随着生活水平不断提高,人们的饮食结构正日益朝向更加健康、安全的方向转变。长期高钠饮食已被证实与多种慢性疾病风险上升密切相关[1]。世界卫生组织建议成人每日食盐摄入量控制在5 g以下,但多数国家的实际摄入水平仍远超此限值,亟需有效减盐策略以实现公共卫生目标。然而,食品工业在推进减盐过程中面临严峻挑战。钠盐(NaCl)不仅是咸味的主要来源,也在食品的质构、防腐和加工特性中扮演着不可替代的角色。单纯减少NaCl用量往往会导致风味不足、产品可接受度下降。目前主流的减盐手段,如KCl部分替代NaCl,虽具有一定减钠效果,但KCl带来的强烈苦味和金属味会严重影响口感,且对特定人群存在潜在健康风险。因此,如何在有效增强咸味感知的同时避免引入不良风味,已成为当前减盐技术研究的关键方向。

咸味肽是一类来源于天然蛋白质并能提供咸味感知的低聚肽[2],具有来源天然、良好风味特性和与食品基质相容性较好等优势,更契合当前市场对“清洁标签和健康减盐”的产品需求,为开发下一代健康减盐方案提供了重要路径[3]。已有研究从植物、真菌和海洋动物等不同原料中成功提取出咸味肽[4]。海鲜菇(Hypsizygus marmoreus)在我国种植广泛,具有海蟹味,其蛋白质中呈味氨基酸含量丰富,其中天冬氨酸和谷氨酸被认为与肽段咸味感知具有十分密切的关联[5-6],是制备咸味肽的优质原料;同时美拉德反应因能有效改善风味而被广泛应用,该反应能够赋予食品特有的色泽与风味特性,还能有效增强食材的咸鲜味[7]。Wang等[8]从海鲜菇中分离纯化得到的肽具有明显的咸味特征。本课题组前期也以海鲜菇为原料,通过美拉德反应制备出分子质量主要集中在1 kDa以下的低聚肽,呈现出良好咸鲜风味[9]。然而,传统美拉德反应产物(Maillard reaction products,MRPs)普遍存在色泽较深的问题,限制了其作为风味增强剂在低色度食品中的应用。因此,如何在保持风味增强效果的同时调控褐变过程成为亟需解决的问题。

半胱氨酸(cysteine,Cys)等硫醇类抑制剂可在美拉德反应过程中靶向作用于关键活性中间体(如二羰基化合物),生成一种褐变活性更低的结构类似物2-硫代噻唑烷-4-羧酸(cyclic 2-threityl-thiazolidine-4-carboxylic acid, TTCA)等物质,以阻断典型的Strecker降解及聚合路径,从而有效抑制褐变副反应的发生[10]。研究发现,添加Cys可显著降低产物褐变指数,如降低鸡肝蛋白水解物在美拉德反应早中期不饱和羰基化合物等褐色产物关键前体的生成量(A294)[11],以及降低甘氨酸-木糖在美拉德反应后期棕褐色高分子聚合物(如类黑精物质)的生成量(A420)[12],与后期脱色/层析处理相比,该方法不仅可实现对产物色泽的精准调控,还兼具步骤精简,成本低,能较好保持肽段结构完整性,以及具有增鲜和一定程度咸味增强作用的优势[13],达到“减工不减味”的目的。但目前尚未见基于Cys调控的食用菌美拉德咸味肽色泽抑制及其风味分析的相关研究。

咸味感知涉及多种受体与离子通道的协同作用[14]。其中,跨膜通道样蛋白 4(transmembrane channel like 4,TMC4)是重要的作用靶点之一。作为一种具有8个跨膜结构域的Cl-通道,它可以响应高浓度的NaCl,从而增强对咸味的感知信号[15]。因此,探究其与浅色MRPs的相互作用,对阐释海鲜菇中咸味肽风味增强机制至关重要。

因此,本研究旨在通过Cys色泽抑制手段,优化获得适用于低色度食品的海鲜菇浅色美拉德咸味肽,并解析其关键呈味序列,阐明这些序列与TMC4受体的相互作用机制,为兼具清洁标签和优良感官品质的减盐食品提供关键原料和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

海鲜菇干品,福建古田干货店;碱性蛋白酶、风味蛋白酶、纤维素酶,广西南宁庞博生物工程有限公司;HCl、NaOH(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;SephadexG-15葡聚糖凝胶,北京索莱宝科技有限公司;Cys,广东康达生物科技有限公司;葡萄糖、D-木糖(均为食品级),河南万邦化工科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Evolution Pro紫外分光光度计,赛默飞世尔科技有限公司;AvantiJ-E多用途高效离心机,美国Beckman Coulter公司;INSENT TS-5000Z电子舌,日本Insent公司;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器,上海力辰科技有限公司;Waters600高效液相色谱仪,美国Waters公司;超滤离心管,山东博纳生物科技集团有限公司;HC-0120-10层析柱,北京瑞达恒辉生物科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 海鲜菇浅色美拉德咸味肽的制备优化

