露酒是我国古老的传统酒种,最早被记载的露酒“鬯”出现于距今约3 000 多年前的殷商时期。 根据GB/T 27588—2011《露酒》,露酒的最新定义为“以黄酒、白酒为酒基,加入药食同源或特定食品原辅料,经浸提和(或)复蒸馏等工艺或直接加入从原料中提取的特定成分制成的饮料酒”[1]。 露酒因具备健康属性,在当今消费者健康意识不断增强的背景下,市场规模实现显著增长,预计到2030 年将达2 000 亿元。露酒的吸引力不仅源于其生物活性功效,其独特的风味特征也能够满足不同消费人群的偏好需求[2]。 风味是衡量露酒感官品质的重要指标之一,也是直接影响消费者购买决策的关键因素。 目前,露酒风味检测主要采用气相色谱技术和质谱技术,配合液液萃取法(liquid-liquid extraction,LLE)、顶空吸附法(headspace adsorption,HSA)、顶空固相微萃取法(headspace solid phase microextraction,HS-SPME)、搅拌棒吸附萃取法(stir bar sorptive extraction,SBSE)以及溶剂辅助风味萃取法(solvent-assisted flavor evaporation,SAFE)等前处理方法使用[3]。 这些方法不仅为露酒风味化学研究提供了关键技术支撑,也为研究外源添加物如何调控露酒香气特征提供了方法学基础[4]。此外,非挥发性物质在酒精饮料风味感知中同样发挥着重要作用[5]。 研究表明,低浓度添加阿拉伯半乳聚糖和果胶等多糖可增强葡萄酒中12 种挥发性有机化合物(volatile organic compounds,VOCs)的挥发性;葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖和乳糖等糖类物质会影响乙醇水溶液中醛类、乙酯类及柠檬烯的气液分配系数,当这些单糖和双糖的添加量从0 增至30%时,上述挥发性化合物在气相中的分配比例随之增加[6-7]。
铁皮石斛作为名贵中药材,其活性成分主要包括生物碱、黄酮及多糖类物质。 其中铁皮石斛干燥茎中多糖含量占其干重的20% ～50%,且为O-乙酰葡甘露聚糖,具有免疫调节等多种生物活性[8-9]。 2023 年,国家卫健委正式批准铁皮石斛为“三新食品”,这为其在食品领域的应用开辟了新空间[10]。 在此背景下,石斛露酒应运而生,既满足了消费者对健康饮品的需求,也为传统露酒创新提供了新方向。 目前市场上的铁皮石斛酒,大多以石斛茎作为原料,经冷浸工艺获得。 该方式存在原料利用率低、工艺不稳定及不可控等问题。以石斛多糖为原料的露酒,解决了上述问题,但是不可避免地对基酒原有风味产生影响,其对白酒中挥发性风味化合物的影响不明确,也未对其互作机制进行研究,制约了石斛露酒的风味精准调控与品质优化。
基于此,本研究旨在系统探究以下问题：a)铁皮石斛多糖DOP2 的纯化及结构表征;b)DOP2 添加对酱酒感官属性的影响;c)DOP2 添加对酱香型白酒VOCs 组成及释放行为的影响;d)DOP2 与VOCs 间的相互作用机制,重点考察其对关键化合物气-液分配系数和嗅觉阈值的影响。 以期为石斛多糖在酱香型白酒及健康型露酒风味定向调控中的应用提供理论依据与机制支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
本实验所用石斛根茎粉末来自北京同仁堂,酱酒酒基样品来自中鉴酒业基团。
标准品：右旋糖苷T-2000、T-300、T-150、T-10 和T-5,岩藻糖、氨基半乳糖、阿拉伯糖、氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖,无锡中国食品药品鉴定研究院;葡聚糖凝胶G-25,北京索莱宝科技有限公司;己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丙酸乙酯、异戊醛、正丙醇、油酸乙酯、棕榈酸乙酯、异戊醇、叔无醇、乙酸戊酯、2-甲基己酸,阿拉丁试剂(上海有限公司)。
