黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)是由黄曲霉和寄生曲霉代谢产生的次级代谢产物,主要污染玉米、花生、坚果等农作物及其制品[1-3]。 AFB1 主要危害包括肝脏损伤、免疫抑制以及引发肝癌等多种疾病,具有致畸性、致癌性和致突变性,被世界卫生组织列为一级致癌物[4-6]。 我国现行的GB 2761—2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》规定,玉米中AFB1的限量标准为20 μg/kg。 因此,开发适用于现场检测AFB1 的快速检测技术,对实现食品安全风险防控和减少健康危害具有直接应用价值。
目前,AFB1的检测的方法主要有薄层色谱法(thin layer chromatography, TLC)[7]、HPLC[8-9]、酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)[10-11]、高效液相色谱-质谱联用法[12-13] 和荧光分光光度法[14-15]。 这些方法虽然灵敏度较高,但通常需要复杂的设备和专业的操作人员,检测时间长,成本高,难以满足现场快速检测的需求。 免疫层析技术因其操作简便、成本低、检测快速等优点,已成为食品安全检测领域的重要手段之一[16]。 然而,目前免疫层析试纸条(immunochromatographic test strip,ICTS)存在检测灵敏度低、假阳性高等问题,难以满足对微量毒素的高灵敏检测需求[17]。 为了提高检测灵敏度,研究者们引入了多种信号放大技术,如使用链霉亲和素和生物素介导的信号放大系统[17]、间接标记抗体[18]、调控抗原与抗体的亲和力[19]、酶催化放大[20]等。 上述策略虽然可以实现信号放大,但制备操作复杂,制备成本较高。 研究发现,通过金属二次生长可实现信号二次放大,提高检测的灵敏度[21]。 Li 等[22]则采用银沉积放大竞争法信号,从而提升检测灵敏度。 虽然这些基于贵金属(如AuNPs)的信号放大策略效果显著,但成本较高,因此仍需开发经济、稳定且高效的替代方法以进一步提高试纸条的灵敏度。
铜沉积技术相较于传统银增强方法,具有沉积效率高、成本低、试剂稳定性好及信噪比高等优势而受到广泛关注。 与银沉积技术相比,铜沉积技术还具有显著的成本与经济性优势,其铜沉积试剂价格远低于银沉积,且反应速度更快,可缩短检测时间;铜沉积产物在空气和光照下更稳定,不易氧化或变色,抗干扰能力更强;同时其靶向沉积性更好,非特异性背景更低,信噪比更高,所用还原剂毒性也更低,操作更安全[23]。 本实验构建了一种基于金纳米棒-铜沉积协同放大的免疫层析试纸条检测玉米中AFB1。 基于铜沉积技术在金纳米棒表面原位还原铜单质,增大信号标签的粒径,从而显著增强试纸条的显色强度。 与传统胶体金法相比,铜沉积金纳米棒法在检测灵敏度、信号放大效果、操作简便性、稳定性和成本控制方面均表现出显著优势。 铜沉积技术不仅增强了信号标签的光学性能,还通过减少探针用量和缩短检测时间,提高了检测效率和经济性。 可有效检测实际样品中的AFB1,为玉米毒素检测提供了一种高灵敏、快速的实用新方法,应用前景良好。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
样品垫、硝酸纤维素膜、金标垫、吸水纸、聚氯乙烯底板,上海捷宁生物科技有限公司;抗坏血酸(ascorbic acid,AA),成都西亚化工股份有限公司;五水合硫酸铜,生工生物工程(上海)股份有限公司;牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、重组链球菌蛋白、AFB1 标准品、赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)标准品、T-2 毒素(T-2 mycotoxin)标准品、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)标准品、玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)标品,上海生工生物技术有限公司;硝酸银、硼氢化钠,天津市风船化学试剂科技有限公司;硝酸银、5-溴水杨酸、三水合四氯金酸,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;AFB1-BSA人工抗原、抗AFB1 单克隆抗体,实验室保存;玉米质控样,国家粮食和物资储备局科学研究院。