1.3.1.1 海鲜菇蛋白酶解液的制备

参考林钦淋等[9]的方法,将海鲜菇干品常温粉碎后过80目筛获得粉末,将其按固液比1∶30(g∶mL)分散于蒸馏水并调节pH值至5.0,加入3%(质量分数)纤维素酶于55 ℃酶解2 h后80 ℃灭酶10 min,随后体系冷却至室温(25 ℃),调节pH值至11.8后55 ℃碱提1.5 h。提取液7 500 r/min离心15 min,取上清液调节pH值至等电点3.4,于4 ℃静置1 h后7 500 r/min离心15 min,收集沉淀。随后经脱盐、调节pH值至中性和冷冻干燥后,获得海鲜菇蛋白粉。

将海鲜菇蛋白粉用超纯水配制成50 mg/mL溶液后,85 ℃处理15 min至变性,随后冷却至室温。调节体系pH值至9.0后加入0.8%(质量分数)碱性蛋白酶于50 ℃酶解2.5 h。再调节pH值至7.0后加入0.77%(质量分数)风味蛋白酶于49 ℃继续酶解2 h。结束后将酶解液100 ℃灭酶10 min,冷却后7 500 r/min离心15 min,收集上清液,即为海鲜菇蛋白肽(Hypsizygus marmoreus peptide,HMP)溶液,分装后4 ℃保存备用。

1.3.1.2 美拉德反应条件对咸味肽褐变指数及色差的影响

将HMP溶液减压浓缩至原体积的1/2后,在其中添加质量比为4∶1的葡萄糖和D-木糖,控制其总添加量为2.5 g/100 mL酶解液后,根据以下方法操作,分别考察考察反应温度、反应pH值和Cys添加量对海鲜菇美拉德咸味肽褐变指数(A294和A420)和色差的影响,为后续响应面优化提供依据。

反应温度:量取5份20 mL的HMP溶液,分别加入反应容器中,体系pH值调节至8.0,Cys添加量1.0%(质量分数)。在此条件下,将体系分别于70、80、90、100、110 ℃反应1 h后,取体系溶液测定A294、A420和色差值。

Cys添加量:量取5份20 mL的HMP溶液,分别加入反应容器中,反应温度80 ℃,体系pH值调节至8.0。在此条件下,添加Cys至质量分数分别为0.8%、1.0%、1.2%、1.4%和1.6%后,反应1 h,取体系溶液测定A294、A420和色差值。

反应pH值:量取5份20 mL的HMP 溶液,分别加入反应容器中,反应温度80 ℃,Cys添加量1.0%(质量分数)。在此条件下,将体系pH值分别调节至8.0、8.5、9.0、9.5和10.0后反应1 h,取体系溶液测定A294、A420和色差值。

1.3.1.3 基于响应面法的海鲜菇浅色美拉德咸味肽制备工艺优化

根据上述各反应条件下美拉德反应后期棕黑色物质生成情况(A420)的结果,以反应温度(70～90 ℃)、反应pH值(9.0～10.0)和Cys添加量(0.8%～1.2%,质量分数)为自变量,褐变指数A420为响应值,通过Design Expert软件,采用Box-Behnken Design原理设计三因素三水平响应面实验,获得海鲜菇浅色美拉德肽(light-colored Hypsizygus marmoreus Maillard peptide,LCMP)的最佳制备工艺。以不添加Cys方式制备的海鲜菇美拉德肽(Hypsizygus marmoreus Maillard peptide,MP)溶液为对照。

1.3.2 色差测定

色差测定用于辅助表征MRPs的综合色泽变化。将2 mL LCMP样品置于直径为3 cm的培养皿中,以MP为对照,采用色差仪测定L*(亮度),a*(红绿色)和b*(黄蓝色)值。总色差值ΔE根据公式(1)计算:

(1)

1.3.3 电子舌评分

参考Zhang等[16]的方法,取HMP、MP和工艺优化后的LCMP溶液各80 mL,在常温下置于INSENT TS-5000Z味觉分析系统的电子舌专用测量杯中,经CTO、AAE、COO、AE1、CAO等5个传感器测试120 s,清洗时间为30 s,分别考察各样品的咸、鲜、苦、涩、酸及后味(苦味回味)、后味(涩味回味)和丰富度(鲜味回味)。每个样品检测4次,剔除首次检测数据,取后3次数据平均值进行味觉属性分析。