1.2 仪器与设备
BSZ-100 自动部分收集器,中国上海嘉鹏科技有限公司;Agilent 6890A-5977B 气相色谱质谱联用仪、BPX70 色谱柱(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm)、DB-Wax UI 色谱柱(30 m ×0.25 mm ×0.50 μm),Agilent 8890气相色谱仪,美国Agilent 科技有限公司;NEXUS 衰减全反射傅里叶红外光谱仪(attenuated total reflectance-Fourier transform infrared spectroscopy,ATR-FTIR),美国NEUXS 仪器公司;Waters 1525EF 高效凝胶过滤色谱(high-performance gel filtration chromatography,HPGFC)、UltahydrogeTM Linear column (300 mm ×7.8 mm i. d.)色谱柱,美国Waters 公司;DIONEX ICS-5000 + SP-5 高压阴离子交换色谱(high-performance anion-exchange chromatography, HPAEC)、 CarboPac PA20 阴离子交换色谱柱(3 mm ×150 mm),美国赛默飞公司。
1.3 实验方法
1.3.1 铁皮石斛多糖样品制备
提取：取石斛干燥茎粉末60 g,用75%(体积分数)酸性乙醇水解4 h,加3 000 mL 水于80 ℃浸提4 h,得2 000 mL 多糖水提液。 取1 000 mL,经50%(体积分数) 乙醇醇沉、离心5 min 沉淀为粗多糖DOC1,离心上清液用旋转蒸发仪浓缩至200 mL,再经65%(体积分数)乙醇醇沉、离心5 min 收集沉淀得粗多糖DOC2。
纯化：DOC2 复溶,经活性炭脱色、 -80 ℃反复冻融除蛋白,稀释至2 mg/mL 用G-25 层析柱洗脱,纯水作洗脱液,恒流泵控制流速0. 18 mL/min,分布自动收集器每10 min 收集一管,共收集40 管,并冻干,得到DOP2 样品。 由于DOC1 用50% 乙醇沉淀其产物在酱酒中不溶解,因此后续实验均采用DOP2。
1.3.2 分子质量分析
将DOP2 固体样品配制成5 mg/mL 的多糖溶液,随后进样10 μL 至HPGFC 配备Waters2410 示差折光检测器和Empower 工作站,色谱柱为Ultahydroge TMLinear,流动相0.1 g/L 硝酸钠,流速为0.5 mL/min,柱温40 ℃。
1.3.3 化学成分分析
总糖和还原糖的含量分别采用苯酚-硫酸法和3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)法测定,以D-葡萄糖做标曲计算总糖和还原糖浓度[11]。蛋白质含量通过考马斯亮蓝法进行检测[12]。
1.3.4 单糖组成分析
本实验单糖组成分析方法基于Sun 等[13]报道的方法用三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)对DOP2进行彻底水解。 之后取2. 5 μL 样品注入配备Carbopac PA20 交换柱的高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection, HPAEC-PAD),柱温恒定于30 ℃,采用梯度洗脱法进行分析,其中流动相A 为水,流动相B 为1 mol/L 醋酸钠,流动相D 为250 mmol/L 氢氧化钠,流速为0.5 mL/min。
1.3.5 ATR-FTIR 分析
取微量DOP2 固体直接放置于ART-FTIR 的反射板上,调整波数在中红外区(4 000 ～400 cm-1)对固体样品进行扫描。
