微观结构
如图10 所示,FOS、TFP 及TG 酶的添加显著改变了牛皮明胶复合凝胶的微观结构。 对照组(CK)呈现较大且不规则的孔洞,结构相对疏松。 单独添加TFP 或FOS 后,凝胶孔隙明显缩小,网络趋于紧密,其中TFP 组表现为连续致密,片层结构更为平整,FOS 组则呈现疏松均匀分布的多孔网络结构,而TFP与FOS 复配组形成了孔径较为均一、网络连通性良好的结构,呈现出均匀分布且相对稳定的多孔网络。这可能是由于TFP 与FOS 在凝胶体系中产生了复杂的相互作用,二者在分子链的空间排布和水合竞争上可能并未产生协同填充效应,而是形成了一种新的结构平衡[33]。 在TG 酶诱导下,凝胶的结构显著致密化。CK +TG 组孔隙壁加厚,网络均一性改善;TFP +TG 和FOS +TG 样品中孔隙明显减小,壁面更为光滑紧密;尤其在TFP +FOS +TG 组中,孔隙基本闭合,形成高度致密的三维网络。 这表明,TG 催化的共价交联增强了明胶与糖之间的相互作用,使凝胶结构更加稳定和完整[17]。 总体而言,不同糖的添加通过调控孔隙形态改善了凝胶的网络结构,而TG 进一步促进了交联作用,显著提升了凝胶的致密性和稳定性。 Wang 等[14]研究发现,加入TG 酶的绿豆蛋白凝胶的网络结构比对照组更加致密、均匀,是由于TG 酶可催化蛋白质分子的ε-(γ-谷氨酰胺)赖氨酸交联,以增强凝胶网络结构。
图10 不同复合凝胶的微观结构(50 ×)
Fig.10 Microstructure of different composite gels (50 ×)
3 结论
本研究以牛皮明胶为研究对象,分别选用木糖、D-半乳糖、低聚木糖、低聚果糖、银耳多糖和魔芋葡甘聚糖6 种糖类与其复配制备复合凝胶体系,并以凝胶强度为评价指标,筛选出对牛皮明胶凝胶强度改善最为显著的低聚果糖(FOS)与银耳多糖(TFP),并发现FOS∶TFP =1∶3(质量比)为最佳复配比。 进一步引入TG 酶进行协同改性发现,添加4 g/L TG 酶可显著提升凝胶的凝胶特性,固定水比例明显增加,凝胶网络对水分子的束缚能力增强;热稳定性显著改善。通过FTIR、XRD 及SEM 分析发现,糖类主要通过氢键等非共价相互作用调控明胶分子链的聚集与空间排列,而TG 酶则通过催化形成ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸共价交联,有效提高了凝胶网络的交联密度与结构完整性,促使凝胶由疏松多孔结构向连续致密的三维网络转变。 本研究为构建兼具较高凝胶强度和热稳定性的牛皮明胶凝胶体系提供了思路与理论依据。
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