1.3.4 海鲜菇浅色美拉德咸味肽的分离与鉴定

1.3.4.1 多肽分子质量分布测定

采用凝胶渗透色谱法测定MP和LCMP的分子质量分布,仪器配置为:高效液相色谱仪联合TSKgel2000SWXL色谱柱(30 cm×7.8 mm×5 μm)、2487紫外检测器和Empower工作站。设定柱温30 ℃,检测波长220 nm,流速0.5 mL/min;流动相为乙腈∶水∶三氟乙酸=40∶60∶0.1(体积比)。标准曲线采用细胞色素C(Mw 12 384)、抑肽酶(Mw 6 500)、杆菌肽(Mw 1 422)、四肽GGYR(Mw 451)和三肽GGG(Mw 189)标准品分析绘制。

1.3.4.2 超滤和凝胶色谱分离

将LCMP溶液用3 kDa和1 kDa超滤膜过滤后收集各个组分滤液,对各组分进行感官评价,并将咸鲜味评分最高的组分经旋蒸浓缩后冷冻干燥,于-20 ℃保存。

随后,将该组分溶于超纯水中,经0.45 μm滤膜过滤后加载至SephadexG-15凝胶过滤色谱柱进行分离。样品质量浓度10 mg/mL,上样体积4 mL,洗脱液流速0.3 mL/min,检测紫外波长220 nm。根据紫外吸收峰依次收集峰值组分后进行浓缩和冷冻干燥,用于后续分析。

1.3.4.3 感官评价

感官评价采用风味属性分项评分法。由16名经训练的评价员(男女比例均衡,年龄20～30岁,无味觉或嗅觉障碍)对LCMP超滤后各组分进行评定,分别对咸味、鲜味、苦味、涩味、酸味5个单独风味属性按1～10分进行强度评分;分值越高表明该属性感知越强。该评分体系参照表1的1～10分等级体系,但用于味道强度评定,而非综合接受度。所得各风味属性的平均值用于绘制雷达图。

1.3.4.4 氨基酸序列鉴定

凝胶色谱分离后的LCMP样本经C18固相萃取柱脱盐后,溶解于20 μL 0.1%(体积分数)甲酸溶液中充分振荡。随后在4 ℃下17 000 r/min离心20 min,将上清液转移到上样管中,取4 μL用于液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)鉴定,并通过PEAKS 12.0进行结果鉴定和分析。液相色谱参数:PepMap RSLC C18色谱柱(75 μm×150 mm,2 μm,孔径100 Å),流动相A为0.1%(体积分数)甲酸,流动相B为0.1%(体积分数)乙腈。质谱参数:一级质谱:分辨率=70 000,自动增益控制目标离子数=3×106,最大离子注入时间=60 ms,扫描范围=300～1 400 m/z;二级质谱:分辨率=17 500,自动增益控制目标离子数=5×104,最大离子注入时间=80 ms,强度阈值=20,归一化碰撞能量=27。

1.3.5 咸味肽的作用机制与安全性评价

1.3.5.1 TMC4与咸味肽段的同源性建模和分子对接

TMC4建模:参考汪海燕[17]的方法,分别在NCBI数据库获取受体TMC4蛋白的氨基酸序列(NP.001138775.2),并在UniProtKB数据库(https://www.uniprot.org/uniprotkb)获取TMC4蛋白结构(Q7Z404-TMC4-HUMAN),经AlphaFold方式构建,并由Galaxy Refine软件优化获得TMC4模型。随后通过拉式图和总质量因子参数进行模型质量评估。

咸味肽段建模:以质谱鉴定的LCMP特征性氨基酸序列为对象,通过ChemDraw和Chem3D 20.0软件进行三维建模和能量最小化处理后,并保存为pdb/sdf格式。

通过Autodock Tools软件将各咸味肽段模型分别与TMC4模型进行半柔性分子对接,对接口袋的坐标设置如下:x为3.757,y为4.033,z为-7.611,半径为126 Å,以结合能最低的模型作为最优对接构象,并分析结合的关键残基位点。

1.3.5.2 多源工具联用评估咸味肽毒性、致敏性和生物活性

针对筛选出的低结合能咸味肽段,分别进行安全性、生物活性及呈味功能预测。通过ToxinPred(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/index.html)与pLM4Alg(https://f6wxpfd3 sh.us-east-1.awsapprunner.com)在线工具评估其潜在毒性与致敏性[18];通过PeptideRanker评估其具有生物活性的潜力(评分越接近1,可能性越高);并基于BIOPEP(https://biochemia.uwm.edu.pl/biopep/start_biopep.php)生物活性肽数据库,预测这些肽段的潜在呈味活性。

1.4 数据分析

采用SPSS和Origin2025Pro软件进行数据分析和绘图,使用独立样本T检测进行显著性分析,数据均采用“平均值±标准差”表示,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 反应条件对海鲜菇美拉德咸味肽褐变指数和色差的影响