1.3.6 甲基化分析
甲基化分析采用经典的Needs[14]法,DOP2 经过酸解、甲基化、乙酰化以及甲基化之后会生成部分甲基化醛糖醇乙酸酯(partially methylated alditol acetates,PMAAs),之后利用GC-MS 上机检测。 分析仪器为安捷伦公司的6890A-5977B 气质联用仪,色谱柱BPX70。 进样量为1 μL,分流比10 ∶1,载气为高纯氦气,流速1. 5 mL/min;柱箱初始温度140 ℃保持2.0 min,以3 ℃/min 升温至230 ℃,保持3 min。 质谱条件,采用电子轰击离子源,在全扫描模式下进行检测,质量扫描范围(m/z)：50 ～350,扫描速率0.2 s。
1.3.7 多糖对酱酒风味影响
1.3.7.1 石斛露酒样品的制备
DOP2 用超纯水配制成10 mg/mL 的母液,随后按照低(100 mg/L)、中(400 mg/L)、高(800 mg/L)3 个质量浓度梯度加入到酱酒酒基(J)中,样品总体系均为50 mL,静置2 个月稳定样品体系,酒样分别命名为J、DOP2-100、DOP2-400、DOP2-800,用于后续感官特征定量描述分析、气相色谱-火焰离子化检测法(gas chromatography-flame ionization detection,GCFID)分析、静态顶空固相微萃取(static headspace solid-phase microextraction,S-HS-SPME-GC/MS)分析、液液微萃取-GC/MS (liquid-liquid microextraction-GC/MS,LLME-GC/MS)定量分析。
1.3.7.2 感官特征的定量描述分析
本研究感官分析涉及伦理,由江南大学伦理委员会批准(参考号：JNU202509RB029),并在参与研究前获得每位受试者的知情同意。
参考GB/T 33405—2016《白酒感官品评术语》及4 种样品香气特征,确定感官评估描述词酱香、花果香、烘焙香、青香、酸香、蜜香。 本研究中所有受过培训的志愿者共8 名,均熟悉与这些描述相符的感觉特征。 香气强度得分参考九点标度法,强度范围为0 ～9：0 无强度,9 代表香气强度强烈。 感官评估采用明评的形式进行,事先告知品评人员加入多糖的类型与质量浓度,统计8 名感官品评人员对上述6 种感官属性的打分并计算平均值[15]。
1.3.7.3 S-HS-SPME-GC/MS 探究多糖对酱酒酒基中VOCs 挥发性的影响
参考刘青茹等[16]的方法,利用S-HS-SPME-GC/MS对4 种酒样气相中的VOCs 顶空浓度进行量化,以精确评估多糖是否对挥发性化合物的挥发性有影响。取1 mL 酒样置于20 mL 顶空气相瓶中,24 ℃静置12 h 后顶空进样GC/MS,每种酒样4 个平行。 GC 条件与质谱条件与上述研究保持一致。
1.3.7.4 利用LLME-GC/MS 对VOCs 定量及气味活性值(odor activity value,OAV)的计算
取4 mL 酒样和14 mL 的饱和氯化钠溶液于30 mL玻璃瓶中,分别加入叔戊醇(8. 036 g/L)、乙酸戊酯(1.096 g/L)和2-甲基己酸(1.490 g/L)3 个内标各10 μL,添加2 mL 的萃取剂[V(无水乙醚)∶V(戊烷) =1∶1],充分振荡60 s,静置分层后吸取上层有机相移入离心管(2 mL),氮吹至250 μL 后移入2 mL玻璃瓶(带内衬管)中,密封静置。 GC 条件：色谱柱、升温程序以及质谱条件同1.3.7.3 节。
1.3.8 多糖对酱酒风味影响机理研究
1.3.8.1 乙酸乙酯和己酸乙酯分配系数计算