1.2 仪器与设备
本实验室自制恒温孵育器;MS-H280-pro 磁力加热搅拌器,上海生工生物技术有限公司;TGL-16M 台式高速冷冻离心机,湖南户康离心机有限公司;EPOCH 酶标仪,美国伯腾仪器有限公司;JH-450 便携式胶体金免疫定量分析仪、XYZ3020 划膜喷金一体机、切条机,上海捷宁生物科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 金纳米棒(Au nanorods,AuNRs)的制备
AuNRs 的合成是基于参考文献[24]并稍作修改,采用晶种法进行如图1-A 所示。 合成过程分为金种子溶液制备与金生长液制备2 个关键步骤。
图1 实验原理图
Fig.1 Schematic diagram of the experimental principle
金种子溶液制备：在50 mL 的烧杯中,加入9.75 mL,0.1 mol/L 的十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethylammonium bromide,CTAB)溶液,随后加入250 μL的0.01 mol/L HAuCl4·3H2O 溶液进行搅拌,随后快速加入600 μL 新鲜制备且处于冰浴状态的0.01 mol/L NaBH4溶液,2 min 剧烈搅拌后将溶液在30 ℃条件下静置2 h。
金生长液的制备：称取0. 912 g CTAB、0. 11 g 5-溴水杨酸,放入经酸处理的锥形瓶,再加入49 mL超纯水,以400 r/min 的转速搅拌使其充分溶解。 依次加入240 μL 0.02 mol/L 的AgNO3、500 μL 0.05 mol/L的HAuCl4·3H2O,最后加入130 μL 0.1 mol/L 的AA,剧烈搅拌30 s。 待金生长液配制完成后,加入80 μL已老化2 h 的金种子溶液,以8 000 r/min 的转速搅拌1 min,随后在30 ℃下静置12 h,再通过离心机10 000 r/min 离心20 min 去除多余的CTAB。 将离心后沉淀用超纯水洗涤2 次,最终用45 mL 超纯水重悬。
1.3.2 金标探针的制备及投入量优化
1.3.2.1 金标探针制备
采用静电吸附法制备金标探针。 取500 μL AuNRs 溶液加入0.5 mg/mL 的anti-AFB1-mAb,37 ℃反应2 h,再加入100 μL 质量分数为10%的BSA 溶液反应30 min,6 000 r/min 离心10 min,去除上清液,用25 μL 重悬液溶解沉淀。
1.3.2.2 试纸条金标探针投入量优化
基于阳性竞争抑制实验探究探针用量对检测性能的影响,金标探针量梯度设置为0. 5、1、1. 5、2、2.5、3、3.5 μL,滴加不含AFB1 标品的空白上样缓冲液,在相同探针梯度条件下,滴加含有5 ng/mL 标品的上样缓冲液作为阳性对照,用免疫层析定量分析仪测量T 线颜色强度和T/C 值,每个实验做3 个平行。计算竞争抑制率如公式(1)所示：
式中：B,不同探针用量下检测线信号强度,B0,空白对照信号强度
1.3.3 免疫层析试纸条的组装
试纸条由吸水纸(宽度2 cm)、硝酸纤维素膜(nitrocellulose membrane,NC 膜)(爬速120 s/4 cm)及结合垫等部件构成,如图1-B 所示,在试纸条的制备过程中,首先对NC 膜进行处理,采用喷涂法将重组链球菌蛋白G(recombinant streptococcus protein G,r-SPG)与AFB1-BSA 固定于NC 膜表面,喷涂速度设置为0.5 μL/cm。 喷涂完成后,将NC 膜置于37 ℃烘箱中进行真空干燥处理,干燥时间为12 h。 结合垫与样品垫的预处理步骤如下：将其浸入处理液中浸泡30 min,随后在37 ℃条件下进行真空干燥,干燥时间同样为12 h。 完成上述预处理后,按照顺序将NC膜、结合垫、样品垫及吸水纸依次组装于聚氯乙烯底板上,各部件之间的重叠宽度控制在1 ～2 mm。 将组装后的试纸条用切条机裁切成3 mm 宽度的标准条带,经密封处理后置于干燥环境保存备用。
