生鲜果蔬在贮运过程中易发生失水皱缩、组织软化、微生物腐败及营养品质下降等问题,因此开发安全、绿色且兼具保湿、阻隔和抑菌功能的生物基活性包装材料具有重要意义[1]。水凝胶因含水量高、三维网络可调、柔韧性好且易负载活性成分,近年来逐渐被用于果蔬、肉制品和水产品保鲜领域,可通过亲水网络维持局部湿度,并作为抗氧化剂、抗菌剂、纳米填料或指示因子的载体,实现保湿、缓释和界面调控等功能[2]。然而,单一高分子水凝胶通常存在机械强度不足、阻隔性能有限及活性组分易迁移或失活等问题[2]。现有的较强韧水凝胶如互穿网络与双网络水凝胶多依赖氢键、链缠结等弱相互作用,应力传递与增韧效果有限[3]。
聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)含有亲水性羟基和疏水性乙酰基,成膜性、柔韧性和机械性能优良,是食品包装常用基体,但缺乏抗菌活性。壳聚糖及其衍生物因来源广泛、生物相容性好而被广泛用于食品包装[4],其中壳聚糖季铵盐(hydroxypropyltrimethyl ammonium chloride chitosan,HACC)作为水溶性阳离子聚合物,兼具吸湿性、凝胶性和广谱抑菌活性[5]。本研究采用双网络水凝胶增韧策略,以PVA构建第一网络、HACC作为弹性第二网络,并通过柠檬酸与PVA/HACC分子链上的羟基或氨基发生酯化/酰胺化反应,实现两网络化学共价互联,提升水凝胶结构稳定性、力学性能和基础抑菌能力。
果蔬抗菌保鲜常用碳基纳米材料[6]、金属及其氧化物纳米颗粒[7]、噬菌体或抗菌肽[8]等,但存在耐药性、效率不足或安全性不明等问题。因此,开发安全温和且可稳定结合于基体的天然抗菌/抗氧化组分尤为重要。姜黄素分子(curcumin, C)含酚羟基、β-二酮结构及共轭结构,具有较强抗氧化和抗菌活性,但水溶性及光热稳定性较差[9];花青素分子(anthocyanins, A)共轭体系丰富,含酸碱基团,易溶于极性溶剂,兼具抗氧化与环境响应特性,但易受光、热和pH影响降解,直接加入包装体系易发生降解和颜色失稳[10]。二者极性和作用机制不同,共同引入可实现抗菌/抗氧化功能互补与协同增效[11],而直接添加难以满足长期稳定保鲜需求[9-10]。金属有机骨架(β-cyclodextrin metal-organic framework,metal organic framework, MOF)具有高比表面积、可调孔道和优良包载能力,在活性成分保护与缓释等方面前景良好。β-环糊精金属有机骨架(β-cyclodextrin metal-organic framework,β-CD-MOF)由环糊精和碱金属离子构筑,兼具生物相容性、可降解性及主体-客体包合作用,可利用其“内疏水、外亲水”的结构特点共负载极性差异的姜黄素和花青素(curcumin/anthocyanin-loaded β-CD-MOF,C/A@β-CD-MOF),提升其分散性、稳定性和持续作用能力[12]。
此外,TiO2具有良好的化学稳定性和光催化活性,光照下可产生活性氧损伤微生物细胞膜、蛋白质和核酸[13];同时作为无机纳米填料可提高聚合物网络致密性和阻隔性能。将C/A@β-CD-MOF与TiO2共同引入PVA/HACC水凝胶体系,有望构建兼具接触抑菌、缓释抗菌/抗氧化和光催化抗菌的多机制协同活性包装材料。
果蔬采后腐败受失水、呼吸代谢、氧化胁迫、组织软化以及微生物侵染等多因素影响,单一抗菌指标难以全面反映保鲜效果[1]。本研究以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为模型菌株评价复合水凝胶的广谱抗菌性能,采用DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除实验考察其抗氧化活性,并通过Caco-2细胞活性评价初步验证其体外生物相容性;并以小米蕉为保鲜对象,结合失重、腐败、硬度和表面自然微生物变化等指标,考察其在非直接接触式覆盖条件下的综合保鲜效果,为开发安全、高效的生物基活性包装材料提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
