随着全球食品体系向可持续发展与营养均衡方向转型,植物蛋白资源的开发与高值化利用已成为食品科学与食品工业领域的重要课题。 美藤果(sacha inchi, Plukenetia volubilis L.)作为我国2013 年批准的新资源食品,其籽粒油脂中富含不饱和脂肪酸,提油后的果粕蛋白质含量高达56.61%,且氨基酸组成全面,是一种极具潜力的新兴植物蛋白来源[1-2]。 前期研究显示,美藤果蛋白主要包括清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白,其中清蛋白因溶解性较好并具有免疫调节活性而受到关注[3-4]。 然而,目前研究多集中于美藤果清蛋白的提取与功能评价,而对包含清蛋白、球蛋白及谷蛋白等在内的美藤果分离蛋白(sacha inchi protein isolate, SPI)的系统性研究仍显不足。特别是在清蛋白提取后,残留于粕中的球蛋白与谷蛋白等组分未能得到高效利用,造成了资源浪费。 因此,系统开展美藤果分离蛋白的提取、结构解析与功能提升研究,对实现全果高值化利用、延伸产业链具有重要意义。
在众多蛋白改性方法中,超高压(ultra-high pressure, UHP)技术作为一种非热物理手段,因其能有效调控蛋白质空间结构而不破坏共价键、不引入化学残留等优势,逐渐成为研究热点。 该技术通过压力改变蛋白质的氢键、疏水相互作用及离子键等非共价力,促使蛋白质分子展开、重排或聚集,从而改善其溶解性、乳化性和发泡性等功能特性,且能最大限度保持蛋白的天然营养价值与风味品质[5]。 目前,UHP 已在大豆[6]、乳清[7]、核桃[8-9]等蛋白的改性中展现出良好效果,然而其在SPI 领域的应用研究仍然较少。基于其优越的改性能力,采用超高压技术进行SPI 的结构修饰与性能强化,预计能够为其在食品工业中的拓展应用提供新的技术路径。
本研究以SPI 为研究对象,采用超高压处理(200、400、600 MPa)对SPI 结构特性(包括氨基酸组成、巯基与二硫键含量、粒径、表面疏水性、傅里叶变换红外光谱、荧光光谱等)及其功能性质(溶解性、起泡性和乳化性等)的影响。 通过阐明压力水平与蛋白质结构-功能关系的调控机制,以期为美藤果粕的高效利用与蛋白产品的功能化开发提供理论依据与技术支撑,从而推动美藤果资源在全产业链中的可持续高值化利用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
美藤果粕,普洱联众生物资源开发有限公司;8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS)、5, 5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸) [5, 5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid), DTNB]、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)、EDTA,上海麦克林生化科技股份有限公司;大豆油,益海嘉里金龙鱼粮油食品股份有限公司;其余所有试剂均为分析纯。P0009 型BCA 试剂盒、P0012AC 型SDS-PAGE 凝胶快速配制试剂盒,上海碧云天生物技术股份有限公司。
1.2 仪器与设备
AF-06S 中药粉碎机,温岭市奥力中药机械有限公司;SHPP-5L 超高压辅助冻融设备,山西力德福科技有限公司;ALPHA 2-4 LD plus 冷冻干燥机,德国Martin Christ 公司;Rapid N Exed 杜马斯定氮仪,德国Elementar 公司;LA8080 氨基酸分析仪,日本HITACHI 公司;Evolution 300 光栅型酶标仪、Evolution 300紫外-可见分光光度计,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;Digital ULTRA TURRAX T18 高速均质机,艾卡(广州)仪器设备有限公司;ANKE TDL-5-A 台式离心机,上海安亭分析仪器有限责任公司;SpectraMax i3x连续波长多功能微孔板测试平台,美谷分子仪器(上海)有限公司;Nano ZS 90 马尔文粒度仪,英国马尔文仪器有限公司;Vertex 70 傅里叶变换红外光谱仪,德国布鲁克公司;Sigma 360 扫描电子显微镜,德国ZEISS 公司。