1.3.4 检测原理
如图1-C-a 所示,第1 轮免疫反应中,当无AFB1标品时,探针在毛细作用下与T 线AFB1-BSA 结合显色;如图1-C-b 所示,有标品时,探针先与标品结合,随标品浓度增加T 线信号减弱至消失。 如图1-C-c所示T 线信号消失后,将第1 轮免疫反应后的试纸条浸入含CuSO4·5H2 O 的铜沉积液,在AA 还原作用下,Cu2+被还原为Cu1+,随后在AuNRs 表面进一步歧化生成Cu0 并沉积,从而放大信号,通过粒径增大效应显著增强T 线信号强度。 该方法通过优化探针用量与铜沉积工艺,有效提升了试纸条的检测灵敏度。
1.3.5 铜沉积信号放大验证
准备3 组免疫层析试纸条,A 组和B 组添加金标探针、C 组不添加金标探针作为空白对照组。 向3 组试纸条同时滴加50 μL 含5 ng/mL AFB1 标准品的上样缓冲液,室温反应10 min 后,将B、C 两组试纸条进行铜沉积处理,A 组不处理,沉积后用免疫定量分析仪测定T 线与C 线的信号强度,观察显色差异,验证铜沉积的特异性信号放大作用。
1.3.6 铜沉积条件的优化
分别对铜沉积反应温度、反应时间及铜沉积溶液各组分浓度进行优化。 取4 mL 铜沉积溶液放在5 mL离心管里,将完成第1 轮免疫反应的试纸条浸入沉积液,设置不同的铜沉积反应温度(21、37、50、100、130、150 ℃)及不同反应时间(3、5、7、9、11、13 min)进行优化,反应完成后测定未沉积试纸条的T0 值和铜沉积后的T 值,每组实验重复3 次,以增加值为评判标准,确定最佳反应温度和反应时间。 增加值计算方法如公式(2)所示：
式中：T,铜沉积后试纸条T 值;T0,未沉积时试纸条T 值。
随后设置不同浓度的CuSO4·5H2O 溶液(5、25、50、75、100 mol/L)和不同浓度的AA 溶液(0. 05、0.1、0.15、0.2 mol/L)进行优化,在上述最佳温度和时间下进行铜沉积(铜沉积液仅含CuSO4·5H2 O 与AA,无络合剂,按2 mL +2 mL 等体积混合),以铜沉积后试纸条T 值的增长率作为评判标准,每组实验重复3 次,确定最佳铜沉积溶液成分的浓度。 增长率计算方法如公式(3)所示：
式中：Tn,铜沉积后试纸条T 值;Tn -1,前一个条件下铜沉积后试纸条T 值。
1.3.7 ICTS 性能评价
1.3.7.1 AuNRs-ICTS 和Cu-AuNRs-ICTS 灵敏度评价
Au NRs-ICTS 标曲：用上样缓冲液将AFB1 稀释成系列质量浓度梯度(0、0.1、0.5、1、2.5、5、10、12.5、25 ng/mL)取2.5 μL 的探针滴加在金标垫上,吸取上述浓度梯度的标品缓冲液反应10 min,每个梯度设置3 个平行,用免疫定量分析仪测定T 线信号强度,以T/C 值进行定量分析,以AFB1 浓度的对数值为横坐标,以B/B0 ×100%(B 值代表阳性样品的T/C 值,B0值代表阴性样品的T/C 值)为纵坐标建立标准曲线。
Cu-AuNRs-ICTS 标曲：参照AuNRs-ICTS 标曲制备步骤,将AFB1稀释成系列质量浓度梯度(0、0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10 ng/mL),取0.75 μL的探针进行第一步反应,10 min 后将试纸条浸入铜沉积液中进行信号放大反应,反应完成后进行测定。
1.3.7.2 特异性
本实验选取了玉米中常见的其他真菌毒素,包括ZEN、DON、OTA 和T-2 毒素,分别进行交叉反应实验,再添加1 个空白对照,记录试纸条的T/C 值,所有实验设置3 个平行组,数据以平均值表示。
1.3.7.3 加标回收