将乙酸乙酯和己酸乙酯按照LLME-SPME-GC/MS中定量结果,用53%(体积分数)乙醇溶液配成简单体系溶液作为空白对照,实验组样品在空白体系中分别加入低(100 mg/L)、中(400 mg/L)、高(800 mg/L)质量浓度的DOP2。 通过向20. 7 mL 顶空气相瓶中加入不同体积的混合溶液(0.07、0.1、0.2、1.9 mL),获得不同气液相比(β)的体系,对应气液相比分别为294.71、206.00、102.50、9. 89。 采用GC-FID 考察了不同质量浓度DOP2 对2 种酯类气相分配系数的影响,气相色谱条件与S-SH-SPME-GC-MS 保持一致。样品在(20 ±2) ℃下平衡至少12 h 后进样,每组设置3 份平行样品。 每份样品均进行3 次重复检测,分配系数按照公式(1)计算：
式中：A,气相检测峰面积;β,气液相比,Vgas/Vliq;C0,样品瓶中液相挥发性化合物的初始浓度;Kg/m,气液两相分配系数; fi,校正因子。
当达到气液平衡时,液相中VOCs 初始浓度C0与色谱峰面积所代表的顶空浓度A 呈正比,气液相比β与顶空浓度A 的倒数呈现线性关系。 可以推导Kg/m为直线的斜率/截距,加入DOP2 之后气液分配系数增加,代表达到气液平衡时气相中VOCs 浓度较高,DOP2 促进VOCs 挥发[16-17]。
1.3.8.2 异戊醛阈值测定
低浓度异戊醛阈值的确定遵循了Zhao 等[18]采用的方法学。 配制溶液时参考范文来等[19]在46%(体积分数)乙醇中测得阈值0.017 mg/L。 异戊醛被添加至53%(体积分数)乙醇-水溶液中,浓度分别为阈值浓度的33、32、31、30、3-1、3-2、3-3、3-4,每个浓度组包含3 个对照样本,其中2 个样本为53% 乙醇。采用三点检验法(3-AFC)强制选出添加了异戊醛的样品。 将10 mL 模拟溶液置于棕色玻璃瓶中,标记3位随机编号,在通风良好且控温(25 ℃)的房间内进行评估。 所有实验均由8 位评审小组成员测评;每位成员均经过培训且熟悉异戊醛的气味特征。 浓度-反应函数被确定为心理测量函数。 检测阈值由S 形曲线确定,具体见公式(2)：
式中：P,校正概率,由感官实验正确概率p 经(3p-1)/2校正;X,异戊醛浓度取对数,μg/L;C,P 为0.5 时异戊醛浓度[嗅觉阈值(odor threshold,OT)],μg /L;D,异戊醛特有参数描述函数陡峭程度。
2 结果与分析
2.1 铁皮石斛多糖纯度鉴定及分子质量测定
将DOP2 固体样品配制成10 mg/mL 的溶液,通过苯酚-硫酸法、DNS 法以及考马斯亮蓝法对其总糖、还原糖、蛋白含量进行检测。 图1-a 结果显示,DOP2中总糖、还原糖和蛋白质含量分别为(93. 326 ±2.264)%、(0.498 ±0.003)%、(0.027 ±0.05)%,其总糖含量大于90%,含有极少量的蛋白杂质,证明纯化过后的DOP2 纯度较高。 HPGFC 结果显示(图1-b),DOP2 峰位分子质量(Mp)为47 452 Da,平均分子量(Mw)为84 kDa,所得峰形较窄且单一对称。 总结,DOP2 纯度较高且组分均一。
图1 DOP2 的纯度鉴定及分子质量测定
Fig.1 Purity determination and molecular weight measurement of DOP2
2.2 DOP2 结构表征
多糖的单糖组成分析是其结构解析的关键环节。 本实验用TFA 对DOP2 彻底水解,水解产物采用HPAECPAD 法进行单糖组成分析。 实验以8 种单糖标准品(质量浓度均为41.7 mg/L)作为对照,其色谱分离结果如图2-a 所示。 通过与标准品保留时间比对,确定DOP2 由葡萄糖(F)和甘露糖(G)组成(图2-b)。 基于峰面积响应值进行定量分析,DOP2 水解液中葡萄糖和甘露糖的摩尔浓度分别为0.63 mmol/L 和3.30 mmol/L,由此计算得甘露糖与葡萄糖摩尔比为5.24∶1。
图2 DOP2 结构表征
Fig.2 Structural characterization of DOP2