1.3 实验方法
1.3.1 SPI 的提取与基本组分分析
美藤果粕以1 ∶20(g∶mL)加入三级水搅拌提取2 h,离心4 000 r/min 10 min 弃去上清液。 沉淀以1∶20(g∶mL)加入2 mol/L NaCl(pH 10)溶液搅拌2 h,4 000 r/min 离心10 min 取上清液,6 000 ～8 000 kDa透析72 h,冻干。
SPI 的得率和提取率由公式(1)、公式(2)计算;水分的测定参考GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》直接干燥法;蛋白质的测定参考GB/T 31578—2015《粮油检验粮食及制品中粗蛋白测定杜马斯燃烧法》;脂肪的测定参考GB 5009. 6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》索氏抽提法。 灰分的测定参考GB 5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》。
式中：m1,SPI 的质量,g;m2,用于提取SPI 的美藤果粕的质量,g;m3,SPI 中蛋白质的含量,g;m4,用于提取SPI 的美藤果粕中蛋白质的含量,g。
1.3.2 SPI 的氨基酸含量测定和营养评价
参考GB 5009. 124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》,测定SPI 中水解氨基酸的含量。
1.3.3 超高压处理
将SPI(10 g/L)溶于去离子水中,装入300 mL 聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate,PET)密封瓶。 超高压介质为V(乙二醇)∶V(水溶液) =3∶2,超高压温度为25 ℃,超高压压力为(200 ±10)、(400 ± 10)、(600 ± 10) MPa,超高压处理时间为10 min。 超高压处理后,样品冻干72 h,贮存于-20 ℃直至使用。 超高压分离蛋白分别命名为UP2、UP4 和UP6。
1.3.4 SDS-PAGE
SDS-PAGE 方法参考Peng 等[10]的先前报道。 将蛋白样品与上样缓冲液混合至蛋白质量浓度为5 mg/mL,于沸水浴加热5 min 备用。 使用试剂盒配制5%浓缩胶和10%分离胶,上样6 μL 样品。 上层胶以80 V 电压通电,下层胶以120 V 通电。 电泳结束后使用考马斯亮蓝R250 染色液染色2 h,再用脱色液脱色12 h 拍照。
1.3.5 粒径
使用0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH =7)将样品稀释至1.0 mg/mL,过0.22 μm 滤膜,采用马尔文粒度仪检测样品的粒径。 仪器操作温度设定为25 ℃,蛋白质和分散剂的折射率分别为1.460 和1.330,吸收率为0.1。
1.3.6 游离巯基与二硫键含量
游离巯基含量的测量参考Qin 等[9]报道的Ellman 法并做出微小调整。 将20 mg 样品分散于10 mL含8 mol/L 尿素的Tris-Gly 缓冲液(4 mmol/L EDTA、86 mmol/L Tris 和90 mmol/L 甘氨酸,pH 8.0)中,离心5 min 取5 mL 上清液添加50 μL Ellman 试剂(4 mg DTNB 试剂溶于1 mL Tris-Gly 缓冲液中),涡旋均匀,25 ℃反应15 min,离心收集上清液。 以含有Ellman 试剂的缓冲液为空白,在412 nm 处测定上清液的吸光度。 总巯基测量为取上述5 mL 上清液添加50 μL β-巯基乙醇,25 ℃反应1 h,加入10 mL 120 g/L三氯乙酸,离心10 min,沉淀用10 mL 三氯乙酸清洗3 次,收集沉淀,溶于10 mL 8 mol/L 尿素Tris-Gly 缓冲液中,加入50 μL Ellman 试剂,于412 nm 波长下测定吸光值,游离巯基与二硫键含量计算如公式(3)、公式(4)所示：