PVA(分子质量17×104～22×104 g/mol,醇解度87.0～89.0 mol%),山东科源生化有限公司;HACC(取代度91.2%),源叶生物科技有限公司;蓝莓花青素(25%,相对分子质量287.24)、姜黄素(98%,相对分子质量368.38)、KOH、KBr、CaCl2,麦克林生化科技有限公司;一水合柠檬酸,国药化学试剂有限公司;β-环糊精,北京索莱宝科技有限公司;LB肉汤,青岛海博生物技术有限公司;以上试剂均为国产分析纯。大肠杆菌(ATCC 25922)和金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)由中国海洋大学实验室提供,小米蕉购买于青岛市黄岛区悦和花街家家悦超市。
1.2 仪器与设备
SHJ-4A数显磁力搅拌水浴锅,普天仪器制造有限公司;SN-MS-6D磁力搅拌器、SN-QX-65超声波清洗器,尚仪仪器设备有限公司;Nicolet iS10傅里叶红外光谱仪,赛默飞世尔科技公司;TMS-TOUCH质构仪,FTC公司;ZEISS EVO10扫描电子显微镜,德国蔡司;OCA15EC接触角测量仪,奥德丽诺有限公司;UV-2550紫外分光光度计,日本岛津。
1.3 实验方法
1.3.1 β-CD-MOF及C/A@β-CD-MOF的制备
C/A@β-CD-MOF合成流程如下:参照Yang等[14]的方法并适当调整,将β-环糊精(1.42 g)和KOH(0.56 g)溶于40 mL去离子水中,室温搅拌1 h使其充分溶解,随后转移至含甲醇体系的容器中静置结晶。所得晶体经无水乙醇洗涤后,经二氯甲烷活化并真空干燥,获得β-CD-MOF。随后,称取β-CD-MOF 100 mg分散于20 mL 90%(体积分数)乙醇溶液中,分别加入姜黄素和花青素各20 mg,避光条件下室温振荡吸附24 h。4 000 r/min离心10 min,经90%(体积分数)乙醇溶液洗涤3次后真空干燥,得到C/A@β-CD-MOF。
采用紫外-可见分光光度法测定姜黄素和花青素的包埋率。吸附前分别测定姜黄素和花青素初始溶液的吸光度,吸附结束后收集上清液和洗涤液,分别测定其中未被负载的姜黄素和花青素含量。姜黄素检测波长为425 nm,花青素检测波长为520 nm,按公式(1)计算包埋率:
包埋率
(1)
式中:m0,初始加入的姜黄素或花青素质量,mg;m1,吸附后上清液和洗涤液中未被负载的姜黄素或花青素总质量,mg。
1.3.2 PVA/HACC复合水凝胶的制备
参照Min等[15]的方法并适当调整,称取5.556 g PVA加入50 mL去离子水,90 ℃搅拌2 h至溶解。将TiO2分散于去离子水中,超声波处理后加入上述溶液。随后加入质量分数为3%的HACC,在70 ℃下继续搅拌1 h。接着加入4%质量分数C/A@β-CD-MOF,超声波分散均匀后,缓慢滴加2 mL 50%(质量分数)柠檬酸溶液,40 ℃下反应30 min。将所得前驱液倒入聚四氟乙烯模具(90 mm×90 mm×2 mm)中,重复冻融4个循环(每个循环-20 ℃冷冻18 h,4 ℃解冻6 h),制得不同组分的复合水凝胶。样品分为4组:PVA+HACC为仅含PVA、HACC的基础水凝胶,PVA+HACC+TiO2为添加TiO2的复合水凝胶,PVA+HACC+C/A@β-CD-MOF为添加C/A@β-CD-MOF的复合水凝胶,PVA+HACC+C/A@β-CD-MOF+TiO2为添加TiO2和C/A@β-CD-MOF的复合水凝胶。
参照Morarad等[16]的方法并适当调整,称取1 g含C/A@β-CD-MOF的复合水凝胶样品,置于5 mL PBS-乙醇混合释放介质中,室温避光振荡释放。分别于0.5、1、2、4、8、12、24 h取0.5 mL释放液,并补加等体积新鲜释放介质。静置或低速离心去除凝胶碎片后,以相同组成但未负载姜黄素和花青素的水凝胶释放液为空白校正,分别于425 nm和520 nm处测定姜黄素和花青素含量,按公式(2)、公式(3)计算释放率:
(2)
释放率
(3)
式中:Ct,第t个取样点释放液中活性物质量浓度,mg/mL;V0,释放介质总体积,mL;Ci,第i个取样点释放液中活性物质量浓度,mg/mL;Vs,每次取样体积,mL;mt,t时刻姜黄素或花青素的累计释放质量,mg;mL,参与释放实验的水凝胶样品中姜黄素或花青素的实际负载质量,mg。
1.3.3 微观形貌
水凝胶冻干后经液氮脆断,置于导电胶上喷金处理后采用扫描电子显微镜(5 kV)观察断面孔洞结构及填料分布。
1.3.4 红外结构表征
采用KBr压片法,将样品与适量KBr粉末(质量比1∶100)研磨均匀,压片后放入样品室待测。扫描范围4 000～500 cm-1,分辨率4 cm-1,扫描32次。
1.3.5 基本性能测定
1.3.5.1 水分含量测定
