维生素B12 是B 族维生素中唯一含有金属元素的成员。 作为甲硫氨酸合成酶和甲基丙二酰辅酶A变位酶的辅因子,维生素B12在红细胞生成、神经系统功能和DNA 合成中发挥着重要作用[1]。 由于人体无法自主合成维生素B12,必须通过膳食或补充剂获取,这推动了维生素B12强化食品和补充剂市场的持续增长[2]。 然而,维生素B12 的化学稳定性较差,其分子结构中的钴-碳键(Co—C)对多种环境因素高度敏感[2-3],给食品加工和贮存过程中的活性保持带来了显著挑战。 维生素B12的降解行为受多种环境因素影响。 温度是影响其稳定性的关键参数之一,高温会显著加速钴胺素分子的分解,且不同温度下的降解动力学特征存在明显差异[4-6]。 溶液pH 值同样具有重要影响,研究表明,维生素B12 在弱酸性条件(pH 4.0 ～5.5)下相对稳定,而在强酸或碱性环境中容易降解[7-9]。 此外,光照对维生素B12 稳定性的影响尤为显著,日光照射下的降解速率明显高于人工光源,这与光激发下发生的配体置换反应密切相关[9-10]。 这些环境敏感性共同构成了维生素B12在食品应用中的主要技术瓶颈。
为克服上述稳定性问题,封装技术近年来受到广泛关注。 通过将维生素B12 包埋于载体基质中,可在活性成分与外部环境之间建立物理屏障,从而减缓其降解速率[11-13]。 针对酸性环境,Tirkkonen 等[14] 通过在微胶囊内部添加磷酸氢钠调节pH 值,避免芯材暴露于强酸条件,为维生素B12 的酸降解防护提供了可行方案。 在热稳定性保护方面,Yin 等[15] 利用W/O/W 乳液体系,通过添加可熔融吸热的固态脂,显著提升了喷雾干燥过程中益生菌的热存活率,该策略为维生素B12 在高温加工中的保护提供了直接借鉴。 光稳定性方面,Curi-borda 等[16]以蔗糖、麦芽糊精等为壁材,采用喷雾干燥法封装天然色素Bixin,使其光降解速率降低到1/30 ～1/70,证实了微胶囊对光敏感物质的保护效果。 不同载体化制备技术各具优势：喷雾干燥法适合连续化生产,成本低且壁材适用性广[17];喷雾冷凝法可在低温下操作,适用于疏水壁材的控释体系[11];W/O/W 复乳法通过双层结构实现缓释与多重保护[18];冷冻干燥法对热敏性物质兼容性高[19];脂质体等纳米递送系统则可通过其独特的双层膜结构为亲水性维生素提供有效保护[20]。这些载体系统的选择不仅影响包埋效率,还决定了维生素在加工、贮存及胃肠道环境中的释放行为与保留率。 尽管已有研究分别探讨了维生素B12 在不同环境条件下的稳定性或特定载体系统的保护效果,但目前仍缺乏对多种载体技术在相同评价体系下保护性能的系统比较。 特别是关于软糖等新型食品基质中维生素B12 的稳定性表现,仍缺乏充分的实验数据支持。
因此,本研究旨在系统考察以下3 个方面：a)通过pH、温度和光照的多因素协同实验,明确果胶软糖体系中维生素B12的稳定环境条件,重点关注酸性环境与其他因素的交互作用,为微胶囊壁材的pH 调控和结构设计提供理论依据;b)比较5 种不同微胶囊载体中维生素B12 的贮存稳定性,包括自制W/O/W微胶囊(W/O/W microcapsule, W/O/W-MC)、冷冻干燥微胶囊(cold drying microcapsule, CD-MC)、喷雾冷凝微胶囊(spray chilling microcapsule, SC-MC)、脂质体(liposome, LP)以及市售麦芽糊精微胶囊(maltodextrin microcapsule, MD-MC);c)评估各载体添加到软糖中对维生素B12光稳定性的保护效果。 本研究结果将为维生素B12强化食品和补充剂的配方设计、工艺选择及贮存条件优化提供科学依据,促进高稳定性维生素B12产品的开发与应用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
维生素B12,新和成生物技术有限公司;阿拉伯胶,鼎力生物降解材料有限公司;酪蛋白酸钠,Adamas-beta 化学试剂有限公司;黄原胶,上方生物科技有限公司;聚甘油酯蓖麻酸酯(polyglycerol polyricinoleate, PGPR),麦克林生化有限公司;大豆油,益海嘉里金龙鱼食品有限公司;氢化棕榈油(hydrogenated palm oil,HPO),新郑市拓丰食品有限公司;甲醇(色谱纯)、乙酸(色谱纯)、己烷磺酸钠(色谱纯)、盐酸(分析纯)、氢氧化钠(分析纯),上海沃凯生物技术有限公司;氰钴胺,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