式中：A412,样品测得的吸光度;D,样品稀释倍数;C,蛋白质量浓度,mg/mL。
1.3.7 表面疏水性
表面疏水性的测量参考Puppo 等[11]的方法。 用0.01 mol/L pH 7 磷酸盐缓冲液分别配制蛋白溶液(0. 4、0. 2、0. 1、0. 05、0. 025 mg/mL)和8 mmol/L ANS 溶液。 将4 mL 样品与20 μL ANS 混合并涡旋10 s,避光反应15 min,在激发和发射波长分别为390 nm和470 nm 时记录荧光强度,绘制浓度-荧光强度直线,该直线斜率的值为蛋白的表面疏水性。
1.3.8 扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)
将样品冻干粉末固定在导电胶上,表面喷金处理,采用扫描电子显微镜在300 倍和2 000 倍下观察蛋白的微观结构。
1.3.9 傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)
参考Guo 等[12]的方法测量红外光谱。 取1 mg蛋白样品与100 mg KBr 混合并研磨压片,在400 ～4 000 cm-1波数范围内,以4 cm-1 的分辨率、64 次的扫描次数进行傅里叶红外光谱测定。 采用OMNIC 和PeakFit v4.12 软件进行红外光谱酰胺I 带(1 600 ～1 700 cm-1)的傅里叶去卷积和二级导数,计算蛋白的二级结构含量。
1.3.10 荧光光谱
使用0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH =7.0)配制质量浓度为0.2 mg/mL 的蛋白溶液。 激发波长设定为290 nm,扫描315 ～500 nm 的发射光谱。
1.3.11 溶解性
称取20 mg 蛋白样品,加入1 mL pH 7 的去离子水,涡旋10 min,在10 000 r/min 条件下离心10 min后,收集上清液。 使用BCA 试剂盒测定上清液中蛋白含量,溶解度计算如公式(5)所示。
式中：W1,上清液中蛋白含量,mg;W0,样品中蛋白含量,mg。
1.3.12 乳化性和乳化稳定性
参考陈卓等[13] 的方法并进行一定的修改。 将18 mg 蛋白样品分散于9 mL 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲溶液中(pH =7)中,加入3 mL 大豆油,使用高速均质机10 000 r/min 均质1 min,从底部取50 μL 乳化液立即与4.95 mL 1 g/L SDS 溶液混合,在500 nm 测吸光值,以SDS 为空白;10 min 后,吸取底部50 μL 乳化液立即与4.95 mL 1 g/L SDS 溶液混合,在500 nm测吸光值。 乳化性和乳化稳定性计算如公式(6)、公式(7)所示：
式中：A0,在500 nm 测定的吸光值;A10,10 min 后在500 nm 测定的吸光值。
1.3.13 起泡性和起泡稳定性
参考王娣等[8]的方法并加以修改。 将150 mg 蛋白样品加入15 mL 0. 01 mol/L 磷酸盐缓冲液中(pH =7),使用高速均质机10 000 r/min 均质2 min,将均质后的泡沫和溶液迅速移入100 mL 量筒中,记录均质后泡沫体积;将均质后的溶液静置30 min,记录静置后泡沫体积。 起泡性和起泡稳定性的计算如公式(8)、公式(9)所示：
式中：V0,均质后的泡沫体积,mL;V30,静置30 min 后的泡沫体积,mL。
1.4 数据分析
所有实验均重复3 次,数据以“平均值± 标准差”表示。 数据处理采用SPSS 23、PeakFit 4.12、OMNIC 软件。 使用Origin 2021 软件完成数据的绘图。
2 结果与分析
2.1 得率、提取率与基本组分分析
通过盐提法提取的SPI 的得率、提取率与基本组分含量如表1 所示。 SPI 的得率达到了19. 45%,提取率达到了56.57%,表明盐提法能有效从美藤果粕中富集蛋白质。 产物的基本组分含量显示,其粗蛋白含量高达98.34%,脂肪与灰分含量分别仅为0.48%和1.69%,表明所得产物具有较高的蛋白纯度,符合分离蛋白的基本特征。