DOP2 的红外光谱如图2-c 所示。 在3 361 cm-1处出现宽吸收带归属于O—H 伸缩振动,此为多糖类化合物的典型光谱特征之一[20]。 在1 200 ～1 000 cm-1范围内的强吸收峰对应碳水化合物的“指纹区”,提示DOP2 存在丰富的C—O 及C—O—C 官能团,为糖苷键的特征吸收。 此外,在1 728、1 371、1 240 cm-1处的特征吸收峰分别对应羰基(C ==O)伸缩振动、甲基C—H弯曲振动以及C—O 伸缩振动[21],提示其主链中存在O-乙酰基(—OCOCH3)取代。 807、871 cm-1处的吸收峰则表明DOP2 结构中含有α 构型的甘露糖残基[22]。
甲基化分析是确定多糖糖苷键连接类型的经典方法。 DOP2 经部分酸水解、甲基化、氘代还原及乙酰化处理后,糖残基被衍生化为PMAAs。 图2-d 为DOP2 衍生化产物的总离子流色谱图;表1 汇总了全扫描模式下电子轰击电离质谱中部分PMAAs 的特征离子质荷比。 通过将实验获得的电子轰击电离谱图与CRCC PMAA 数据库 (https：/ /glygen. ccrc. uga.edu/ccrc/specdb/ms/pmaa/pframe. html) 进行比对,确定了DOP2 的糖残基类型和糖苷键连接方式：DOP2 主链是由1,4-连接的甘露糖残基和1,4-连接的葡萄糖残基构成,并含有1,6-连接的甘露糖残基作为分支点,末端残基为葡萄糖或者甘露糖。 此外,表1 给出了总离子流中各糖残基对应色谱峰的相对峰面积比例,据此估算甘露糖与葡萄糖的相对摩尔比约为4.2∶1。 该结果与单糖组成分析结果基本吻合,证明2 种分析方法具有良好的一致性。
表1 DOP2 甲基化分析结果
Table 1 Methylation analysis results of DOP2
序号PMAAs糖苷键连接保留时间/min糖残基比例(DOP2)/%质荷比(m/z)A1,5-二-O-乙酰基-1-氘代-2,3,4,6-四-O-甲基-D-葡萄糖醇T-葡萄糖13.8734.025 971,87,102,118,129,145,162,175,205 B1,5-二-O-乙酰基-1-氘代-2,3,4,6-四-O-甲基-D-甘露醇T-甘露糖13.941.1859,71,87,102,113,129,145,157,162,174,189,205 C1,4,5-三-O-乙酰基-1-氘代-2,3,6-三-O-甲基-D-葡萄糖醇1,4-甘露糖16.8775.6859,71,87,102,118,129,143,162,173,189,203,233.277 D1,4,5-三-O-乙酰基-1-氘代-2,3,6-二-O-甲基-D-甘露醇1,4-葡萄糖17.30818.0459,71,87,99,102,118,129,142,162,159,173,187,203 E1,4,5,6-四-O-乙酰基-1-氘代-2,3-二-O-甲基-D-甘露醇1,4,6-甘露糖20.491.0959,74,85,102,118,127,142,162,171,187,201,231,261
注释：T-葡萄糖表示末端吡喃葡萄糖;1,4-甘露糖表示1,4-连接的吡喃甘露糖。
2.3 DOP2 对酱酒风味的影响
2.3.1 不同用量DOP2 对酱酒酒基感官定量描述的影响
本实验重点研究了加入低、中、高3 种不同质量浓度DOP2 之后对酱酒酒基香气的影响,采用感官定量描述分析评估了酱香、酸香、青香、蜜香、烘焙香和花果香这6 种香气属性的变化。
图3结果显示,DOP2 对酱酒酒基香气轮廓具有复杂的剂量依赖性影响。 在低、中质量浓度下,DOP2能够增强其蜜香和花果香,同时减少酸味。 然而,在高质量浓度下,这种作用发生了逆转,DOP2 抑制了令人愉悦的香气,反而增强了酸味特征。 在所有质量浓度下,DOP2 均持续降低了酱香和烘焙香,同时增强了青香。
图3 不同用量DOP2 下酱酒酒基的感官描述雷达图