ME3002E 电子天平,梅特勒-托利多仪器有限公司;T25 高速分散机,艾卡仪器设备有限公司;Avanti JXN-26 冷冻离心机,贝克曼库尔特国际贸易有限公司;ALLIANCE e2695 高效液相色谱仪,美国沃特世公司;Alpha 1-4LDplus 冷冻干燥机,德采实仪器设备有限公司;TL-D 紫外线灯管,荷兰皇家飞利浦公司。
1.3 实验方法
1.3.1 维生素B12含量测定
参考徐家根等[21]的条件稍作修改,采用HPLC法测定维生素B12含量,具体条件如下：
a)标准溶液配制：准确称取0.01 g 维生素B12 标准品(精确至0.000 1 g),置于100 mL 容量瓶中。 向其中加入80 mL 25% (体积分数)乙醇溶液,再用纯化水稀释并定容至刻度线,充分摇匀,制得浓度为100 μg/mL 的维生素B12水溶液。 以此水溶液作为母液,进行梯度稀释,配制成维生素B12系列梯度标准溶液。 将所得溶液经0. 22 μm 水系滤膜过滤后,用于上机测定,进而构建标准回归方程。
b)样品溶液配制：样品经前处理,去除蛋白质等杂质后,所得溶液通过0.22 μm 水系滤膜过滤,转移至液相瓶中,备用。
c) 色谱条件：色谱柱：Waters Xbridge C18-3 柱(250 mm × 4. 6 mm × 5 μm);柱温：35 ℃;流动相：300 mL 甲醇、700 mL 水(含1 g 己烷磺酸钠) 及10 mL 乙酸混合,真空抽滤;流速：0.7 mL/min;紫外检测器波长：361 nm;进样量：20 μL。
1.3.2 常温、高温、紫外-pH 协同实验设计
为研究果胶软糖加工过程中调酸及浇注,以及贮藏条件,对维生素B12 稳定性的影响,本研究设计了常温(25 ℃)、高温(70 ℃)、紫外(30 W/m2)-pH 协同实验。 鉴于果胶软糖pH 值通常为3.5,且维生素B12在强碱环境下稳定性较差,故将实验pH 设定为3.5 ～8.5。具体实验步骤如下：首先配制10 g/L 的维生素B12 水溶液,使用0.1 mol/L HCl/NaOH 溶液,将pH 值精准调节至3.5、4. 5、5. 5、6. 5、7. 5、8. 5。 完成pH 调节后,将各溶液分别置于室温避光、高温避光以及常温紫外光照的环境下贮藏。 在贮藏期的第1、3、6、9 天取样,并运用HPLC 测定样品中维生素B12含量。
1.3.3 维生素B12降解动力学
参考黄皓的研究[22],本研究系统考察了维生素B12水溶液在不同条件下的降解动力学行为。 通过非线性回归分析,构建了相应的降解动力学模型[23],动力学方程如公式(1)所示：
式中：k,降解速率常数,min-1;t,处理时间,min;C0,初始质量浓度,mg/L;Ct,t 时刻质量浓度,mg/L。
通过对比不同pH 值下的k 值,确定维生素B12的最适pH 值。 同时,对高温和紫外这2 种条件进行横向对比分析,研究其对维生素B12 产生的影响及其程度,该分析结果将为下一步实验提供指导。
1.3.4 载体制备
采用不同方法制备维生素B12 载体,比较自制载体与市售载体在软糖应用中对维生素B12稳定性的影响。 制备的微胶囊包括：W/O/W 微胶囊、冷冻干燥微胶囊、喷雾冷凝微胶囊、脂质体和市售样品麦芽糊精微胶囊。
1.3.4.1 W/O/W 微胶囊制备
a)微胶囊配方
油相(O 相)由5%(质量分数)PGPR、95%(质量分数)大豆油组成;
内水相(W1相)由维生素B12水溶液组成;
外水相(W2相)由5%阿拉伯胶、4%酪蛋白酸钠和0.3%黄原胶组成。
b)工艺流程
W1/O 乳液(初乳)的制备：使用高速剪切机,在8 000 r/min 的转速下,将W1相滴入O 相,剪切4 min,获得W1/O 乳液。
W1/O/W2 乳液的制备：在12 000 r/min 的转速下,将W1/O 乳液滴入W2相,剪切5 min,获得W1/O/W2乳液。
W/O/W 微胶囊的制备：将乳液冷冻干燥制得微胶囊,并保存于4 ℃冰箱中备用。
1.3.4.2 冷冻干燥微胶囊制备
将1.3.4.1 节中的内水相和外水相按照一定比例进行混合,冷冻干燥制得微胶囊,并保存于4 ℃冰箱中备用。
1.3.4.3 喷雾冷凝微胶囊制备