表1 SPI 的得率、提取率和基本组分单位：%
Table 1 The gross yield, extraction yield, and proximate component of SPI
得率提取率基本组分粗蛋白脂肪水分灰分19.45 ±0.85 56.57 ±2.46 98.34 ±0.350.48 ±0.068.68 ±0.61 1.69 ±0.00
2.2 氨基酸分析
对SPI 的氨基酸组成分析(表2)表明,与联合国粮食及农业组织(FAO)、世界卫生组织(WHO)和联合国大学(UNU)1985 年联合发布的成人氨基酸推荐值相比,该SPI 的组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸+ 酪氨酸(Phe + Tyr)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)含量均高于推荐值,其必需氨基酸占总氨基酸的比例为37.37%,高于大豆蛋白的35.44%,显示出较好的必需氨基酸组成特征。 然而,亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)和蛋氨酸+ 胱氨酸(Met + Cys)含量相对较低。 非必需氨基酸中,谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp) 含量最高, 这与许多植物蛋白的特征相符[14-15]。 疏水氨基酸占总氨基酸的29. 06%,这一比例与盐法提取的瓜蒌分离蛋白(AE-TPI,28.94%)相近,可能影响蛋白质的溶解度等功能性质[16]。
表2 SPI 的氨基酸组成
Table 2 The amino acid composition of SPI
氨基酸种类氨基酸含量/(mg/g 蛋白质)FAO/WHO/UNU(1985)推荐需要量/(mg/g 蛋白质)组氨酸(His)21.86 ±0.0715异亮氨酸(Ile)40.29 ±0.1830亮氨酸(Leu)55.64 ±0.1459必需氨基酸赖氨酸(Lys)33.52 ±0.0545蛋氨酸+胱氨酸(Met +Cys)22.71 ±0.3422苯丙氨酸+酪氨酸(Phe +Tyr)78.41 ±0.3238苏氨酸(Thr)36.78 ±0.1023缬氨酸(Val)44.78 ±0.2939天冬氨酸(Asp)110.56 ±0.26—丝氨酸(Ser)54.63 ±0.03—谷氨酸(Glu)165.36 ±0.04—非必需氨基酸 甘氨酸(Gly)46.13 ±0.06—丙氨酸(Ala)34.16 ±0.06—精氨酸(Arg)108.87 ±0.12—脯氨酸(Pro)40.06 ±0.04—
注：疏水氨基酸包括Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Val; “—”表示FAO/WHO/UNU(1985)未对该非必需氨基酸设定推荐摄入量。
2.3 SDS-PAGE
本研究通过还原性SDS-PAGE 分析了SPI 在超高压处理前后的亚基组成。 如图1 所示,提取物蛋白质条带主要分布在20 kDa 和32 kDa。 此分布模式与文献报道的美藤果主要蛋白特征相符[17-19]。 经超高压改性处理后,蛋白质样品的条带位置与未处理组相比未发生明显变化,表明超高压未引起蛋白质主链的明显降解或聚集[20]。
图1 未处理的SPI 和超高压改性的UP2、UP4 和UP6 的SDS-PAGE
Fig.1 SDS-PAGE of untreated SPI and UHP treated UP2, UP4, and UP6
2.4 粒径