2.1.1 反应温度对海鲜菇美拉德咸味肽褐变指数和色差的影响

由表2可知,反应温度对海鲜菇美拉德产物的褐变指数和色差具有显著影响(P<0.05)。A294值可反映高活性中间产物的积累,本研究中,90 ℃以下时A294值逐渐升高随后下降,说明升温会促进美拉德反应中羰基化合物等风味化合物的形成[19],为后期褐变提供充足底物供给;A420值则表征类黑素等棕色聚合物的形成[20],本研究中A420值呈先降后升最后平衡的趋势,其中80 ℃时值最低(P<0.05),这可能是因为此温度下部分中间体与Cys充分反应,导致类黑素等棕色聚合物生成量下降[21]。ΔE值同样呈先升后降趋势,在80 ℃时ΔE值最高(P<0.05),说明其与MP色泽差异最大,颜色最浅[22]。这表明在此温度条件下Cys抑制剂对美拉德反应深色中间产物生成的干预较有效。

2.1.2 Cys添加量对海鲜菇美拉德咸味肽褐变指数和色差的影响

由表3可知,当Cys添加量为1.0%时,样品A420和ΔE值分别处于最低和最高水平(P<0.05),A294值水平在此时也处于较低水平,说明此时美拉德产物的褐变指数相对最低,颜色与MP差距最大。这表明Cys能最有效地抑制产品褐变,从而保持其良好的色泽[23]。而Cys添加量在1.0%以上时,A294值无显著差异(P>0.05),A420值变化不明显,说明Cys持续添加并未对醛酮类中间产物的生成产生影响;而ΔE值的变化,则很可能是因为Cys侧链上巯基(—SH)的参与导致[24],这个特殊的基团使其在美拉德反应中扮演了一个“双重角色”:既是反应物,也是抑制剂。

2.1.3 反应pH值对海鲜菇美拉德咸味肽褐变指数和色差的影响

初始pH值对整个美拉德反应过程具有关键调控作用。已有研究表明,美拉德反应体系的pH值通常会随反应进程逐渐下降,其主要原因在于反应过程中会生成多种有机酸及羧基化合物,如甲酸、乙酸、乳酸等[25]。由表4可知,初始pH值为9.5时,反应体系的褐变指数A294和A420值均最低,色泽最为明亮,且产物澄清透明,未出现明显浑浊现象。这符合本研究对褐变指数的控制目标。ΔE值则呈先升后降趋势,这可能是因为ΔE是综合亮度、红绿、黄蓝值体现在整个色度空间的色泽,具有色泽的空间性,因而呈现出比较复杂的变化[26]。

2.2 海鲜菇浅色美拉德咸味肽制备工艺响应面优化

根据上述研究结果,由于A420指标直接与类黑素等棕色聚合物生成量相关,因此以反应温度(70～90 ℃)、反应pH值(9～10)和Cys添加量(0.8%～1.2%)为变量,以A420为响应值,设计三因素三水平响应面分析实验并进行方差分析(表5)。结果表明,各因素对LCMP A420影响的大小依次为:Cys添加量(C)>反应pH值(B)>反应温度(A)。根据结果得到多元二次回归方程:Y=0.021 2A2+0.018 0B2+0.017 52+0.001 0A-0.002 9B-0.003 6C-0.000 5AB+0.002 0AC+0.005 7BC+0.083 8。

考察拟合响应曲面形状,分析三变量的交互作用对LCMP A420值的影响(图1)。交互作用BC曲面最陡(图1-a),交互作用影响显著(P<0.05),其次为AC(图1-b),交互作用影响不显著(P>0.05),而交互作用AB的曲面陡峭程度较小(图1-c),交互作用影响不显著(P>0.05)。

通过Design-Expert11.0软件进行数据分析,得出LCMP的最佳制备工艺条件为:反应温度85.9 ℃、反应pH值9.5和Cys添加量1.0%,理论A420值0.092。考虑到实际操作过程的可行性,调整配方工艺为温度86 ℃,反应pH值9.5和Cys添加量1.0%,其他条件不变,3次验证试验结果A420平均值为0.122,与预测值接近,所建模型准确可行。

2.3 海鲜菇浅色美拉德咸味肽的颜色分析

由图2-a可知,经美拉德反应后,MP和LCMP的褐变指数较反应前的HMP显著降低(P<0.05),由深褐色变为较浅的红褐色。尤其是加入Cys后的浅色美拉德反应使产物褐变指数显著下降,其颜色也转变为更浅的黄色。图2-b的光学成像亦呈现与褐变指数一致的变化趋势。上述结果说明,通过加入Cys并优化浅色美拉德反应条件,能有效抑制如α-二羰基化合物类[27]等深色物质的产生。

2.4 海鲜菇浅色美拉德咸味肽电子舌与主成分分析(principal component analysis, PCA)