选取5 g 经高效液相色谱检测阴性的玉米基质,分别添加AFB1 标准溶液使其终质量浓度为0、0. 5、10、50 ng/mL,加入2 倍体积70% (体积分数)甲醇-水溶液涡旋萃取10 min 后,于4 ℃下以10 000 r/min离心20 min,取上清液转移至10 mL 离心管。 将上清液用上样缓冲液稀释10 倍,取50 μL 待测液均匀滴加至试纸条加样区。 反应10 min 后,在优化铜沉积条件下进行信号放大,最终通过试纸条T/C 值定量分析。所有实验设置3 个平行组,数据以平均值表示。
1.3.7.4 稳定性
试纸条的稳定性对于其实际应用至关重要。 本研究将制备好的试纸条分别放置于4、25、37 ℃的环境中贮存7 d,然后对1 倍检出限加标样品(AFB1 加标量为0.7 μg/kg)和阴性样品进行检测。 结果显示,在不同贮存温度下,试纸条对加标样品和阴性样品的检测结果均保持一致,且检测结果准确可靠。 这表明该试纸条在常温(25 ℃)下至少可以稳定保存7 d,具有良好的稳定性,适合在不同环境条件下使用。
1.3.7.5 实际样品
称取5 g AFB1 特性值为10.7 μg/kg 的玉米质控样品,加入10 mL 70%(体积分数)甲醇-水溶液,涡旋振荡10 min 提取。 4 ℃条件下10 000 r/min 离心20 min,收集上清液,测得提取液质量浓度为5. 35 ng/mL。将提取液用上样缓冲液稀释10 倍,取50 μL 滴加至试纸条样品垫,通过层析仪测定T 线信号强度。 每组实验设置3 个平行样本,结果取均值以确保数据可靠性。
1.4 数据处理
所有实验设置3 组平行重复,实验结果以“平均值±标准差”表示。 采用Excel 进行基础统计,通过Origin 2019 进行拟合,并绘图。 原理图采用Power-Point 2019 绘制。 表格采用word 2019 进行绘制。
2 结果与分析
2.1 金纳米棒及金标探针的表征
透射电镜(图2-A)显示AuNRs 粒径大小均一,表明金纳米棒成功合成。 Zeta 电位检测显示(图2-B),未修饰抗体的AuNRs 表面电位为31. 1 mV,而抗体修饰后降至24.1 mV(降低7 mV),证实抗体通过电荷中和作用吸附于材料表面,表明探针制备成功。
图2 材料表征
Fig.2 Material characterization
2.2 金标探针量的优化结果
基于阳性竞争抑制实验探究探针用量对检测性能的影响,以含5 ng/mL AFB1 标准品的上样缓冲液构建反应体系。 如图3 所示,探针用量显著影响检测性能。 当探针投入过少时(0.5 μL),试纸条因显色过弱导致信号误差增大,当探针投入量为1.5 μL 时竞争抑制率达峰值(93.18%),随着探针投入量的增加(1.5 ～3.5 μL),抑制率随剂量增加而下降,综合考虑抑制率与显色清晰度,1.5 μL 被确定为最佳用量,可有效兼顾灵敏度与稳定性。
图3 探针使用体积的优化
Fig.3 Optimization of probe usage volume
2.3 铜沉积信号放大验证结果
如图4 所示,未铜沉积处理试纸条A 的T 线信号极弱,而铜沉积处理后试纸条B 信号显著增强。未滴加探针的试纸条C 经铜沉积后不显色,证实该现象源于探针特异性作用。
图4 铜沉积信号放大原理验证图
Fig.4 Verification diagram of copper deposition signal amplification principle
2.4 铜沉积条件优化
2.4.1 温度优化
如图5-A 所示,铜沉积量随温度升高呈正相关。室温(21 ℃)条件下,10 min 沉积后试纸条条带仅部分被铜单质覆盖,表明低温沉积效率有限;当温度升至37 ℃时,Cu 单质的沉积量较21 ℃时显著增加。总体来看,随着温度的升高,试纸条检测线(T 线)和质控线(C 线)上沉积的Cu 单质逐渐增多。 然而,当沉积温度达到150 ℃时,试纸条发生变形,不利于数据采集。 综合上述结果,最终选择130 ℃作为最优铜沉积温度。
图5 铜沉积参数优化
Fig.5 Optimization of copper deposition parameters
注：○表示最优条件。