图2展示了UHP 处理对SPI 平均粒径及其分布的影响。 未处理SPI 的平均粒径最大,为639.4 nm。经UHP 处理后,蛋白质粒径发生显著改变,其中UP4的粒径降至13.7 nm,表明400 MPa 能有效破坏维持蛋白质聚集体的非共价作用力(如疏水相互作用与氢键),从而解离大颗粒聚集体[6,12]。 粒径分布曲线进一步揭示了压力作用的阶段性变化：200 MPa 处理后,体系仍呈单峰分布,以大尺寸聚集体为主;400 MPa 处理使主峰明显转移至纳米尺度(约10 ～100 nm),证实该压力能高效拆解聚集体为更小的纳米级亚单元;而600 MPa 处理后出现双峰分布,表明部分解离蛋白发生重聚集。 结合2.3 节中的SDS-PAGE 结果(蛋白主链未发生断裂),该现象说明超高压主要通过调控蛋白质的非共价聚集状态来影响其分散特性。
图2 未处理的SPI 和超高压改性的UP2、UP4 和UP6 的平均粒径和粒径分布曲线
Fig.2 Particle size and particle size distribution curve of untreated SPI and UHP treated UP2, UP4, and UP6
注：不同小写字母表示差异显著(P ＜0.05)(下同)。
2.5 游离巯基与二硫键含量
UHP 影响SPI 的游离巯基与二硫键的含量如图3所示。 随着处理压力从200、400 MPa 升高至600 MPa,游离巯基含量呈阶梯式下降,分别为2. 21、1. 54、1.24 μmol/g,均显著低于未处理SPI(2.40 μmol/g)。该变化可能与压力作用下蛋白结构展开,部分包埋巯基暴露并发生氧化有关。 然而,二硫键总含量未发生显著变化,这可能意味着新二硫键的形成伴随了原有二硫键的重排或交换反应,这种现象也在荞麦13S 球蛋白中观察到[21]。
图3 未处理的SPI 和超高压改性的UP2、UP4 和UP6 的游离巯基和二硫键含量
Fig.3 Free sulfhydryl and disulfide bond content of untreated SPI and UHP treated UP2, UP4, and UP6
注：相同大写字母表示差异不显著(P ＞0.05)(下同)。
2.6 表面疏水性
采用ANS 探针法分析SPI 的表面疏水性的变化,结果如图4 所示。 表面疏水性在200 MPa 处理后略有上升,但与SPI 无显著差异(P ＞0.05),这表明蛋白质部分展开,内部疏水区域被暴露,导致表面疏水性微幅升高。 当压力升至400 和600 MPa 时,表面疏水性显著下降(P ＜0.05),分别降至1.78 ×107 和1.34 ×107。 这是因为解聚的蛋白质在高压影响下粒径减小,结构重组时疏水区域被重新包埋或通过分子间相互作用被屏蔽,导致可与ANS 探针结合的疏水位点数量减少,从而表现为表面疏水性显著下降[22]。
图4 未处理的SPI 和超高压改性的UP2、UP4 和UP6 的表面疏水性
Fig.4 Surface hydrophobicity of untreated SPI and UHP treated UP2, UP4, and UP6
2.7 FTIR
通过FTIR 对UHP 处理后SPI 的二级结构进行分析,结果如图5 所示。 各处理组特征峰的位置与SPI 基本一致,未发生明显位移,说明超高压处理并未引起蛋白质二级结构类型的根本性改变,其核心氢键网络仍保持稳定。
图5 未处理的SPI 和超高压改性的UP2、UP4 和UP6 的红外光谱和二级结构含量
Fig.5 FTIR and secondary structure content of untreated SPI and UHP treated UP2, UP4, and UP6
然而,经超高压处理后,SPI 的二级结构组成发生了显著变化。 随着处理压力的升高,α-螺旋结构含量由27.91%显著下降至12.22%,表明高压作用破坏了维持蛋白质有序构象的氢键体系,导致部分规整结构解离。 与此同时,β-折叠含量在200 MPa 时短暂升高后逐渐回落,而β-转角与无规卷曲的比例在400 MPa和600 MPa 处理下显著上升。 以上变化说明,超高压处理破坏了维持蛋白质有序空间结构的氢键网络,促使蛋白质二级结构从有序向无序态转变[23-24]。
2.8 荧光光谱