将不同组分水凝胶裁切为30 mm×30 mm的片状,去除表面游离水后称量初始质量,记为M0。随后将样品置于105 ℃恒温干燥箱中干燥至恒重,称量干燥后质量,记为Mt。水分含量按公式(4)进行计算:
水分含量
(4)
式中:M0,干燥前水凝胶质量,g;M1,干燥至恒重后样品质量,g。
1.3.5.2 色差
将不同组分水凝胶裁切为30 mm×30 mm的片状,去除表面游离水后置于标准白板背景上。经标准白板和黑板校准后,随机选取3个位置测定样品表面的L*、a*和b*值,按公式(5)计算。
(5)
式中:L*、a*、b*,样品色度值;
组色度值。
1.3.6 物理屏障性能
1.3.6.1 水接触角
将冻干水凝胶样品固定于载物台上,采用5 μL去离子水液滴进行静态接触角测定,并在10 s内读取接触角。
1.3.6.2 水蒸气透过率
参照Caz
n等[17]的方法并适当调整,在烧杯中加入10 mL去离子水,将待测材料裁剪后(记录面积为S)覆盖杯口,使用封口膜沿杯口边缘密封。称量密封杯总质量W0后,置于含CaCl2的密闭恒温恒湿环境[(40±2) ℃]中模拟渗透条件,每24 h取出转移至干燥箱(25±2) ℃平衡30 min,并记录质量W1,时间为T。按公式(6)计算:
水蒸气透过率
(6)
1.3.6.3 溶胀率
参照水凝胶溶胀性能测定方法[18]并适当调整,冻干后的水凝胶称质量后(m0)完全浸没于去离子水中,25 ℃静置溶胀。每隔一定时间取出样品,用滤纸去除表面多余水分后称量,记为mt。连续2次称量质量变化不明显时,即为溶胀平衡。每组样品平行测定3次,溶胀率按公式(7)计算:
溶胀率
(7)
式中:m0,冻干后水凝胶样品的初始干重,g;mt,溶胀一定时间后水凝胶样品的质量,g。
1.3.7 力学性能测试
采用TPA测试程序对不同样品(20 mm×20 mm)的硬度、弹性、内聚性、破裂力及挤压做功等指标进行测定,以评价材料网络的承载能力和变形恢复能力。
1.3.8 抑菌性能及抗氧化性能测定
1.3.8.1 抑菌性能测定
参考文献[19]的方法并进行适当调整,采用OD600法评价不同样品的抑菌效果。将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别接种于LB液体培养基,37 ℃振荡培养至对数生长期(OD600=0.6)。取1 mL菌悬液与无菌水凝胶样品共置于离心管中,37 ℃恒温光照环境(λ=365 nm)振荡孵育24 h。静置去除凝胶碎片后取上清液,以未加样品的菌液为空白对照,并设置样品空白校正组。采用紫外分光光度计测定600 nm波长下的吸光度(OD600)。抑菌率按公式(8)计算:
抑菌率
(8)
式中:OD0,对照组OD600; OD1,样品处理组OD600; OD2,样品空白组OD600。
1.3.8.2 抗氧化性能测定
参照Wang等[20]的方法并适当调整,采用DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除法评价水凝胶抗氧化性能。将不同组分水凝胶裁剪成小块,称取1 g样品加入10 mL 50%(体积分数)乙醇溶液中,室温避光振荡浸提4 h,取浸提液备用。
DPPH 测定时,取2 mL样品浸提液与2 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液混合,避光反应30 min,于517 nm 处测定吸光度。ABTS测定时,将ABTS阳离子工作液稀释至734 nm处吸光度为0.70±0.02,取0.2 mL样品浸提液与3.8 mL ABTS阳离子工作液混合,避光反应6 min,于734 nm处测定吸光度。以不加样品浸提液的体系为空白对照,并设置样品本底组扣除水凝胶浸提液自身颜色干扰。自由基清除率按公式(9)计算:
DPPH自由基清除率
(9)
式中:A1,样品组的吸光度;A2,样品本底校正组的吸光度;A0,对照组的吸光度。
1.3.9 生物相容性评价
参照Suhail等[21]的方法并适当调整,采用MTT法评价不同水凝胶对Caco-2细胞活性的影响。将各组水凝胶裁剪为大小一致的片状样品,经紫外灭菌后加入完全培养基中,于37 ℃条件下浸提24 h,取浸提液备用。将Caco-2细胞接种于96孔板中,接种密度为1×104 细胞/孔,每孔加入100 μL完全培养基,于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h使其贴壁。随后弃去原培养基,加入水凝胶浸提液,继续培养24 h。培养结束后,弃去孔内液体,每孔加入100 μL MTT工作液(质量浓度0.5 mg/mL),于37 ℃避光孵育4 h。随后弃去上清液,每孔加入150 μL DMSO,振荡10 min溶解结晶,并在570 nm处测定吸光度。设置无细胞样品空白孔,用于扣除样品颜色干扰。细胞存活率按公式(10)计算:
细胞存活率
(10)
式中:As,样品吸光度;Asb,无细胞的样品空白孔吸光度;Ac,阴性对照组吸光度;Ab,无细胞、无样品的培养基空白孔吸光度。
1.3.10 模拟保鲜实验
选取成熟度一致、无机械损伤的小米蕉为模型。将小米蕉分别置于相同烧杯,杯口上方用不同水凝胶覆盖,置于(25±1) ℃,相对湿度65%～70%的光照(λ=365 nm)环境中,每隔3 d测定指标,持续9 d。实验设置未覆盖水凝胶的空白对照组以及不同水凝胶处理组,相关保鲜评价指标和贮藏观测思路参考果蔬涂膜/包装保鲜研究中的常用方法进行设置[2]。
1.3.10.1 失重率
记录果实初始质量(M0),自第0天起每间隔3 d于固定时段进行质量复测(Me),按公式(11)计算失重率:
失重率
(11)
1.3.10.2 腐烂指数
依据香蕉病斑面积占比划分3级:0级(无病斑)、1级(≤1/3病斑)、2级(>1/3病斑),统计各等级果数后按公式(12)量化腐败程度:
腐烂指数
(12)
1.3.10.3 硬度变化率
硬度测试则使用硬度计,垂直于被测香蕉表面,探头以1 mm/s下压至50%应变,记录初始硬度H0,间隔固定时间测量Ht。按公式(13)计算:
硬度变化率
(13)
1.3.10.4 微生物指标
参照GB 4789.2—2022 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》和GB 4789.15—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》进行测定并进行适当调整,检测小米蕉果皮表面自然携带并在贮藏过程中增殖的微生物群落。取不同处理组小米蕉样品,称取5.00 g果皮,加入45 mL无菌稀释液(无菌生理盐水或无菌蛋白胨水),均质2 min后制备10-1样品匀液,并进行梯度稀释。菌落总数测定时,取适宜稀释度样液接种于平板计数琼脂培养基,于37 ℃培养1～2 d后计数;霉菌和酵母计数时,取适宜稀释度样液接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基,于28 ℃培养3 d后计数,结果以lg CFU/g表示。
1.4 数据处理
所有测量数据至少进行3次重复实验,结果以“平均值±标准偏差”表示。统计分析使用SPSS 17软件进行方差分析(ANOVA)及Duncan多重范围检验,差异在95%置信水平下(P<0.05)被认为具有统计学意义。所有数据可视化使用Origin 2021软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 微观形貌
由图1-b可见,基础水凝胶呈现典型的层状多孔结构,层片排列规整,层间距较大,孔壁平整,该结构来源于冻融过程中冰晶生长与PVA结晶形成的孔隙,有利于储水和增强柔韧性[22],但较大孔径会削弱力学强度与阻隔性能。引入C/A@β-CD-MOF[姜黄素负载率(84.10±5.71)%,花青素负载率(76.28±4.25)%]后,层状结构仍存在,但层间出现颗粒填充,层间距减小,表面粗糙度增加。C/A@β-CD-MOF颗粒插入PVA/HACC层间,通过物理填充及其羟基与PVA形成氢键,增强界面作用,使得网络更为致密。添加TiO2后,层状特征趋于模糊,断面相对平滑致密,仅见少量纳米级颗粒分散。结合图1-a可见,C/A@β-CD-MOF颗粒表面未观察到明显姜黄素或花青素晶体析出、连续包覆层或大块沉积物,初步说明活性物质并非主要以宏观表面堆积形式存在,而更可能受到β-CD疏水空腔、MOF孔道及分子间作用的共同限域与稳定化。引入TiO2后,水凝胶层状特征减弱,断面更加平滑致密,可能与小粒径TiO2(～25 nm)填充层片间隙或无定形区有关[13]。同时添加C/A@β-CD-MOF和TiO2时,水凝胶呈现最为致密的微观形貌,层状特征基本消失,表面布满颗粒状突起与褶皱,表明二者产生协同填充效应。TiO2可能锚定于MOF表面及PVA基体中,形成了多级复合结构,通过填料缠结及多重氢键增强网络密度和界面结合力,为后续力学性能与阻隔性能的提升提供了结构基础。总体而言,复合填料可协同构建更致密的网络结构,有利于提升材料的力学性能和阻隔性能。