壁材由95%(质量分数)HPO 及5%PGPR 组成。将壁材加热至70 ℃,完全熔融后,混合料液在熔融温度下进行保温并进行高速乳化分散,使用高速剪切机在1 000 r/min 的转速下剪切2 min 以搅拌均匀。 加入一定量的维生素B12 粉末,在10 000 r/min 的速度下,剪切5 min,得到乳化液。 乳化液通过喷雾冷凝造粒,采用双流体加压雾化器,喷嘴直径为0.7 mm,喷嘴温度为70 ℃。 料液进料流量为25 mL/min,收集室内进口和出口温度分别为4 ℃和7.5 ℃,雾化空气压力为0.3 MPa。
1.3.4.4 脂质体制备
参考童桂鸿[24]的方法并加以改进,称取特定量的卵磷脂、胆固醇,与适量无水乙醇混合后,转移至250 mL 圆底烧瓶内,通过减压蒸发去除乙醇,使烧瓶内壁形成一层均匀薄膜。 随后,加入一定量的维生素B12 双蒸水溶液,旋转洗膜约15 min,获得脂质体悬液。 最后,将该悬液进行水浴超声处理,制得均匀性较好的维生素B12 脂质体悬液。 将所得维生素B12 脂质体悬液进行冷冻干燥,得到脂质体粉末,储存于4 ℃冰箱中备用。
1.3.5 微胶囊包封率及保留率的测定
分别称取2 份微胶囊于离心管中,质量为m0,分散在5 mL 纯水中,充分溶解。 其中一份离心(3 000 r/min,5 min)取上清液。 另一份使用超声波破碎仪进行破碎(振幅为80%,功率130 W,脉冲持续3 s,停2 s,总超声时长100 s),再离心(12 000 r/min,10 min)取上清液。 用0.22 μm 的水相滤膜过滤,通过液相测得溶液中维生素B12 的质量浓度分别为c1(g/mL)、c2(g/mL),且微胶囊中维生素B12 添加量为x0(g/g)。包封率( encapsulation efficiency, EE) 及保留率(retention efficiency, RE)的计算分别如公式(2)和公式(3)所示：
1.3.6 果胶软糖的制备
果胶与白砂糖先干态混匀,添加10 倍水在80 ℃水溶、转速600 r/min 搅拌溶解10 min,得到糖-果胶溶液。
取空锅和铲重,加入称量好的柠檬酸钠、柠檬酸和30 g 左右纯水,在65 ℃下煮5 min,得到缓冲盐溶液;
向缓冲盐溶液中加入糖-果胶溶液,不断搅拌避免结块,直到形成均一无结块的混合溶液I。
向混合溶液I 中加入葡萄糖浆,120 ℃下搅拌熬糖至固形物含量到75%,冷却至70 ℃,得到糖液。
维生素B12于50 g 纯水中搅拌溶解,在4 ℃下浸泡于70%(质量分数)山梨糖醇液5 min,加入到糖液中搅拌10 min,得到均匀的胶冻,向其中加入50%(质量分数)柠檬酸溶液,搅拌2 min,经冷却后于35 ℃烘箱干燥24 h,即得到制得含不同形式的维生素B12 的软糖,每颗软糖约为2 g,进行相关性能测试。
表1 果胶软糖配方
Table 1 Formula of pectin gummy candy
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注：—表示无特殊说明。
1.3.7 还原糖对维生素B12光稳定性影响
考虑到果胶软糖中的糖类组成有葡萄糖、葡萄糖浆、白砂糖、山梨糖醇,因此分别配制10% (质量分数)葡萄糖浆、葡萄糖、白砂糖、山梨糖醇水溶液,加入维生素B12,使其质量浓度达到25 μg/mL,并配制25 μg/mL 的纯维生素B12 水溶液,使用1 mol/L 的HCl 溶液,将各溶液的pH 值调节至3.5。 在紫外光下进行光照,分别在第1、3、6、9、12 h 取样测定。
1.3.8 初始浓度对维生素B12光稳定性影响
水溶液中的稳定性：配制不同浓度维生素B12 水溶液(2、4、6、8、10 g/L)进行光照处理。
软糖中的稳定性：人体对维生素B12 的吸收率与其剂量成反比,过高会导致吸收效率大大降低,因此实验的软糖中维生素B12 添加量将≤25 μg/g。 制备不同维生素B12含量的软糖(5、10、15、20、25 μg/g)进行光照处理。
1.3.9 载体对维生素B12光稳定性影响
1.3.9.1 载体体系
精确称取1 g 维生素B12载体粉末,维生素B12 载量均为0.3%(质量分数),放置于6 孔板内,随后将孔板置于光照强度为30 W/m2 的紫外装置下,照射4 d。 照射结束后取样,取样进行HPLC 检测,记录保留率。
1.3.9.2 果胶软糖体系
把不同形式的维生素B12载体粉末添加至糖浆之中,以此制备果胶软糖,软糖中维生素B12 的含量达25 μg/g。 取规格为2 g 的软糖,放置于6 孔板内,置于光照强度为30 W/m2 的紫外装置下,照射2 d。 照射结束后取样,取样进行HPLC 检测,记录保留率。