如图3-a所示,与HMP相比,MP和LCMP的咸味、鲜味及丰富性风味响应值均明显升高,而苦味响应值呈降低趋势,说明美拉德反应不仅有助于增强产物咸味与鲜味等期望风味强度[28],还有效抑制了不良风味因子的释放,改善了蛋白肽的整体感官品质。采用PCA进一步可视化处理与解析HMP、MP和LCMP溶液风味特征(图3-b),PC1与PC2的贡献率分别为70.2%、27.9%,累计达98.1%,说明其能有效区分不同产物的味觉特性。HMP位于PC2的负半轴,表现为过渡型风味特征。而相较于HMP的PC1负半轴,MP和LCMP则均位于PC1的正半轴,说明美拉德反应使HMP的风味发生了巨大变化,但其中MP接近回味和涩味,LCMP更靠近咸鲜味及丰富度,HMP位于PC2的负半轴,表现为过渡型风味特征。综上,LCMP风味最为协调,苦涩感显著降低,具有更优的鲜咸特性与风味平衡性,是一种风味良好的浅色美拉德咸味肽,具有巨大应用潜力。

2.5 浅色美拉德反应对咸味肽分子质量分布的影响

如图4-a所示,LCMP样品中分子质量≤180 Da组分的含量明显高于MP组分,其他组分含量均下降,MP组分的每个肽段范围均呈现下降趋势。反应体系肽段的分子质量<1 kDa,这与Ni等[25]研究一致。一般情况下,低分子质量(<1 kDa)肽中咸味肽的占比较高。温青玉等[29]在面筋蛋白中鉴定出了5条咸味肽(如PFGQQ、QPFP等),发现其分子质量均在475～576 Da。本研究进一步发现,在Cys参与的反应体系中,颜色明显变浅的同时,分子质量≤500 Da组分占比最高,印证了低分子质量肽段是咸味主要贡献者的推断。

基于上述“小分子质量-强咸味”的关系和感官评价结果(图4-b),分子质量<1 kDa组分的咸味和鲜味得分均高于其他分子质量组分,因此咸味或咸味增强的氨基酸/肽段更可能集中于该组分中。

2.6 海鲜菇浅色美拉德咸味肽特征性氨基酸序列分析

根据超滤后分子质量<1 kDa组分具有更高占比和更强咸鲜味表现的结果,以该组分为研究对象进行凝胶色谱分离后,进一步通过LC-MS/MS对各组分肽段序列进行分析。通过PEAKS 12.0软件进行数据库检索,共鉴定出1 963条2～10个氨基酸残基的肽段序列。肽的咸味和强度通常受氨基酸类型、肽链长度和序列等因素影响[30]。精氨酸(arginine,Arg,R)位于C端并带正电,或处于N端时,对其组成的短肽增咸效果影响显著[31]。此外,通常被认为属于鲜味氨基酸的谷氨酸(glutamic acid,Glu,E)和天冬氨酸(aspartic acid,Asp,D)在某些序列背景下亦可能呈现咸味,表明咸味与鲜味之间存在一定的正相关性[6]。基于此,在其中PEAKS评分≥20的肽段中,进一步考量BIOPEP-UWM数据库预测的咸味和鲜味评分、氨基酸数量2～10个和分子质量,综合优选出14条潜在咸味肽,如表6所示。

2.7 TMC4受体同源建模和优化

TMC4受体模型质量评估结果如图5所示,拉氏图(图5-a)中最适区域占比为98.9%,该区域包含的氨基酸数量越多,表明结构越稳定;允许区域占比为1.1%;禁止区域(以红色标记的残基)代表在psi-phi角度中构象不合理的氨基酸,占总体的0.0%。优化后模型的总质量因子得分为99.08分,其三维构象如图5-b所示。

2.8 咸味肽序列与TMC4模型的分子对接

将筛选出的14个特征性氨基酸序列分别与咸味受体TMC4对接,并计算结合能。结合能是筛选配体与受体相互作用的重要参考指标,结合能越低,受体-配体复合物越稳定[32]。本研究筛选出5个结合能最低的肽段依次为:FDDGLR(-7.4 kcal/mol)

咸味肽与TMC4模型之间的结合相互作用包括氢键、疏水相互作用和静电相互作用等非共价相互作用[33],这些相互作用在整体上保证了蛋白复合体的结构稳定性。氢键和疏水作用是维持配体结合稳定性的核心作用力。由图6可知,Gln215、Lys389、Gln383等极性残基与配体形成了多个强稳定氢键,相互作用距离多位于2.8～3.2Å之间,符合典型氢键结合范围。在氢键外,Val442、Leu445、Phe363、Trp449和Phe405等残基围绕配体形成疏水包埋,降低了水分子干扰,提高了局部结合的亲和力。研究发现,Thr、Arg和Glu等氨基酸残基为猪骨胶原咸味肽关键位点[34]。而本研究则进一步发现,Gln、Lys和Gln等为海鲜菇源咸味肽与该受体模型结合的关键氨基酸残基位点。这可能与本研究咸味肽为食用菌来源以及Cys参与美拉德反应的特殊性有关。该结果可为拓展和完善咸味肽-受体对接机制提供理论基础。