a-C/A@β-CD-MOF的SEM;b-不同组分水凝胶横截面的SEM
图1 C/A@β-CD-MOF与不同组分水凝胶横截面的SEM图像
Fig.1 SEM images of C/A@β-CD-MOF and cross-sections of different hydrogels
2.2 红外结构表征
FTIR光谱(图2-a)表明,各组样品均保留了PVA/HACC基体在3 500～3 200 cm-1、2 920 cm-1、1 650 cm-1 及1 300～1 000 cm-1区域的主要特征吸收峰,说明C/A@β-CD-MOF和TiO2的引入未明显破坏PVA/HACC主链结构。PVA+HACC基体在1 716 cm-1附近C
O吸收峰的出现或增强,结合C—O/C—O—C区域峰形变化,表明柠檬酸与PVA/HACC发生酯化交联;同时,冻融过程促进PVA结晶,共同构建化学-物理双网络结构。引入C/A@β-CD-MOF后,1 150～1 000 cm-1区域吸收增强,1 600～1 400 cm-1区域峰形趋于复杂,且羟基宽峰发生红移和展宽,说明C/A@β-CD-MOF与PVA/HACC之间存在氢键和界面作用。TiO2引入后,700～500 cm-1区域Ti-O-Ti振动增强,双填料组羟基区变化更明显,表明C/A@β-CD-MOF、TiO2与PVA/HACC之间形成了更强的多组分相互作用,有利于提高网络致密性和结构稳定性。
a-不同组分水凝胶的傅里叶红外光谱;b-柠檬酸交联形成水凝胶示意图;c-水凝胶中姜黄素和花青素的释放率
图2 不同组分水凝胶的傅里叶红外光谱、柠檬酸交联形成水凝胶示意图及水凝胶中姜黄素和花青素的释放率
Fig.2 FTIR spectra of hydrogels with different compositions, schematic illustration of citric acid-mediated crosslinking for hydrogel formation, and release profiles of curcumin and anthocyanins from the hydrogels
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
结合C/A@β-CD-MOF制备过程中洗涤和扣除上清液和洗涤液中未负载活性物的包埋率计算方式,以及姜黄素和花青素释放行为(图2-c)可知,水凝胶中活性物呈持续缓慢释放,未出现明显初期突释。已有研究表明,水凝胶中表面吸附或未充分限域的活性物通常更易在释放初期快速扩散,而包覆或网络限域可降低突释并延缓释放过程[23-24]。该结果说明体系中不存在大量易脱附的表面游离态或弱吸附态活性物,其缓释行为可能来源于β-CD-MOF孔道/β-CD疏水空腔的限域作用,以及PVA/HACC网络对扩散过程的阻滞作用,表明C/A@β-CD-MOF可作为稳定负载与缓释载体,并通过界面作用参与水凝胶网络构建。
2.3 基本性能分析
由图3和表1可见,不同填料的引入显著影响了PVA/HACC网络的含水量与光学外观。PVA+HACC组水分含量最高,而加入TiO2和C/A@β-CD-MOF后水分含量呈下降趋势,双组分复合组最低,表明填料通过颗粒填充、氢键作用以及MOF孔道限域参与网络构建,使PVA/HACC亲水网络更加致密,从而减少自由水滞留。色差变化进一步印证了各组分在体系中的有效引入:TiO2组L*值显著升高(P<0.05),表明其强光散射作用提高了材料白度;C/A@β-CD-MOF组a*和b*值增加,说明姜黄素/花青素负载体系使水凝胶呈现黄褐色调;而双组分组同时表现出较高L*和b*值,说明TiO2的增白效应并未完全掩盖C/A@β-CD-MOF的颜色贡献,二者共同形成浅黄白或褐白色外观。
表1 不同水凝胶的水分含量和色差
Table 1 Water content and color difference of different hydrogels
组别水分含量/%L*a*b*ΔEPVA+HACC85.34±0.90a86.82±1.73b-0.41±0.23c2.06±0.89b—PVA+HACC+TiO283.85±0.94ab92.84±1.45a-0.87±0.34c2.49±0.88b6.09±1.46bPVA+HACC+C/A@β-CD-MOF82.28±0.87b80.84±2.15c1.89±0.87b9.93±2.23a10.47±0.75aPVA+HACC+C/A@β-CD-MOF+TiO280.56±0.91c88.36±2.14b0.95±0.61a9.84±2.36a8.12±2.70ab