1.3.10 初始浓度对载体中维生素B12光稳定性的影响
制备不同维生素B12载量梯度的W/O/W 微胶囊,载量分别为0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%(质量分数),进行光照处理。
1.4 数据统计与分析
所有实验均设置3 组平行,结果以“平均值±标准差”表示。 使用SPSS 23.0 软件对实验数据进行单因素方差分析。 采用Duncan 多重范围检验进行显著性差异分析,P ＜0.05 为显著水平。 作图通过Origin 2018 软件完成。
2 结果与分析
2.1 常温、高温及紫外-pH 协同对维生素B12稳定性的影响
2.1.1 常温-pH 协同对维生素B12稳定性的影响
如图1 所示,维生素B12 在不同pH 环境下的稳定性表现总体一致。 仅在pH 8.5 条件下,其保留率出现轻微下降,9 d 后降至93.54%;而在其他pH 条件下,维生素B12几乎未发生降解,保留率始终维持在99%左右,表明维生素B12 在这些条件下基本保持稳定。 这一结果清楚地表明,在常温条件下,维生素B12在果胶软糖的酸性环境(pH 3.5)中能够保持良好的稳定性。 此外,研究还发现,在pH 3.5 ～7.5 的弱酸至中性范围内,维生素B12均能保持稳定。 由此可见,在避光的常温软糖体系中,维生素B12 具有优异的稳定性。
图1 25 ℃下不同pH 值维生素B12 水溶液9 d 的保留率
Fig.1 Retention rates of vitamin B12 aqueous solutions with different pH values at 25 ℃over 9 days
注：不同小写字母表示样品间差异显著(P ＜0.05)(下同)。
2.1.2 高温-pH 协同对维生素B12稳定性的影响
如图2 所示,70 ℃高温条件下,维生素B12 在不同pH 环境中的稳定性存在显著差异。 当pH 为3.5时,维生素B12保留率基本保持稳定。 降解动力学曲线的拟合参数显示R2 ＞0.935,表明降解常数k 值具有较高的可靠性。 根据表2 中的动力学参数,pH 3.5时k 值最小,说明此时降解速度最低,维生素B12 在该条件下稳定性最佳。 经过9 d 的降解实验,维生素B12保留率仍高达到95.28%。 随着pH 值升高,保留率下降幅度增大,同时k 值相应增加,表明降解速率显著加快。 在弱酸性范围(pH 3.5 ～5.5)内,维生素B12表现出较好的稳定性,k ＜0.015 3,并且9 d 后保留率均大于86%。 相比之下,当pH≥6.5 时,k ＞0.035,降解速率大幅提升。 尤其是在pH 为8.5 时,9 d 后的保留率仅为64. 45%。 结果表明,在高温环境下,维生素B12稳定性随pH 升高(3.5 ～8.5)呈持续下降趋势。 维生素B12在pH 3.5 时最稳定,弱酸性环境下能维持较高的稳定性,而在碱性环境中则表现出较差的不稳定性。
图2 70 ℃下不同pH 值维生素B12 水溶液9 d 的保留率
Fig.2 Retention rates of vitamin B12 aqueous solutions with different pH values at 70 ℃over 9 days
表2 维生素B12 在高温-pH 条件下的降解动力学参数
Table 2 Degradation kinetic parameters of vitamin B12 under high temperature-pH conditions
加速条件lnC ～t 关系R2k/d -1高温(70 ℃)pH 3.5 ln(C0/Ct) = -0.005 0t -0.002 40.949 49 0.005 01 pH 4.5 ln(C0/Ct) = -0.008 3t -0.005 10.940 07 0.008 27 pH 5.5 ln(C0/Ct) = -0.015 3t -0.000 70.948 82 0.015 30 pH 6.5 ln(C0/Ct) = -0.035 2t +0.020 90.960 00 0.035 24 pH 7.5 ln(C0/Ct) = -0.038 2t +0.018 50.973 51 0.038 18 pH 8.5 ln(C0/Ct) = -0.046 9t +0.030 60.935 09 0.046 88