2.4.2 时间优化
铜沉积时间对信号强度及背景干扰的影响如图5-B 所示。 实验结果表明,随着沉积时间的延长,铜在AuNRs 表面的沉积量逐渐增加,试纸条检测线(T线)与控制线(C 线)的信号强度呈现显著上升趋势。然而,当沉积时间达到11、13 min 时,试纸条背景信号明显增强,导致检测背景干扰增大。 综合考量试纸条显色清晰度与背景噪声水平,最终确定9 min 为最佳铜沉积时间,该参数可有效平衡信号增益与背景控制。
2.4.3 CuSO4·5H2O 浓度优化
如图5-C 所示,在一定CuSO4·5H2 O 浓度范围内(5 ～75 mmol/L),CuSO4·5H2O 浓度与试纸条T 线信号呈现正相关,但增长速率逐渐减缓;当浓度达到100 mmol/L 时,信号强度出现负增长。 结合显色效果与背景信号分析,50 mmol/L 被确定为最优CuSO4·5H2 O 浓度,该浓度可实现信号强度与检测稳定性的最佳匹配。
2.4.4 AA 浓度优化
AA 浓度直接影响Cu2+的还原效率,过高的浓度可能导致试剂浪费。 如图5-D 所示,在一定AA 浓度范围内(0.15 ～0.2 mol/L),与试纸条T 线信号强度呈现正相关,但当浓度超过0.1 mol/L 后,信号增长速率显著放缓;在0.15 ～0.2 mol/L 内,背景信号明显增强。 综合考虑信号增益、试剂经济性及背景控制等因素,最终选定0.1 mol/L 作为AA 的最佳使用浓度,该参数可有效保障铜沉积反应的高效性与检测体系的可靠性。
2.5 试纸条检出限评价
检出限作为评价试纸条性能的关键参数,其优化对于提升检测灵敏度至关重要。 本研究采用铜沉积放大策略实现小分子化合物的高灵敏度检测(表1),相较于传统方法,其检测限(limit of detection,LOD)显著提升4.9 倍,检测限低至0.7 μg/kg,优于新型纳米材料[25]及酶催化放大[26]等现有放大策略。 现有文献研究表明,该策略在大分子双抗夹心法中可实现高达20 倍的信号放大倍数,有效增强对大分子目标物的检出灵敏度,显著降低检测下限,并展现出对微量目标物的卓越检出能力[23]。 此外,铜沉积策略在沉积效率、成本控制及试剂稳定性方面均表现优异,避免了新型纳米材料制备工艺复杂、酶催化放大信号增强效果有限等局限性,实现了灵敏度与实用性的高效平衡。 需指出的是,相较于酶催化放大无需额外沉积步骤的简便性,本研究需精确控制沉积温度、时间等参数,操作流程相对复杂,这可能是其实际应用中的潜在挑战。
表1 基于不同放大策略的免疫层析法的对比
Table 1 Comparison of immunochromatographic assays based on different amplification strategies
放大策略LOD/(μg/kg) 放大倍数 参考文献新型纳米材料(海胆状金纳米颗粒)54[25]酶催化放大信号1.60.8[26]铜沉积120[23]铜沉积0.74.9本研究
2.6 试纸条灵敏度评价
本研究分别构建了基于金纳米棒(AuNRs)的免疫层析试纸条(AuNRs-ICTS)及铜沉积增强型AuNRs免疫层析试纸条(铜沉积Cu-AuNRs-ICTS),并对其检测性能进行系统性评估。 AuNRs-ICTS 体系在优化探针用量(1.5 μL)后,建立的上样缓冲液中标准曲线方程如公式(4)所示：
R2=0.995,LOD 值为3,46 μg/kg,检测范围覆盖3.46 ～82.96 μg/kg(图6-A)。 铜沉积AuNRs-ICTS 通过降低探针用量至0.75 μL 并引入铜沉积信号放大策略,标准曲线方程如公式(5)所示：
图6 灵敏度评价
Fig.6 Sensitivity evaluation
R2=0. 998,LOD 值为0. 7 μg/kg,检测范围为0.7 ～110.34 μg/kg(图6-B)。 与AuNRs-ICTS 相比,铜沉积AuNRs-ICTS 的LOD 提升4.9 倍,同时显著拓宽了线性检测区间,证实了铜沉积策略在提升免疫层析试纸条分析性能方面的有效性。 本研究中铜沉积技术虽显著提升信号强度,但存在潜在的背景放大风险。 针对该问题,本研究通过优化铜沉积时间、CuSO4·5H2O 浓度及AA 浓度,有效控制空白背景信号;同时设置未滴加探针的空白对照,验证沉积特异性,确保检测结果的准确性。 后续研究可进一步优化AuNRs 表面改性策略,降低非特异性吸附,进一步改善信噪比。