注：同列不同的小写字母表示组别间具有显著差异(P<0.05)。
图3 不同组分水凝胶的实物图
Fig.3 Photographs of hydrogels with different compositions
2.4 物理屏障性能
由图4-a和图4-b可知,不同组分显著影响复合水凝胶的表面润湿性与水蒸气阻隔性能(P<0.05)。基础组PVA+HACC的接触角最高(56.1°),表现出相对较强疏水性;加入TiO2和C/A@β-CD-MOF后,接触角均降低,双填料组进一步降至(27.30±0.19)°,说明TiO2表面羟基、β-CD-MOF中丰富羟基以及多孔结构共同提高了表面极性和润湿性。与接触角变化一致,水蒸气透过率由基础组的(1 810.80±131.10) g·m-2·d-1显著降至(1 359.90±111.50)、(1 310.10±79.10)、(1 211.00±45.00) g·m-2·d-1,其中双填料组最低,说明TiO2和C/A@β-CD-MOF在聚合物网络中形成了更有效的物理屏障,通过填充效应、氢键作用及曲折路径效应延长水分扩散路径、降低自由体积,从而提升阻湿性能[25]。
a-不同组分水凝胶的接触角;b-不同组分水凝胶的水蒸气透过率;c-不同组分水凝胶的溶胀比
图4 不同组分水凝胶的接触角、水蒸气透过率和溶胀比
Fig.4 Water contact angle, water vapor transmission rate, and swelling ratio of different hydrogels
注:不同的小写字母表示具有显著差异(P<0.05)(下同)。
图4-c表明,各组样品在0～12 h内溶胀率快速升高,随后逐渐趋于平衡。24 h时,PVA+HACC基础组溶胀率最高[(671.58±56.77)%],说明其网络结构较疏松,亲水基团暴露较多,水分更易进入凝胶内部。加入TiO2后,溶胀率有所下降,表明其填充和界面作用在一定程度上限制了PVA/HACC分子链扩张。加入C/A@β-CD-MOF后进一步降低至(582.52±30.66)%,说明C/A@β-CD-MOF通过骨架支撑、孔隙填充和氢键作用提高凝胶网络致密性,从而限制水分过度进入。双填料复合组溶胀率最低[(531.60±31.04)%],表明TiO2和C/A@β-CD-MOF协同作用构建了更紧密的凝胶网络,有效抑制水分吸收和链段膨胀。
2.5 力学性能分析
图5表明,各组分对复合水凝胶的质构特性具有显著影响(P<0.05)。基础组PVA+HACC的硬度、弹性、内聚性、起始模量、破裂力和挤压做功分别为(2.27±0.33) N、(0.78±0.05) mm、(0.91±0.03)、(1.59±0.22) N/mm、(1.89±0.15) N和(0.70±0.03) N·mm。引入TiO2后,硬度、起始模量和破裂力均有所提升,说明TiO2纳米粒子的填充补强作用增强了网络刚性;但弹性、内聚性和挤压做功分别有所下降,表明其单独添加虽能提高刚性,却不利于柔韧性保持。相较之下,PVA+HACC+C/A@β-CD-MOF组的弹性、内聚性和挤压做功均高于基础组,说明C/A@β-CD-MOF多孔骨架有助于提升形变恢复能力和耗能性能[26]。双填料复合组PVA+HACC+TiO2+C/A@β-CD-MOF表现出最佳综合力学性能,其硬度、弹性、内聚性、起始模量和破裂力分别达到(3.18±0.08) N、(2.42±0.19) mm、(1.05±0.04)、(2.29±0.31) N/mm和(2.41±0.08) N,均为4组中最高或接近最高,说明TiO2的刚性增强作用与C/A@β-CD-MOF的结构缓冲和界面作用发生了协同效应。虽然其挤压做功低于C/A@β-CD-MOF单填料组,但仍高于TiO2组,说明双填料体系在刚性和韧性之间实现了更优平衡,更有利于构建兼具承载性、抗变形能力和结构稳定性的食品包装网络。
图5 不同组分水凝胶的力学性能
Fig.5 Mechanical properties of different hydrogels
2.6 复合水凝胶抑菌性能及抗氧化性能分析