2.1.3 紫外-pH 协同对维生素B12稳定性的影响
如图3 所示,在紫外光照条件下,维生素B12的降解行为与热降解规律相似,结合表3 的k 值分析可知,紫外光照显著加快了维生素B12 的降解速率。 与高温组的热降解情况一致,当pH 为3.5 时,维生素B12降解最慢(k =0.024 98 d-1),稳定性最高;在弱酸性区间(pH 3.5 ～5.5),维生素B12仍保持相对稳定(k =0.024 98 ～0.025 7 d-1)。 在碱性条件(pH≥8. 5)下,k 值升至0.086 4 d-1,稳定性显著降低。 这一现象可能与维生素B12分子中的酰胺侧链(如丙酰胺和乙酰胺)有关。
图3 紫外光照下不同pH 值维生素B12 水溶液9 d 的保留率
Fig.3 Retention rates of vitamin B12 aqueous solutions with different pH values under ultraviolet light irradiation for 9 days
表3 维生素B12 在紫外-pH 条件下的降解动力学参数
Table 3 Degradation kinetic parameters of vitamin B12 under UV-pH conditions
加速条件lnC ～t 关系R2k/d -1紫外(30 W/m2)pH 3.5 ln(C0/Ct) = -0.025 0t -0.004 4 0.993 2 0.024 98 pH 4.5 ln(C0/Ct) = -0.022 9t -0.016 0 0.928 3 0.022 91 pH 5.5 ln(C0/Ct) = -0.025 7 -0.013 10.959 1 0.025 70 pH 6.5 ln(C0/Ct) = -0.036 7t -0.006 4 0.994 0 0.036 66 pH 7.5 ln(C0/Ct) = -0.061 3t -0.031 2 0.959 4 0.061 26 pH 8.5 ln(C0/Ct) = -0.086 4t -0.056 4 0.934 9 0.086 40
已有研究表明,酰胺键在强酸性或碱性(pH≤2或pH≥8. 5)条件下易发生水解而失效[9]。 相比于高温条件,紫外条件下的k 值更高,表明光照对维生素B12稳定性的影响远大于高温。 尽管维生素B12 在pH 3.5 时最稳定,但在紫外光照下仍快速降解,9 d后保留率降至80.18%。 因此,虽然无需调节软糖中维生素B12的pH,但提高其在光照环境下的稳定性仍十分必要。
综上所述,在常温、高温和紫外照射等不同环境条件下,维生素B12 在pH 3.5 时表现出最佳的稳定性。 这一pH 值恰好与软糖内部的酸碱度一致,因此无需通过载体对软糖中的维生素B12 进行额外的pH调节。 在软糖体系中,紫外光照对维生素B12 降解的促进作用显著强于热胁迫,成为导致其降解的主要因素。 基于这一发现,后续研究应重点提高后维生素B12在软糖中的光稳定性。
2.2 软糖中还原糖对维生素B12光稳定性的影响
在软糖中,除了上述影响因素外,还原糖也会加速维生素B12光降解。 曾建成[25]研究发现,维生素B12在还原糖溶液中光降解最快,非还原糖溶液次之,纯水溶液中最慢。 这应该与还原性物质在光降解中促使维生素B12中的钴离子从Co(Ⅲ)还原为Co(Ⅱ)有关。 为提高软糖中维生素B12 的光稳定性,需要进一步验证还原糖对其光降解的影响。
如图4 所示,白砂糖溶液体系的降解速率最低,其光降解率为87.32%,与其他糖溶液体系(葡萄糖、葡萄糖浆、山梨糖醇)相比具有显著统计学差异(P ＜0.05)。值得注意的是,还原糖溶液(葡萄糖、葡萄糖浆)与纯水溶液之间的降解速率无显著差异(P ＞0.05),表明还原糖的存在不会促进维生素B12的光降解。 实验观察发现,白砂糖水溶液呈现明显泛黄现象,而其他糖溶液均保持无色透明状态。 这可能是因为食品级白砂糖生产过程中残留的天然色素(如美拉德反应中间体、焦糖色素前驱物)。 这些内源性色素物质通过紫外光吸收以及光散射效应,发挥光保护作用。 上述分析及结果表明白砂糖中的天然色素是维生素B12光稳定性的关键保护因子,而还原糖的存在不影响其光降解行为。 因此,在软糖生产中,无需刻意减少还原糖(如果葡糖浆)的用量。
图4 不同糖溶液中维生素B12 的光照保留率