2.9 咸味肽序列毒性、致敏性和生物活性潜力评估

生物信息学方法可用来预测蛋白质和肽的毒性、致敏性和稳定性[35]。由表8可知,筛选出的5条特征性优势咸味肽段在计算预测中未显示明显的毒性和致敏性风险,但仍需进一步验证其实际安全性。PeptideRanker评分显示,除DDAA外,其余肽段得分均高于0.6,表明其具有较高的生物活性潜力,可作为未来活性咸味肽开发的重要依据。

3 结论

本研究确定反应温度、初始pH值和Cys添加量对海鲜菇浅色MRPs的褐变指数及色差具有显著影响,优化获得最佳制备条件为反应温度86 ℃,初始pH值为9.5,并添加1%(质量分数)Cys抑制剂,产物的褐变指数A420达0.122,与对照组存在显著差异(P<0.05),并体现出明显的咸味和鲜味特征。通过LC-MS/MS技术分析分子质量<1 kDa的咸味贡献主体组分,共鉴定出1 963个肽段,将通过BIOPEP-UWM数据库预测咸鲜味评分、氨基酸数量和分子质量标准优选的14条肽段与TMC4蛋白模型进行分子对接后,获得5个结合能最低的肽段,根据现有的计算预测,这些肽段在毒性、致敏性及稳定性方面表现出较为理想的趋势。稳定的肽段(FDDGLR、DDHPWNKPQ、DDHPW、DDAA和FDDL),其与TMC4之间的主要结合力为氢键与疏水相互作用,Gln、Lys和Gln等残基为关键结合位点。本研究为浅色美拉德反应修饰的HMP在低色度低盐健康食品体系中的功能化创新提供了理论依据,也对深入探究风味肽与味觉受体的相互作用规律具有重要的科学价值。

参考文献

[1] Xiang Y M, Lin X Y, Zheng M X, et al.Salt reduction in processed meat products:Integrated strategies and mechanisms to maintain saltiness perception[J].Trends in Food Science &Technology, 2025, 166:105420.

[2] 杨明哲, 赵子莹, 汤华成, 等.植物源咸味肽制备与应用研究进展[J].食品工业科技, 2023, 44(20):467-474.Yang M Z, Zhao Z Y, Tang H C, et al.A review:technologies for the preparation of plant-derived salty peptides and their application[J].Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(20):467-474.

[3] Hu Y Y, Badar I H, Liu Y, et al.Advancements in production, assessment, and food applications of salty and saltiness-enhancing peptides:A review[J].Food Chemistry, 2024, 453:139664.

[4] 汪少芸, 黄心澄, 高婷婷,等.咸味感知与咸味肽的研究进展[J].食品科学, 2023, 44(1):1-13.Wang S Y, Huang X C, Gao T T, et al.Progress in research on saltiness perception and salty peptides[J].Food Science, 2023, 44(1):1-13.

[5] 王丽, 罗红霞, 李淑荣,等.海鲜菇氨基酸组成分析及营养评价[J].食品工业科技, 2016, 37(21):338-341;346.Wang L, Luo H X, Li S R, et al.Amino acid composition and nutritional evaluation of different Hypsizygus marmoreus samples[J].Science and Technology of Food Industry, 2016, 37(21):338-341;346.

[6] Yao H L, Liu S P, Liu T T, et al.Microbial-derived salt-tolerant proteases and their applications in high-salt traditional soybean fermented foods:A review[J].Bioresources and Bioprocessing, 2023, 10(1):82.

[7] Hou F R, Song S S, Cui W J, et al. Flavor improvement of Maillard reaction intermediates derived from enzymatic hydrolysates of Oudemansiella raphanipes mushroom[J]. Foods, 2024, 13(11):1688.

[8] Wang W T, Li H B, Liu Z B, et al.Identification of flavor peptides based on virtual screening and molecular docking from Hypsizygus marmoreus[J].Food Chemistry, 2024, 448:139071.

[9] 林钦淋, 黄焰峰, 方焕新, 等.海鲜菇美拉德肽的制备及其风味特性研究[J].食品研究与开发, 2024, 45(3):146-155.Lin Q L,Huang Y F,Fang H X, et al.Preparation and flavor characteristics of Maillard reacted peptides from Hypsizygus marmoreus[J].Food Research and Development,2024,45(3):146-155.

[10] 朱婧雯. 谷朊粉肽浅色美拉德反应产物制备及其减盐增鲜功能[D].无锡:江南大学, 2023.Zhu J W.Regulated preparation of the light-colored Maillard reaction products from wheat gluten peptide and their salt-reducing and umami-enhancing functions[D].Wuxi:Jiangnan University, 2023.