蛋白质的内源性荧光主要来源于色氨酸(Trp)残基,其荧光强度与残基所处微环境密切相关。 当Trp 残基从疏水性内部暴露于亲水性外部环境时,易发生溶剂淬灭,导致荧光强度降低[25-26]。 如图6 所示,UHP 处理显著改变了美藤果蛋白的荧光强度：在200 和400 MPa 处理下,荧光强度较SPI 增强;而在600 MPa 处理下,荧光强度则明显下降。 200、400 MPa下的荧光增强,表明蛋白结构发生一定程度的展开,Trp 残基暴露程度增加;600 MPa 下荧光强度显著降低,Trp 残基完全暴露至溶剂环境,淬灭效应最强[27]。
图6 未处理的SPI 和超高压改性的UP2、UP4 和UP6 的荧光光谱
Fig.6 Intrinsic fluorescence spectra of untreated SPI and UHP treated UP2, UP4, and UP6
2.9 SEM
UHP 处理对SPI 微观结构的影响如图7 所示。在300 倍放大条件下,未处理的SPI 呈现出不规则的大块状聚集结构,颗粒尺寸分布较宽,表面形态较为疏松,表现出明显的团聚特征。 经200 MPa 超高压处理后,蛋白聚集体发生初步解离,原有的大尺寸聚集体被破碎为相对较小的颗粒,但体系中仍可观察到部分聚集结构。 当处理压力升高至400 MPa 时,蛋白颗粒进一步解聚,整体结构趋于均一,聚集体尺寸明显减小。 在2 000 倍放大条件下可观察到,该处理组颗粒尺度较小,分布相对均匀,表面结构较为粗糙,表明超高压诱导蛋白发生了显著的结构重排。 相比之下,600 MPa 处理后蛋白样品的微观形态再次发生变化。在低倍视野下可见较大尺度的块状结构重新出现,而在高倍放大条件下,颗粒之间紧密结合,形成结构致密的聚集体。 这表明过高压力可能促使已解聚的蛋白分子发生重聚集,从而形成更为紧密的三维结构。这与接受UHP 处理的大豆分离蛋白变化相似[6]。 上述微观形态变化与粒径分布结果相一致,进一步表明超高压处理通过调控蛋白的解聚与重聚行为,显著影响SPI 的微观结构特征。
图7 未处理的SPI 和超高压改性的UP2、UP4 和UP6 的SEM 图像
Fig.7 SEM images of untreated SPI and UHP treated UP2, UP4, and UP6
2.10 溶解性
蛋白质的溶解度主要受分子大小、表面电荷分布(如游离氨基与羧基)及疏水性氨基酸含量等因素影响,这些因素共同调控蛋白质的疏水相互作用与水合能力[27]。 如图8 所示,未经处理的SPI 溶解度为50.49%。 经UHP 处理后,样品的溶解度呈现显著变化：UP2 和UP6 溶解度均有所下降,而UP4 显著提高至78.89%。 这一变化与不同压力下蛋白质结构的变化密切相关。 在200 MPa 处理下,适中的高压促使蛋白质分子部分展开,疏水基团暴露,增强了分子间疏水相互作用,从而阻碍了水合过程,导致溶解度降低。 当压力升至400 MPa 时,高压作用引起蛋白质剧烈解离,粒径下降至13.7 nm,分散度与比表面积显著增大,极大促进了水分子与蛋白质表面的接触与结合,因此溶解度明显提升[28]。 而在600 MPa 处理下,蛋白质分子进一步发生结构重组,形成致密且孔隙率低的新型聚集体,这种致密结构限制了水分子的渗透与结合,因而溶解度再度下降。
图8 未处理的SPI 和超高压改性的UP2、UP4 和UP6 的溶解性
Fig.8 Solubility of untreated SPI and UHP treated UP2,UP4, and UP6
2.11 起泡性和起泡稳定性
UHP 处理对SPI 起泡性和起泡稳定性的影响如图9 所示。 与未处理SPI 相比,不同压力处理(UP2、UP4、UP6)均显著提高了蛋白质的起泡性,其中UP2处理样品最高,达到296.67%。 这可能与高压诱导蛋白质部分展开有关,疏水基团暴露,增强了其在气-液界面的吸附能力,粒径的减小也进一步促进了分子向界面的迁移与铺展[29]。 然而,起泡稳定性没有显著性的变化,可能是由于高压引起的蛋白质聚集,降低了界面膜的连续性与机械强度,影响泡沫的稳定性。
图9 未处理的SPI 和超高压改性的UP2、UP4 和UP6 的起泡性和起泡稳定性
Fig.9 Foaming capacity and foaming stability of untreated SPI and UHP treated UP2, UP4, and UP6
2.12 乳化性和乳化稳定性