如图6所示,4组水凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均表现出一定抑制作用,且组间差异显著(P<0.05)。PVA/HACC基础组具有一定抑菌能力,主要归因于HACC中季铵基团可通过静电作用破坏细菌细胞膜[5];引入TiO2后,抑菌率明显提高,说明其在光照条件下产生的活性氧可进一步损伤细胞膜、蛋白质和核酸[13]。相比之下,C/A@β-CD-MOF的单独加入虽可增强抑菌效果,但其作用更偏向于稳定负载姜黄素和花青素,并实现活性成分的持续释放。双填料组PVA/HACC/C/A@β-CD-MOF/TiO2对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别达到(84.27±3.18)%和(91.36±2.69)%,显著高于其他组,表明HACC接触抑菌、TiO2光催化氧化杀菌及C/A@β-CD-MOF活性物质保护缓释之间存在协同作用。
a-不同组分水凝胶的抑菌性能;b-不同组分水凝胶的抗氧化性能
图6 不同组分水凝胶的抑菌性能和抗氧化性能
Fig.6 The antibacterial and antioxidant properties of hydrogels with different compositions
同时,不同组分水凝胶的抗氧化性能也存在显著差异(P<0.05)。PVA/HACC基础组自由基清除能力较弱,加入TiO2后略有提高,而引入C/A@β-CD-MOF后DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除率显著升高,主要与姜黄素和花青素中酚羟基、共轭结构的供氢和供电子能力有关。双填料组表现出最高抗氧化活性,说明C/A@β-CD-MOF对活性物质的保护缓释作用与TiO2对网络结构的增强作用共同提高了体系的持续抗氧化能力。总体来看,该复合水凝胶通过接触抑菌—光催化杀菌—活性物质缓释—自由基清除的多机制协同作用,提高了材料的抗菌和抗氧化性能,为延缓果蔬微生物腐败、氧化褐变及品质劣变提供了重要支撑。
2.7 复合水凝胶的生物相容性分析
图7中不同组分水凝胶浸提液处理后的Caco-2细胞存活率均保持在80%以上,远高于细胞毒性判定阈值(70%)[27],表明所有样品无明显细胞毒性,具有良好细胞相容性。与对照组相比,PVA/HACC基体组及TiO2添加组细胞存活率无显著差异,表明水凝胶基体及该添加水平下的TiO2对细胞活性影响较小;C/A@β-CD-MOF的引入使细胞存活率有所降低,可能与活性物质缓慢释放、MOF颗粒界面作用及局部微环境变化有关。双填料复合组PVA/HACC/C/A@β-CD-MOF/TiO2细胞存活率为(82.70±4.31)%,虽显著低于对照组,但仍高于70%阈值,说明其未造成明显细胞毒性。总体而言,该复合水凝胶在增强抗菌、抗氧化功能的同时仍保持可接受的细胞相容性,可为其果蔬保鲜应用提供初步安全性依据。
图7 不同组分水凝胶的生物相容性
Fig.7 Biocompatibility of different hydrogels
2.8 复合水凝胶的模拟保鲜效果
由图8和表2可见,随贮藏时间延长,各组小米蕉均出现不同程度的失水、褐变、软化和腐败,但不同水凝胶处理的保鲜效果存在显著差异(P<0.05)。空白组和PVA+HACC组在6 d后果皮褐斑和腐败斑迅速增加,9 d时组织塌陷和表面腐败较为明显,说明单一覆盖或基础水凝胶虽具一定覆盖作用,但对水分散失、组织软化和微生物侵染的抑制有限。相比之下,PVA+HACC+C/A@β-CD-MOF+TiO2组在9 d时仍保持较完整的果形和较低腐败程度,其失重率、腐烂指数和硬度变化显著优于其他处理组[分别为(3.55±0.08)%、(18.20±1.00)%和(-14.10±1.20)%],表明双填料复合水凝胶能够更有效维持果实品质。保鲜效果与水凝胶结构和性能密切相关。结合前述结果分析,SEM与FTIR结果表明,TiO2与C/A@β-CD-MOF协同构建了更致密的多级网络结构,并通过填充效应、氢键及界面作用增强了网络稳定性;较低的水蒸气透过率和溶胀率说明复合体系具有更好的阻湿与保水能力,可减缓果实水分散失和组织软化。同时,双填料组优异的力学性能有助于维持包装结构稳定,为长期覆盖保鲜提供支撑。
表2 不同处理下小米蕉的菌落总数与霉菌和酵母菌总数 单位:lg CFU/g
Table 2 Total colony count and total mold and yeast count of emperor bananas under different treatments