Fig.3 Radar plot of sensory descriptors for sauce-flavor Baijiu base liquor with different DOP2 dosages
2.3.2 不同用量DOP2 对酱酒酒基VOCs 顶空浓度的影响
S-HS-SPME-GC/MS 是挥发性成分分析的常用技术,其原理基于VOCs 在样品基质、顶空气相与萃取纤维涂层三相之间的分配平衡[16]。 本研究采用该技术,定量分析酱酒酒基(J)及其添加不同质量浓度DOP2 后顶空中VOCs 的浓度变化。 该方法共鉴定出35 种VOCs,结果如图4-a 显示,包括24 种酯类、7 种醇类、3 种醛类和1 种吡嗪类化合物。 基于FEMA、FlavorDB2 和Chemical Book 等权威风味数据库,将这些化合物分为花果香型(17 种)、蜜香型(4 种)、烘焙香型(3 种)和其他类型(11 种)。 添加低质量浓度DOP2 时,酱酒酒基中大多数花果香类化合物(如乙酸乙酯和丁酸乙酯等)的顶空浓度(GC 响应值)显著增加,并随DOP2 质量浓度的增加而显著降低;烘焙香类物质(如异戊醛和2,3,5-三甲基吡嗪)在3 种DOP2 质量浓度下均呈显著下降趋势,且随质量浓度增加降幅更为显著。
图4 不同用量DOP2 下酱酒酒基的VOCs 顶空浓度分析结果图
Fig.4 Headspace concentration of VOCs in sauce-flavor Baijiu base liquor with different DOP2 dosages
注：变量重要性投影(variable importance in projection,VIP)。
对35 种VOCs 的顶空浓度进行无监督主成分分析(principal component analysis,PCA),结果如图4-b结果所示。 J、DOP2-100、DOP2-400、DOP2-800 四种酒样各自形成独立聚类,表明不同质量浓度DOP2的添加会对酱酒酒基VOCs 组成产生不同影响。 进一步建立偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)模型,参数为R2X=0.951,R2Y =0.984,Q2 =0.948,其中R2 Y 和Q2 Y 接近1,提示模型具有可靠的样本区分能力与结果预测能力。图4-c 为该模型得分图,4 种酒样亦呈现独立聚类,与PCA 分析结果一致。 采用200 次置换检验对模型进行验证,随机抽取5 种VOCs 的结果如图4-d 所示,回归线Q2的截距为-0.507( ＜0)表明模型不存在过拟合。 基于PLS-DA 计算35 种VOCs 的VIP 值,如图4-e所示。 通常VIP 值＞1 的变量被认为对模型的判别有显著贡献,是导致组间差异的关键差异化合物或潜在标志物。 本实验筛选出VIP 值＞1 的VOCs 包括棕榈酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、正丙醇、丙酸乙酯、己酸乙酯、异戊醛、异戊醇、油酸乙酯。
2.3.3 九种关键VOCs 的含量及OAV
采用LLME-GC/MS 对酱酒酒基中的上述9 种物质进行定量分析,并计算其OAV,以量化其对酱酒香气的贡献度,结果如表2 所示。 其中,对花果香贡献最大的2 种酯类为己酸乙酯和乙酸乙酯,异戊醛对烘焙香贡献显著。 鉴于前二者在酱酒酒基中的含量较高,选择对其进行后续的分配系数测定实验,以探究DOP2 对其挥发行为的影响机制;后者在酒样中浓度较低,按该浓度配制53%乙醇溶液后进行顶空进样-气相色谱分析时误差较大;文献报道其在46% 乙醇中人体嗅觉阈值为0.017 mg/L,故采用S 形曲线法测定DOP2 添加前后该阈值的变化,探究多糖对其挥发行为的影响机制。
表2 九种关键VOCs 定量结果及OAV
Table 2 Quantification and OAV of nine key VOCs