如图10 所示,UHP 处理显著改善了SPI 的乳化性能。 在超高压200 MPa 和400 MPa 处理下,乳化性逐渐提高,400 MPa 处理样品的乳化性最高,达到41.68 m2/g,但随着超高压压力增加至600 MPa,蛋白乳化性降低。 这主要归因于蛋白质结构的展开与解聚,极大增加了其比表面积与界面吸附效率[30]。在乳化稳定性方面,所有高压处理均延长了乳液的稳定时间,并呈现随压力增加而增强的趋势,其中600 MPa处理样品的乳化稳定性指数最高,为11.73 min。 结合微观结构分析,600 MPa 诱导蛋白质形成了结构致密、排列规整的聚集体,有助于在油水界面形成机械强度更高、空间阻隔更强的界面膜,从而显著提升乳液的长期稳定性。
图10 未处理的SPI 和超高压改性的UP2、UP4 和UP6 的乳化性和乳化稳定性
Fig.10 Emulsify ability and emulsify stability of untreated SPI and UHP treated UP2, UP4, and UP6
注：不同大写字母表示差异显著(P ＜0.05)(下同)。
2.13 相关性分析
为进一步探究蛋白各指标之间的关系,对其结构与功能参数进行了相关性分析(图11)。 结果表明,不同结构参数之间存在显著相关性,说明蛋白构象变化具有协同性。 粒径与表面疏水性及游离巯基含量呈正相关,并与α-螺旋含量呈显著正相关(r =0.986,P ＜0.05),而与二硫键、β-转角及无规卷曲含量呈显著负相关,表明蛋白分子聚集状态与其二级结构组成密切相关。 表面疏水性与游离巯基含量和β-折叠含量呈显著正相关(r =0.96、0.97,P ＜0.05),而与二硫键含量呈极显著负相关(r= -0.99,P ＜0.01),说明分子内约束的减弱有利于蛋白结构展开及疏水基团暴露。 在功能特性方面,起泡性与乳化性呈正相关(r =0.87),但溶解度、起泡性及乳化性等功能指标与多数静态结构参数未表现出显著线性相关。 结合内源荧光结果可知,蛋白在溶液及界面环境中发生的构象展开和疏水微环境变化更直接影响其界面吸附与重排行为,因此蛋白功能特性是超高压诱导下构象变化、疏水基团暴露及分子间相互作用协同调控的结果。
图11 不同超高压下SPI 结构和功能特性的相关性分析
Fig.11 Correlation analysis between structure and functional properties of SPI under different UHP treatment
3 结论与讨论
本研究系统考察了UHP 处理对SPI 结构特征及功能特性的影响,阐明了压力水平与蛋白结构-功能变化之间的内在关联。 结果表明,UHP 处理能够在不破坏蛋白主链结构的前提下,通过调控非共价相互作用显著改变SPI 的聚集状态与构象特征,从而实现功能特性的定向改善。 在不同压力条件中,400 MPa表现出最优的改性效果。 该条件下,蛋白平均粒径由639.4 nm 显著降低至13.7 nm,分散性与溶解性能明显增强,溶解度提高至78.89%。 结构分析表明,适度超高压促使蛋白分子发生解聚与构象重排,α-螺旋含量显著下降,无规卷曲含量增加,蛋白结构趋于松散与柔性化,为其在油水界面上的快速吸附与重排提供了有利的结构基础。 相应地,蛋白乳化性显著提升,在400 MPa 处理下达到41.68 m2/g。 相关性分析进一步表明,SPI 的粒径、二级结构含量及表面疏水性等结构指标与其溶解性、起泡性和乳化性等功能特性之间存在一定关联,说明蛋白功能表现并非由单一结构因素决定,而是多种构象变化与分子间相互作用协同调控的结果。 尽管本研究系统揭示了超高压诱导SPI 结构重排及其与功能改善之间的关联,但对部分关键结构参数变化的应用指向仍有待进一步深入解析。 未来研究可围绕超高压处理后蛋白表面特性与界面行为的变化,结合接触角、界面流变等表征手段,进一步阐明其在油-水界面吸附与界面结构构建中的作用机制,为超高压调控植物蛋白界面性能及其功能化利用提供理论支持。 本研究为美藤果蛋白资源的高值化利用提供了理论依据和技术参考,也为其在植物蛋白配料、乳化体系及功能性食品中的应用拓展奠定了基础。
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