Fig.4 Light-induced retention rate of vitamin B12 in different sugar solutions
2.3 初始浓度对维生素B12光稳定性的影响
杨仁斌等[26]的研究表明,在水溶液体系中,三唑酮的光解速率与其初始呈负相关。 基于此,本文推测维生素B12 的光稳定性也可能与其初始浓度密切相关。 为了验证该假设,首先在水溶液体系中进行实验验证。 获得可靠结果后,进一步将研究结论拓展至软糖体系,探索通过提高维生素B12 初始浓度来提高其在软糖中稳定性的可行性。
2.3.1 初始浓度对水溶液中维生素B12 光稳定性的影响
如图5 所示,不同质量浓度的维生素B12 水溶液在光照条件下的保留率存在显著差异。 高浓度维生素B12溶液的保留率较高,当质量浓度为10 g/L 时可达72.27%。 然而,随着初始浓度降低,保留率显著下降;当质量浓度降至2 g/L 时,保留率仅为46.09%。这一现象可能源于：随着维生素B12浓度增加,溶液中分子数量增多,分子间对光子的竞争吸收加剧。 单位体积内维生素B12分子越多,单个分子获取的光能越少,从而减缓了光降解过程[27]。 该结果证实了维生素B12水溶液的光稳定性与其初始浓度相关的假设。
图5 不同质量浓度维生素B12 水溶液的光照保留率
Fig.5 Light retention rate of aqueous solutions of vitamin B12 at different mass concentrations
2.3.2 初始浓度对软糖中维生素B12光稳定性的影响
在软糖体系中,游离态维生素B12 (添加量为5 ～25 μg/g)经2 d 紫外光照后,整体保留率偏低,表现出较差的光稳定性。 如图6 所示,保留率波动范围较窄,仅为24. 5% ～26. 81%。 该结果表明,当维生素B12处于低浓度区间时,即使提高其初始添加量,对其光稳定性提升作用仍不显著。 推测主要原因在于,维生素B12在软糖体系中的占比极低,相较于体系中大量存在的糖类及其他组分,其对光吸收行为的贡献十分有限。 在软糖高温熬制过程中,多种糖类易发生焦糖化反应生成焦糖素等深色产物[28],这些物质具有较强的光吸收能力[29],可使整个体系形成显著的“光屏蔽/竞争吸收”环境。 由于维生素B12 本质上对光高度敏感[9],且其光降解反应具有明确的量子产率[30]。 在此背景下,推测即便进一步增加微量的维生素B12分子数量,由于体系内存在大量强吸光物质,维生素B12分子在光能竞争中仍难以占据优势,无法有效降低单个维生素B12 分子所获取的光能,因而难以实质性提升维生素B12 自身的光稳定性。 综上所述,当维生素B12初始浓度处于较低水平时,其浓度的变化对最终光稳定性的影响并不明显。 基于此,后续研究将借助微胶囊技术,探索提升维生素B12 光稳定性的有效途径。
图6 不同维生素B12 添加量的软糖光照保留率
Fig.6 Light retention rate of gummies with different addition forms of vitamin B12
2.4 载体对维生素B12光稳定性的影响
2.4.1 载体化粉末中维生素B12光稳定性
维生素B12 载体化粉末在紫外光下的保留率如图7 所示。 结果表明,以HPO 为壁材的喷雾冷凝微胶囊具有最佳的光稳定性。 Chalella Mazzocato 等[11]的研究表明,喷雾冷却技术可成功制备球形维生素B12固体脂质微粒,且在120 d 贮存后保留率大于91%。该技术不涉及有机溶剂,是一种温和的封装方法。 相比之下,喷雾干燥过程中水分的快速蒸发可能导致微胶囊壳收缩或形成微孔,从而影响对芯材的保护效果。此外,HPO 在室温下呈白色不透明状态,Liew 等[31]报道了HPO 的折射率数据(约1.45 ～1.47),表明其具有区别于透明油脂的光学特性,这可能是其光保护效果更优的原因之一。 同样通过喷雾方式制备的麦芽糊精微胶囊表现出较高的光保留率。 这可能是由于其能够形成完整的球形包覆结构,从而提供更全面的光阻隔保护。 W/O/W 型微胶囊的光稳定性略优于冷冻干燥微胶囊,两者的主要区别在于W/O/W 型微胶囊具有中间油相阻隔层。 这一结构特征可能使维生素B12更集中于油相内部,增加单位体积内的分子浓度,降低单个维生素B12分子接收的光能量,从而提高光保留率。 相比之下,脂质体的光保留率最低,这可能是由于其壁材的光阻隔能力较弱。 在研究了载体化维生素B12单独存在时的光稳定性后,本文进一步将其应用于软糖体系,以验证其是否遵循相同的光稳定性规律。