CAS 号VOCs香气类型 阈值/(mg/L)定量/(mg/L)OAV标准曲线R2内标123-66-0 己酸乙酯花果香0.05512.01 ±3.89218.28y =98.8354x +0.001 30.995戊酸乙酯141-78-6 乙酸乙酯花果香32.55162047.83 ±38.3762.91y =61.668 0x +0.038 30.991戊酸乙酯97-64-3 乳酸乙酯花果香1281 317.14 ±79.9210.29y =57.839 0x -0.043 10.999 7 戊酸乙酯105-37-3 丙酸乙酯花果香19.01949.78 ±6.182.62y =2.412 9x +0.311 20.999 1 戊酸乙酯590-86-3 异戊醛烘焙香0.0173.17 ±0.23186.22y=0.623 6x+5.537 9E-60.999 4 2-甲基己酸71-23-8 正丙醇其他0.231 057.07 ±93.954 595.97y =79.906 7x -0.069 40.996 5 叔戊醇111-62-6 油酸乙酯其他0.8720.32 ±0.5123.36y =0.082 2x +0.014 60.984 1 2-甲基己酸628-97-7 棕榈酸乙酯其他1453.18 ±2.273.80y =0.425 4x +0.073 90.987 8 2-甲基己酸123-51-3 异戊醇其他179204.33 ±0.181.14y =95.915 9x -0.023 60.996 5 叔戊醇
2.3.4 DOP2 对乙酸乙酯与己酸乙酯的气-液分配系数的影响
本研究构建了一个简化的模拟体系：对照组为53%乙醇-水溶液,分别添加乙酸乙酯或己酸乙酯,二者浓度均与基酒中的实测浓度一致。 实验组则在此基础上分别添加低、中、高3 种质量浓度的DOP2,以考察不同质量浓度DOP2 对乙酸乙酯和己酸乙酯分配系数(Kg/m)的影响。 表3 为添加不同质量浓度的DOP2 后,乙酸乙酯和己酸乙酯在不同气-液相比(β)下的气相色谱峰面积变化。 通过对峰面积倒数与β进行线性回归,依据斜率与截距的比值计算Kg/m 结果显示,加入DOP2 后乙酸乙酯和己酸乙酯的Kg/m 均增大,且随DOP2 添加质量浓度的增加而降低。 该结果与2.3.2 节结果一致,均表明低质量浓度DOP2 可显著促进乙酸乙酯和己酸乙酯的挥发,且该促进作用随DOP2 质量浓度的增加而减弱。
表3 气相色谱峰面积与气-液分配系数(Kg/m)
Table 3 Gas-phase peak areas and gas-liquid partition coefficients (Kg/m)
样品294.71206.00102.509.89baKg/mR2乙酸乙酯257.06 ±25.80315.47 ±4.88426.68 ±21.50663.73 ±18.07 8.74 ×10 -6 1.42 ×10 -3162.830.97乙酸乙酯+DOP2-100410.07 ±13.57497.25 ±24.06637.20 ±13.98860.15 ±38.55 4.46 ×10 -6 1.11 ×10 -3249.840.99乙酸乙酯+DOP2-400391.50 ±7.80486.23 ±11.12633.00 ±12.02818.88 ±83.55 4.65 ×10 -6 1.14 ×10 -3246.170.98乙酸乙酯+DOP2-800344.00 ±28.80438.34 ±6.14546.52 ±12.71757.26 ±12.18 5.47 ×10 -6 1.25 ×10 -3228.640.96己酸乙酯76.66 ±2.5285.66 ±1.5591.73 ±0.80103.30 ±2.041.13 ×10 -5 9.59 ×10 -3847.370.95己酸乙酯+DOP2-10070.85 ±1.0076.88 ±1.4782.33 ±1.1685.62 ±0.588.52 ×10 -6 1.14 ×10 -2 13 42.710.94己酸乙酯+DOP2-40082.48 ±0.2187.40 ±0.8590.96 ±1.78101.44 ±1.327.65 ×10 -6 9.93 ×10 -3 1 298.120.94己酸乙酯+DOP2-80073.93 ±0.6683.49 ±0.8790.40 ±0.6994.27 ±0.251.01 ×10 -5 1.03 ×10 -2 1 018.810.93