组别菌落总数霉菌和酵母总数第0天第3天第6天第9天第0天第3天第6天第9天空白对照2.38±0.06Da3.86±0.18Ca5.62±0.34Ba7.03±0.47Aa1.88±0.07Da3.24±0.21Ca4.92±0.37Ba6.12±0.44AaPVA+HACC2.35±0.09Da3.52±0.16Cb5.04±0.29Bb6.33±0.41Ab1.86±0.10Da2.93±0.17Cb4.41±0.33Bab5.56±0.39AabPVA+HACC+TiO22.33±0.07Da3.27±0.22Cbc4.63±0.31Bbc5.82±0.36Abc1.84±0.06Da2.68±0.19Cbc3.97±0.26Bbc5.06±0.35AbcPVA+HACC+C/A@β-CD-MOF2.32±0.11Da3.05±0.15Ccd4.28±0.27Bcd5.35±0.32Acd1.82±0.09Da2.45±0.14Ccd3.52±0.25Bcd4.54±0.30AcdPVA+HACC+C/A@β-CD-MOF+TiO22.30±0.08Da2.76±0.13Cd3.89±0.24Bd4.80±0.28Ad1.81±0.05Da2.18±0.12Cd3.06±0.23Bd4.02±0.27Ad
注：同列不同的小写字母表示组别间具有显著差异,同行的大写字母表示不同时间具有显著差异(P<0.05)。
a-不同保鲜条件下小米蕉外观变化;b-不同保鲜条件下小米蕉的失重率和腐烂指数;c-不同保鲜条件下小米蕉的硬度变化率
图8 不同保鲜条件下小米蕉的外观变化、失重率、腐烂指数和硬度变化率
Fig.8 Changes in appearance, weight loss rate, decay index, and firmness change rate of emperor bananas under different preservation conditions
微生物结果进一步解释了不同处理组的腐败差异。随着贮藏时间延长,各组菌落总数和霉菌酵母计数均持续增加,说明常温高湿条件下小米蕉表面微生物不断增殖;但双填料组第9天菌落总数和霉菌酵母计数仅为(4.80±0.28)、(4.02±0.27) lg CFU/g,明显低于PVA+HACC组,表明其降低腐烂指数不仅与阻湿保水有关,也与微生物负荷降低密切相关。其中,HACC可通过阳离子基团破坏细胞膜稳定性,TiO2在365 nm光照下产生活性氧造成氧化损伤,而C/A@β-CD-MOF则依托β-CD-MOF的多孔结构和主体-客体作用,提高姜黄素和花青素的稳定性并维持其抗菌活性。多机制协同作用共同增强了体系对微生物的持续抑制能力。
本研究采用非接触式覆盖保鲜方式,水凝胶未直接接触小米蕉,其保鲜作用主要来源于包装微环境调控及活性组分的持续作用。类似地,Bai等[25]构建了Geraniol@β-CD-MOF非接触式保鲜包装,通过β-CD-MOF对挥发性香叶醇的限域保护和缓释,在包装空间内持续发挥抗菌作用,从而延缓帝王蕉腐败。相关研究也表明,活性包装材料可通过调控包装微环境、降低果实表面微生物负荷并延缓品质劣变来提升果蔬贮藏稳定性[28]。因此,本研究中双填料复合水凝胶较低的水蒸气透过率、稳定的网络结构以及协同抗菌作用,共同实现了对贮藏空间湿度、水分迁移和微生物生长的有效调控,从而延缓了小米蕉的品质劣变。
3 结论与讨论
本文以PVA/HACC为基体,通过柠檬酸化学交联与冻融物理交联协同构建双网络水凝胶,并引入C/A@β-CD-MOF和TiO2制备复合水凝胶。结果表明,C/A@β-CD-MOF和TiO2可通过氢键作用、界面相互作用及颗粒填充效应增强水凝胶网络致密性,从而改善材料的阻隔性、溶胀稳定性和力学支撑性能。同时,β-CD-MOF孔道及β-CD疏水空腔对姜黄素和花青素具有一定限域保护作用,结合PVA/HACC网络的扩散阻滞效应,实现了活性物质的稳定负载与持续释放。功能评价表明,PVA/HACC/C/A@β-CD-MOF/TiO2复合水凝胶兼具抗菌、抗氧化、生物相容性和非接触式保鲜功能。其保鲜效果主要来源于致密网络阻隔、水分迁移调控、活性物质缓释、自由基清除及TiO2光催化辅助抑菌等多机制协同作用,可有效延缓小米蕉贮藏过程中的失水、腐烂、软化和表面微生物增殖。总体来看,该材料在果蔬活性包装领域具有一定应用潜力,但其在不同果蔬体系中的适用性仍需进一步研究。
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