图7 不同载体化维生素B12 的光照保留率
Fig.7 The light retention rates of different vitamin B12 microcapsules
2.4.2 载体化粉末在软糖中维生素B12的光稳定性
如图8 所示,喷雾冷凝微胶囊在软糖中表现出最高的光保留率,但同时其测量误差也最大。 这主要归因于其壁材HPO 的水不溶性特性：在软糖制备过程中,这种微胶囊难以在水相中均匀分散,在糖浆体系中分散性更差,最终导致维生素B12分布不均,增大了测定误差。 相比之下,当以载体化粉末形式单独存在时,虽然麦芽糊精微胶囊和冷冻干燥微胶囊具有较高的稳定性,但它们在软糖中的保留率显著降低(分别为23.18%和24.67%),其表现与未包封的维生素B12 相近。 这是因为这2 种微胶囊的壁材均为水溶性物质,当溶解于水时壁材会裂解,导致维生素B12 释放。 因此,在添加到软糖后,维生素B12实际上已失去壁材保护,最终保留率与未包封形式趋于一致。 W/O/W 微胶囊的油相在软糖体系中起着关键作用。 其最外层的水溶性壁材确保了微胶囊在水中的均匀分散和复溶,而油相的水不溶性则能有效防止维生素B12 的直接释放。 这种结构不仅能够控制维生素B12的释放速率,还能提高单位体积内维生素B12 的浓度。 这种现象与微胶囊在水溶液中对维生素B12 的包封能力相关,本文推测水溶液中被油相包载的维生素B12越多,其在软糖中的光稳定性就越高。 此外,油相本身还具有一定的紫外线屏蔽作用。 值得注意的是,脂质体的保留率低于W/O/W 微胶囊,这一结果与其单独存在时的表现相符。
图8 不同载体化维生素B12 在软糖中的光照保留率
Fig.8 The light retention rates of different vitamin B12 microcapsules in gummy candies
综合上述分析,喷雾冷凝微胶囊在2 种情况下均表现出最高的光保留率。 然而,由于其在软糖体系中难以实现均匀分散,会导致产品品质不稳定,因此不适用于软糖应用。 相比之下,纯水溶性壁材微胶囊虽然单独存在时稳定性良好,但水溶后即失去保护功能。 而W/O/W 型微胶囊则能同时适应2 种体系,并保持较高的光保留率。
2.5 初始浓度对微胶囊维生素B12光稳定性的影响
前文中提到,维生素B12 浓度较高时(≥0. 2%,质量分数,下同),其光稳定性与维生素B12 初始浓度呈正相关。 因此从提高初始浓度的角度出发,来提高W/O/W 微胶囊的稳定性。 结果如图9 所示,随着微胶囊载量由0.1%提升至0.3%,微胶囊粉末的光照保留率从38.04%增长至51.20%,与此同时,包封率仅呈现出小幅度的波动,未呈现明显的变化趋势。 这一现象表明,在微胶囊体系中,当改变内水相维生素B12的浓度时,微胶囊的包封率基本维持恒定,即在一定范围内,较高的维生素B12浓度并不会引发芯材泄露,包封率并非限制光保护效果的关键因素。 而且,在微胶囊包封率保持稳定的情况下,随着微胶囊载量的增加,其光稳定性得以提升。 因此,在微胶囊的制备过程中,应尽量提高内水相维生素B12浓度以提高载量,结果对后续实验具有重要的指导意义。
图9 不同载量维生素B12 W/O/W 微胶囊的包封率及光照保留率
Fig.9 Encapsulation efficiency and light retention rate of vitamin B12 microcapsules with different loadings
注：不同大写字母表示样品间包封率差异著(P ＜0.05)。
3 结论与讨论
本研究系统解析了果胶软糖体系中维生素B12的光降解规律及其稳定化策略,主要结论如下：明确了果胶软糖中维生素B12 的最适pH 条件;澄清了还原糖作用的误区;筛选出W/O/W 微胶囊作为有效载体;提出了基于高内相浓度的光稳定性提升策略。 以下将结合相关文献对这些发现进行深入讨论。
3.1 维生素B12光降解机制与pH 依赖性