注释：294.71、206.00、102.50、9.89 为气液相比β;b 为公式(1)的截距;a 为公式(1)的斜率;R2 为公式(1)的线性拟合度。
2.3.4 DOP2 对异戊醛嗅觉阈值的影响
通过测定添加低质量浓度(DOP2-100)和高质量浓度(DOP2-800)DOP2 后异戊醛嗅觉阈的变化,评估DOP2 对其挥发性的影响。 图5 为异戊醛及其与DOP2混合体系的S 形剂量-效应拟合曲线,拟合方程式分别为：异戊醛单独存在时,P =
,R2=0.98;异戊醛+DOP2-100 组,P =
,R2=0. 97;异戊醛+ DOP2-800 组,P =
R2 =0.98。 代入公式求得,添加低质量浓度DOP2 后异戊醛阈值从20 μg/L 增至40.0 μg/L;添加高浓度DOP2 后阈值进一步增至49 μg/L。 DOP2 的添加对异戊醛香气感知具有掩蔽效应,该结果与顶空分析(2.3.2 节)和感官评价结果(2.3.1 节)相互呼应。
图5 DOP2 对异戊醛嗅觉阈值的影响
Fig.5 Effect of DOP2 on the olfactory threshold of isovaleraldehyde
3 结论与讨论
本研究从铁皮石斛中分离纯化获得高纯度多糖DOP2(纯度＞90%),结构解析表明其为O-乙酰葡甘露聚糖,甘露糖与葡萄糖摩尔比为5.24∶1,主链由1,4-糖苷键连接并含1,6-分支结构,平均分子质量(Mw)为84 kDa。 香气影响研究表明,DOP2 对酱酒酒基中挥发性风味化合物的释放具有剂量依赖性双向调控效应：低质量浓度(100 mg/L)显著促进花果香类物质挥发并抑制烘焙香类物质挥发;随质量浓度升高,花果香的促进作用减弱,而烘焙香的抑制作用进一步增强。
已有研究表明,苦瓜多糖可降低辛酸乙酯的挥发性,从而降低苦瓜露酒的甜腻感[2];低质量浓度阿拉伯聚糖和低浓度果胶糖可促进酯类挥发,而随多糖质量浓度增加该效应逐渐减弱[6]。 相关机制研究表明,多糖与挥发性化合物之间的相互作用通常涉及3条途径：a)宏观物理变化,根据斯托克斯-爱因斯坦方程,小分子物质在液相中的扩散系数与基质黏度成反比,多糖的加入可能增加酒体黏度,从而提高小分子扩散的能垒;b)多糖与挥发性化合物之间存在特定分子间相互作用,包括氢键、疏水效应和包埋效应;c)多糖可能改变酒精饮料的亲疏水性[23]。 本研究中,低质量浓度DOP2 显著增加了己酸乙酯和乙酸乙酯的气-液分配系数,这很可能归因于DOP2 增强了酒液的亲水性。 根据相似相溶原理,亲水性提升会降低疏水性较强的短链酯在酱香型基酒中的溶解度,从而促使其更倾向于释放至气相中。 而DOP2 对异戊醛(烘焙香的关键贡献物质)的掩蔽效应,则可能源于两方面：一是酒体黏度增加,限制了异戊醛的扩散与释放;二是DOP2 与异戊醛之间存在特定的分子间相互作用(如氢键或疏水结合)。 值得注意的是,随着DOP2 质量浓度升高,其对花果香的促进作用减弱而对烘焙香的抑制作用增强,提示高质量浓度下黏度效应或分子间相互作用可能占据主导,从而改变了低质量浓度下由亲水性调控为主的模式。 综上,本研究首次揭示了石斛多糖在酱酒风味体系中对花果香的“低促高抑”双向调控,以及对烘焙香的单边抑制机制,为其在健康型露酒风味定向设计与品质调控中的应用提供了理论依据。
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