[11] Chen W C, Cui W, Li P, et al.Enhanced flavor and modified structure of Maillard reaction products from chicken liver protein hydrolysate through composite fermentation pretreatment[J].Food Chemistry, 2026, 498:147276.

[12] Hou Q, Zhou T, Li X J, et al.Exogenous cysteine oxidation induced secondary browning of light-colored glycine-xylose Maillard reaction products through promoted formation of glyoxal and methylglyoxal[J].Food Chemistry, 2026, 499:147363.

[13] Zhang X, Ma S, Liu S Q.Sulfur supplementation potentiates the formation of meat aroma compounds in thermally treated chicken carcass hydrolysate[J].Journal of Food Science, 2025, 90(9):e70564.

[14] Son M, Park T H.The bioelectronic nose and tongue using olfactory and taste receptors:Analytical tools for food quality and safety assessment[J].Biotechnology Advances, 2018, 36(2):371-379.

[15] Narukawa M, Masago A, Murata M, et al.Mouse TMC4 is involved in the detection of chloride taste of salts[J].Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2024, 88(2):203-205.

[16] Zhang Y Q, Yao Y S, Zhou T, et al.Light-colored Maillard peptides:Formation from reduced fluorescent precursors of browning and enhancement of saltiness perception[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2023, 71(50):20 251-20 259.

[17] 汪海燕. 牛骨源咸味肽的分离鉴定及呈味机制研究[D].杭州:浙江农林大学, 2024.Wang H Y.Study on the isolation, identification, and taste mechanism of salty peptides derived from bovine bone[D].Hangzhou:Zhejiang A&F University, 2024.

[18] Gu Y X, Zhang J C, Niu Y J, et al.Virtual screening and characteristics of novel umami peptides from porcine type I collagen[J].Food Chemistry, 2024, 434:137386.

[19] 刘秀梅, 王媛, 李梦雨, 等.葵花籽蛋白美拉德肽的制备及其呈味研究[J].食品工业科技, 2025, 46(11):213-223.Liu X M, Wang Y, Li M Y, et al.Preparation and flavor characteristics of Maillard peptides from sunflower seed protein[J].Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(11):213-223.

[20] 王勇. 还原糖种类对花生蛋白水解物制备美拉德反应产物的影响[J].粮食与油脂, 2021, 34(1):47-50.Wang Y.Effect of reducing sugar and reaction time on Maillard reaction products of peanut protein hydrolysate[J].Cereals &Oils, 2021, 34(1):47-50.

[21] 黄梅桂, 张晓鸣.半胱氨酸抑制大豆肽美拉德反应体系色泽形成的动力学研究[J].江苏农业科学, 2014, 42(12):293-295.Huang M G, Zhang X M. Kinetic study on inhibition of color formation of Maillard reaction system of soybean peptide by cysteine[J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2014, 42(12):293-295.

[22] Wei C K, Ni Z J, Thakur K, et al.Color and flavor of flaxseed protein hydrolysates Maillard reaction products:Effect of cysteine, initial pH, and thermal treatment[J].International Journal of Food Properties, 2019, 22(1):84-99.

[23] Cui H P, Jia C S, Hayat K, et al.Controlled formation of flavor compounds by preparation and application of Maillard reaction intermediate (MRI) derived from xylose and phenylalanine[J].RSC Adv, 2017, 7(72):45442-45451.

[24] 阳运军, 聂春霖, 高彤, 等.半胱氨酸、大豆肽及大豆分离蛋白对添加茶多酚广式腊肠品质的影响[J].现代食品科技, 2025, 41(9):289-296.Yang Y J, Nie C L, Gao T, et al.Effects of cysteine, soybean peptide or soybean protein isolate on the quality of cantonese sausages with added tea polyphenols[J].Modern Food Science and Technology, 2025, 41(9):289-296.

[25] Ni Z J, Wei C K, Zhang A R, et al.Analysis of key precursor peptides and flavor components of flaxseed derived Maillard reaction products based on iBAQ mass spectrometry and molecular sensory science[J].Food Chemistry:X, 2022, 13:100224.

[26] 黄梅桂. 大豆肽美拉德反应体系中色泽抑制及其机理研究[D].无锡:江南大学, 2012.Huang M G.Study on color inhibition and its mechanism in soybean peptide Maillard reaction system[D].Wuxi:Jiangnan University, 2012.

[27] Zhu J W, Xia X, Zhang F X, et al.Taste characteristic and the mechanism of light-colored Maillard reaction products derived from gluten hydrolysate[J].Food Bioscience, 2023, 52:102394.

[28] Shakoor A, Zhang C P, Xie J C, et al.Maillard reaction chemistry in formation of critical intermediates and flavour compounds and their antioxidant properties[J].Food Chemistry, 2022, 393:133416.