2.7 特异性实验
通过交叉反应实验来评估免疫层析试纸条特异性。 本实验中AFB1 设定为5 ng/mL,用作强阳性对照以验证高浓度目标物的特异性识别能力;干扰毒素(ZEN、DON、OTA、T-2)设定为100 ng/mL,旨在模拟玉米中此类毒素可能存在的更高极端污染场景,确保方法在复杂基质环境中仍能保持良好特异性。 如图7所示,当在上样缓冲液中添加5 ng/mL 的AFB1标准品时,经显色及铜沉积信号放大处理后,试纸条检测线与控制线灰度比值(T/C 值)相较于阴性空白对照显著降低;而在缓冲液中分别加入100 ng/mL 的ZEN、DON、OTA 及T-2 时,试纸条T/C 值与阴性对照无统计学差异。 实验结果表明,该试纸条与ZEN、DON、OTA 和T-2 无明显交叉反应,具有良好的特异性识别能力和较高的特异性。
图7 特异性实验
Fig.7 Specificity experiment
注：AFB1：5 ng/mL,ZEN、OTA、DON、T-2 毒素：100 ng/mL。
2.8 加标回收实验
通过对玉米样品的高、中、低3 个浓度进行加标实验,验证该方法的准确度和精密度(表2)。 结果显示：该方法的加标回收率为89.06% ～118.20%,变异系数(coefficient of variation,CV)为5.92% ～9.10%,表明该方法具有良好的可靠性与稳定性。
表2 加标回收(n =3)
Table 2 Spiked recovery (n =3)
检测对象AFB1 添加量/(ng/mL)实际测量值/(ng/mL)回收率/%CV/%0未检出——玉米0.050.059 1118.206.58 1 1.064 2106.425.92 5 4.453 089.069.10
注：—表示无此项。
2.9 实际样品检测
对实际玉米样品中AFB1 的检测结果进行t 检验分析,以验证方法的准确性。 该样品的特性值为10.7 ng/g,提取稀释后质量浓度为0.535 ng/mL。 计算得到t 值为0.759,该值小于95%置信区间下自由度n =3 时的临界值t(0.95, 3) =4.303。 检测数据显示,玉米样中AFB1的实测值与认证值之间未发现显著差异(P ＞0.05),验证了该方法的准确性。 这一结果与前期加标回收实验(回收率89.06% ～118.20%,CV≤9.10%)共同佐证了方法的可靠性(表3)。
表3 实际样品检测结果(n =3)
Table 3 Detection results of actual samples (n =3)
检测对象 AFB1 测量值/(ng/mL) HPLC 认证值/(ng/mL)t玉米粉0.5500.5350.759
3 结论与展望
本研究将金纳米棒(AuNRs)与铜沉积信号放大技术结合,建立了高灵敏度免疫层析检测方法。 通过优化AuNRs 探针用量(1. 5 μL) 和铜沉积条件(130 ℃/9 min,50 mmol/L CuSO4·5H2 O +0.1 mol/L AA),使探针用量降低至0.75 μL,LOD 值达0.7 μg/kg,较铜沉积前LOD 提升4.9 倍。 玉米样本加标回收率89.06% ～118.2%,CV≤9.10%,验证了方法的准确性和重复性。 该体系为食品污染物检测提供了新方案,未来可通过材料优化和工艺改进进一步拓展应用场景。
[1] 刘瑾萱, 张雅媛, 付红岩, 等. 玉米植物基酸奶制备工艺优化[J]. 南方农业学报, 2024, 55(12)：3686 -3697.Liu J X, Zhang Y Y, Fu H Y, et al. Optimization of preparation technology of corn plant-based yogurt[J]. Journal of Southern Agriculture, 2024, 55(12)：3686 -3697.