维生素B12 分子中的Co—C 键是其光敏感性的结构基础。 当暴露于光照(尤其是紫外和可见光)时,该键发生光解断裂,产生Co(Ⅱ)物种和烷基自由基,进而导致维生素活性丧失[27]。 本研究首先通过多因素协同稳定性实验明确了果胶软糖体系中维生素B12的最适pH 条件,这一发现与维生素B12 的化学稳定性规律高度一致。 文献表明,维生素B12 在弱酸性至中性pH 条件(pH 约4.0 ～7.0)下最为稳定[9],而在强酸或强碱环境中降解速率显著加快。 这一pH依赖性可归因于2 方面：其一,极端pH 条件影响Co—N(与苯并咪唑配位)的稳定性,进而改变钴中心的配位状态;其二,pH 影响体系中亲核试剂(如水分子、羟基)的活性,这些亲核试剂可能攻击Co—C 键或参与光解产物的二次反应[32]。 值得注意的是,果胶软糖体系的pH 通常需兼顾凝胶特性与活性成分稳定性,本研究确定的最适pH 条件为两者的平衡提供了关键参数。
3.2 还原糖对维生素B12稳定性影响
本研究通过原料糖溶液的光稳定性实验澄清了还原糖作用的误区,这一发现具有重要的实践意义。传统观点认为,糖类可通过降低水分活度或形成玻璃态基质来保护维生素B12,但本研究发现还原糖(如果糖、葡萄糖)反而加速维生素B12 的光降解。 这一现象可以从文献中找到合理解释,Barr 等[32]发现葡萄糖和蔗糖溶液会导致维生素B12 含量损失,且葡萄糖的破坏性更强。 近期研究进一步证实,还原糖的存在可能通过2 种途径加速维生素B12 降解：一是还原糖与维生素B12之间发生美拉德反应的早期阶段,生成具有氧化活性的中间产物;二是还原糖的光解产物(如自由基、羰基化合物)与维生素B12 或其光解中间体发生相互作用[9,33]。 Hadinata Lie 等[34]研究指出,添加山梨糖醇可减少维生素 B12 降解。 Temova Rakuša 等[9]研究指出,维生素B12 于其他水溶性维生素或还原性化合物共存时,其稳定性会因氧化还原反应而降低。 因此,在透明食品体系中,选择非还原糖(如蔗糖、海藻糖)或糖醇(如山梨醇、甘油)作为基质成分,对维持维生素B12的光稳定性至关重要。
3.3 载体筛选与光保护机制
在5 种载体中,W/O/W 复乳微胶囊表现出最佳的维生素B12 光保护效果。 这可能归因于其独特的“水-油-水”多层结构带来的综合优势。 从应用效果来看,该载体在透明食品基质(如果胶软糖)中具有独特适配性：外层水相保证了与亲水性食品基质良好的相容性,而中间油相可能起到了关键的保护作用。从光化学原理推测,维生素B12 的光降解通常需要水相环境以支持自由基的溶剂化和次级反应[27]。W/O/W 微胶囊将维生素B12 封装于内水相,中间油相的疏水环境可显著降低光照产生的自由基向活性成分扩散的效率,同时油相可能吸收或散射部分入射光,降低到达内水相的光强度。 类似地,聚合物环糊精和脂质体纳米载体也被报道可用于维生素B12的封装与光保护[35]。 He 等[36]的研究表明,多糖基多层微胶囊可显著提高维生素B12的封装效率与贮存稳定性。 此外,Chalella Mazzocato 等[11]采用喷雾冷却法制备的微胶囊同样证实了微胶囊化对维生素B12稳定性的改善作用。 本研究筛选的W/O/W 微胶囊在透明食品体系(如果胶软糖)中具有独特优势-外层水相保证了与食品基质的相容性,而中间油相则可能提供了有效的光保护。 需要指出的是,本实验比较了不同载体在终端产品形态下的维生素B12 保留率,但各载体的物理形态(如粒径、比表面积、基质透光性)存在显著差异。 因此,W/O/W 微胶囊的优异表现是其化学组成、多层结构、物理形态(粒径、光散射特性)等多因素的综合结果。 上述关于“油相阻隔自由基”或“光散射”的机制解释仍属推测,尚需通过控制载体形态归一化后的对照实验进一步验证。
3.4 维生素B12高内相浓度策略的理论基础
本研究最后提出,通过提高维生素B12 的初始浓度可实现基于高内相浓度的光稳定性提升,其有效性可从光化学动力学角度得到解释。 维生素B12的光降解遵循一级反应动力学。 在给定光照强度和光程条件下,单位体积内降解的维生素B12 分子数是恒定的(取决于吸收的光子数)[37]。 因此,当初始浓度提高时,降解比例相应降低,这是“浓度效应”的直接体现。 更重要的是,高浓度条件下,维生素B12分子之间的空间位阻和光吸收竞争也可能改变光降解的量子产率。 Kulkarni 等[37]的综述指出,维生素B12 的光降解量子产率为0.001 ～0.013,且受环境因素显著影响。 本研究提出的高内相浓度策略,实际上是通过提高目标保留率来对冲绝对降解量,为透明食品体系中维生素B12的稳定化提供了一种无需添加额外辅料的简便方案。
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