[29] 温青玉, 张雨, 李天齐,等, 面筋蛋白咸味肽的分离纯化及结构鉴定[J].食品科学, 2023, 44(4):194-199.Wen Q Y, Zhang Y, LI T Q, et al.Isolation, purification and structure identification of salty peptides from wheat gluten[J].Food Science, 2023, 44(4):194-199.

[30] Zhang Y, Gao X C, Pan D D, et al.Isolation, characterization and molecular docking of novel umami and umami-enhancing peptides from Ruditapes philippinarum[J].Food Chemistry, 2021, 343:128522.

[31] Prosser L C, Talbott J M, Garrity R P, et al.C-terminal arginine-selective cleavage of peptides as a method for mimicking carboxypeptidase B[J].Organic Letters, 2023, 25(33):6206-6210.

[32] Gao B H, Hu X B, Xue H, et al.Isolation and screening of umami peptides from preserved egg yolk by nano-HPLC-MS/MS and molecular docking[J].Food Chemistry, 2022, 377:131996.

[33] Wang R, Feng X R, Gong Z H, et al.Decoding of salty/saltiness-enhancing peptides derived from goose hemoglobin and the interaction mechanism with TMC4 receptor[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2024, 72(34):19107-19119.

[34] Chen X, Guo C F, Cao J X, et al.Exploring the characteristics and mechanisms of novel salt taste-enhancing peptides from porcine bone collagen via virtual screening, sensory evaluation, and molecular dynamics simulations[J].Food Chemistry, 2025, 495(Pt 1):146416.

[35] 彭思念, 赵子莹, 汤华成, 等. 酵母咸味肽的酶法制备及其呈味特性研究[J]. 食品与发酵工业, 2026, 52(3):139-147.Peng S N, Zhao Z Y, Tang H C, et al. Enzymatic preparation of salty peptides from yeast and their taste properties[J]. Food and Fermentation Industries, 2026, 52(3):139-147.

Preparation optimization and flavor characterization of light-colored Maillard salty peptides from Hypsizygus marmoreus

LANG Yonghua1,2,3, YANG Siyu2,3, HOU Guohua1,2,3, MIAO Song1,2,3, ZHANG Longtao1,2,3, DENG Kaibo1,2,3*

1(Engineering Research Centre of Fujian-Taiwan Special Marine Food Processing and Nutrition, Ministry of Education, Fuzhou 350002, China)

2(College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

3(China-Ireland International Research Centre of Food Material Science and Structure Design, Fuzhou 350002, China)

ABSTRACT To obtain light-colored Maillard salty peptides from Hypsizygus marmoreus, this study applied a two-step enzymatic hydrolysis strategy and evaluated the effects of cysteine (Cys) inhibitors and reaction parameters on browning index.The results showed that initial pH and Cys addition significantly affected the browning index and color difference (P<0.05).The optimal conditions were a reaction temperature of 86 ℃, an initial pH of 9.5, and 1% Cys addition, producing a light-colored product with an A420 value of 0.122 and a balanced salty-umami profile.Fractionation and sensory evaluation indicated that peptides <1 kDa generated the strongest saltiness perception.Fourteen candidate peptides were identified by mass spectrometry.These peptides were modeled and docked with a constructed TMC4 salty taste receptor.BIOPEP-UWM scores, binding affinity, and peptide characteristics together highlighted five signature salty peptides:FDDGLR, DDHPWNKPQ, DDHPW, DDAA, and FDDL.Hydrogen bonding and hydrophobic interactions dominated the binding process, and residues such as Gln and Lys served as key interaction sites.Additionally, bioinformatics analysis predicted that these peptides exhibit no toxicity or allergenicity and possess high biological activity potential.This study provides a theoretical basis for developing light-colored salty peptides from H.marmoreus and offers a novel pathway for achieving “salt reduction without sacrificing saltiness” in low-color foods.

Key words Hypsizygus marmoreus;light-colored Maillard salty peptides;molecular docking;salt reduction

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.045295

引用格式：郎永花,杨思雨,侯国华,等.海鲜菇浅色美拉德咸味肽的制备优化和呈味特性研究[J].食品与发酵工业,2026,52(19):150-160.LANG Yonghua, YANG Siyu, HOU Guohua, et al.Preparation optimization and flavor characterization of light-colored Maillard salty peptides from Hypsizygus marmoreus[J].Food and Fermentation Industries,2026,52(19):150-160.

第一作者：硕士研究生(邓凯波副教授为通信作者,E-mail:dkbfst@163.com)

基金项目：“十四五”国家重点研发计划重点专项(2022YFD2101305);福厦泉自创区协同专项(3502ZCQXT2021005);校级大学生创新创业训练计划(FAFUXMPC20250429001-00141)

收稿日期：2025-11-26,改回日期：2026-02-06