[2] 张昕泽, 蒲睿思, 牛锦璐, 等. B8 N6 S4 调控黄曲霉生长及黄曲霉毒素B1 合成的功能研究[J]. 广东农业科学, 2025, 52(5)：54 -63.Zhang X Z, Pu R S, Niu J L, et al. Function of B8 N6 S4 in regulating the growth and aflatoxin B1 biosynthesis of Aspergillus flavus[J]. Guangdong Agricultural Sciences, 2025, 52(5)：54 -63.
[3] 贾克江, 吴国芳, 张剑搏, 等. 黄曲霉毒素B1 的毒性机理、检测及脱毒方法研究进展[J]. 中国畜牧兽医,2025,52(8)：3954-3964.Jia K J, Wu G F, Zhang J B, et al. Research progress on toxicity mechanism, detection and detoxification methods of aflatoxin B1[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2025, 52(8)：3954 -3964.
[4] 陆佳丹, 仇文静, 张静. 基于硫化铜纳米球/银纳米粒子复合材料的黄曲霉素B1 适配体传感器研究[J]. 化工新型材料,2026, 54(1)：271 -276.Lu J D, Qiu W J, Zhang J. Research on aflatoxin B1 aptasensor based on copper sulfide nanosphere/silver nanoparticle composite[J]. New Chemical Materials, 2026, 54(1)：271 -276.
[5] Martínez J, Hernández-Rodríguez M, Méndez-Albores A, et al.Computational studies of aflatoxin B1(AFB1)：A review[J]. Toxins, 2023, 15(2)：135.
[6] 黄晓赞, 张桂福, 黄冬, 等. 冷光源紫外线降解小油坊压榨花生油中黄曲霉毒素B1 的研究应用[J]. 粮食与饲料工业, 2025(4)：30 -33.Huang X Z, Zhang G F, Huang D, et al. Study on the application of cold light source ultraviolet technology for aflatoxin B1 degradation in pressed peanut oil produced by small-scale oil mill[J]. Cereal &Feed Industry, 2025(4)：30 -33.
[7] Qu L L, Jia Q, Liu C Y, et al. Thin layer chromatography combined with surface-enhanced Raman spectroscopy for rapid sensing aflatoxins[J]. Journal of Chromatography A, 2018, 1579：115 -120.
[8] Huertas-Pérez J F, Arroyo-Manzanares N, Hitzler D, et al. Simple determination of aflatoxins in rice by ultra-high performance liquid chromatography coupled to chemical post-column derivatization and fluorescence detection[J]. Food Chemistry,2018,245：189 -195.
[9] Liu Y, Li W, Ding Z, et al. Three-dimensional ordered macroporous magnetic photonic crystal microspheres for enrichment and detection of mycotoxins (II)：The application in liquid chromatography with fluorescence detector for mycotoxins[J]. Journal of Chromatography A, 2019, 1604：460475.
[10] Keskin E, Eyupoglu O E. Determination of mycotoxins by HPLC,LC-MS/MS and health risk assessment of the mycotoxins in bee products of Turkey[J]. Food Chemistry, 2023, 400：134086.
[11] Yan T T, Zhu J, Li Y, et al. Development of a biotinylated nanobody for sensitive detection of aflatoxin B1 in cereal via ELISA[J].Talanta, 2022, 239：123125.
[12] 李长滨, 夏唯一, 吴圣江, 等. 玉米中黄曲霉毒素B1 提取工艺及检测方法的对比研究[J]. 粮食与油脂,2022,35(9)：158-162.Li C B, Xia W Y, Wu S J, et al. Extraction technology and comparative study on detection methods of aflatoxin B1 in maize[J].Cereals & Oils, 2022, 35(9)：158 -162.
[13] Nakhjavan B, Ahmed N S, Khosravifard M. Development of an improved method of sample extraction and quantitation of multi-mycotoxin in feed by LC-MS/MS[J]. Toxins, 2020, 12(7)：462.
[14] Liu X M, Feng S Y, Zhou P, et al. Simultaneous determination of danofloxacin and flumequine in milk based on fluorescence spectroscopy and chemometrics tools[J]. Food Analytical Methods,2013, 6(6)：1739 -1749.
[15] Murillo Pulgarín J A, Alañón Molina A, Boras N. Direct determination of danofloxacin and flumequine in milk by use of fluorescence spectrometry in combination with partial least-squares calibration[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2013,61(11)：2655 -2660.
[16] 王振芳, 王平东, 邓庆, 等. 高灵敏度呕吐毒素时间分辨荧光快速定量检测卡的研发和应用[J]. 粮食加工, 2024, 49(1)：102 -107.Wang Z F, Wang P D, Deng Q, et al. Development and application of high sensitivity time-resolved fluorescent rapid quantitative detection card for deoxynivalenol[J]. Grain Processing, 2024, 49(1)：102 -107.
[17] Yuan B, Liu Q, Yang Q Q, et al. An immediate and antibody protected carboxyl quantum dot immunochromatographic analysis hierarchical signal amplification test strip based on biotin-streptavidin system for the detection of aflatoxin B1 in peanuts[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2024, 125：105759.
[18] Urusov A E, Zherdev A V, Dzantiev B B. Use of gold nanoparticle-labeled secondary antibodies to improve the sensitivity of an immunochromatographic assay for aflatoxin B1[J]. Microchimica Acta, 2014, 181(15)：1939 -1946.
[19] Hu W J, Yan J X, You K H, et al. Streptococcal protein G based fluorescent universal probes and biosynthetic mimetics for Fumonisin B1 immunochromatographic assay[J]. Food Control, 2020,118：107442.
[20] Jiang T, Song Y, Du D, et al. Detection of p53 protein based on mesoporous Pt-Pd nanoparticles with enhanced peroxidase-like catalysis[J]. ACS Sensors, 2016, 1(6)：717 -724.
[21] Bu T, Huang Q, Yan L Z, et al. Ultra technically-simple and sensitive detection for Salmonella enteritidis by immunochromatographic assay based on gold growth[J]. Food Control, 2018, 84：536 -543.
[22] Li Y Y, Zhu Z W, Qu W L, et al. A highly sensitive immunochromatographic assay for lead ions in drinking water based on antibody-oriented probe and silver enhancement[J]. European Food Research and Technology, 2023, 249(12)：3097 -3103.
[23] Tian M L, Lei L L, Xie W Y, et al. Copper deposition-induced efficient signal amplification for ultrasensitive lateral flow immunoassay[J]. Sensors and Actuators B：Chemical, 2019, 282：96 -103.
[24] Ye X C, Jin L H, Caglayan H, et al. Improved size-tunable synthesis of monodisperse gold nanorods through the use of aromatic additives[J]. ACS Nano, 2012, 6(3)：2804 -2817.
[25] Ren W J, Huang Z B, Xu Y, et al. Urchin-like gold nanoparticlebased immunochromatographic strip test for rapid detection of fumonisin B1 in grains[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry,2015, 407(24)：7341 -7348.
[26] Parolo C, de la Escosura-Muñiz A, Merkoçi A. Enhanced lateral flow immunoassay using gold nanoparticles loaded with enzymes[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2013, 40(1)：412 -416.