辅酶Q10(coenzyme Q10,CoQ10)是一种广泛存在于线粒体内,参与细胞呼吸链电子传递和调节能量代谢的脂溶性辅酶,并在抗氧化、心血管保护、抗炎及延缓衰老等方面具有显著生理作用[1]。其临床应用价值已在多个疾病领域得到研究证实。在心血管领域,CoQ10被用于心力衰竭(heart failure,HF)的辅助治疗。研究表明,患者心肌组织里的CoQ10含量和心功能分级呈现负相关关系,每日补充90～200 mg的CoQ10可有效改善临床症状并促进心肌结构重构[2]。在神经系统领域,CoQ10凭借预防偏头痛的作用获得美国神经病学学会的指南推荐,相关临床试验证实每日摄入400 mg能显著减少偏头痛发作次数[3]。针对帕金森病等神经退行性疾病存在的线粒体功能异常问题,多项研究都探讨了采用高剂量(300～2 400 mg/d)CoQ10进行辅助干预的可能性[4-5],不过值得特别注意的是,上述提及的所有临床应用都面临着共同挑战,即CoQ10固有的强疏水特性致使其口服生物利用度极低,这一瓶颈不仅造成了临床用药剂量比较大、患者个体反应存在显著差异,也在一定程度上解释了不同临床研究结论出现分歧的现象[6]。因此,开发高效稳定的CoQ10递送体系来提高其溶解性和生物可及性变得更有意义。
近年来,乳液及自乳化系统作为脂溶性药物递送的有效策略,逐渐受到关注。通过形成微小液滴并增大药物界面积,乳液体系可有效提升疏水活性分子的分散性与溶解速率[7],从而改善口服吸收效率。然而,提前把CoQ10制成液体乳剂存在一些不足情况,一方面CoQ10浓度过高会影响乳剂物理稳定性,另一方面在液体水环境中长时间存放时,CoQ10容易氧化分解进而失去部分活性[8]。针对这些问题自乳化药物递送系统被开发出来,该系统将药物、油性成分以及乳化剂一同溶解在芯液里,服用后能在胃肠道的蠕动作用下自动形成微米或纳米级乳滴[9],既保留了乳剂的吸收优点又保证了剂型的稳定性。磷脂类天然乳化剂在其中起关键作用,不仅能够降低油水界面张力[10]、形成稳定的水包油型乳液,还可以改善肠道膜的通透性,促进药物吸收[11]。然而,磷脂添加量的优化对于乳液微观结构、流变性质、物理稳定性及体内吸收的具体影响机制,目前尚缺乏系统研究。特别是和CoQ10乳液化相关的制剂中,粒径、界面电荷、液滴网络结构与药代动力学表现之间的关联尚未明确,这在一定程度上限制了相关产品配方设计的科学性和实用性。
基于此,本研究旨在通过调控磷脂浓度,开发一种具有高自乳化效率和高生物利用度的CoQ10软胶囊芯液,通过将芯液乳化,模拟其在胃肠道中的状态,系统研究乳化后乳液的粒径分布、zeta电位、微观形貌、流变学性质及离心加速稳定性等方面的性能表现。通过粒径和共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscopy,CLSM)分析磷脂对液滴大小及分布均一性的调控作用;结合流变学分析,探讨液滴密度和界面覆盖对乳液黏度及网络强度的影响;离心稳定性实验用于量化液滴聚集及乳析倾向,进而评估乳液的物理稳定性。
在体外表征的基础上,本研究进一步选取表现最优的配方进行大鼠口服药代动力学实验,并与CoQ10原料粉及市售制剂进行比较,以验证乳化后芯液的体外性能与体内生物利用度之间的一致性。研究旨在明确磷脂含量对CoQ10芯液乳化后乳液性能及吸收效果的影响规律,为CoQ10及其他疏水活性分子的高效口服递送提供理论依据与制剂优化策略,同时为未来临床及功能性产品的开发提供实践指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
CoQ10(C805246)、卵磷脂(L875435)、尼罗红(N815046)、甲酸(色谱级)、甲酸铵,上海麦克林生物科技有限公司;甲醇(色谱级)、异丙醇,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;除特别说明,其他化学试剂均为分析级。
1.2 仪器与设备
纳米粒度电位仪,英国马尔文仪器有限公司;6470B三重四极杆液质联用仪,美国安捷伦科技有限公司;H3-18KR台式高速冷冻离心机,中国可成仪器设备有限公司;MCR302流变仪,奥地利Anton Paar公司;LSM 880倒置共聚焦显微镜,德国Zeiss公司;LUMi-Sizer稳定性分析仪,德国LUMGmbH有限公司;HR-500高速剪切分散乳化机,上海沪析实业有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 CoQ10自乳化芯液及其乳液的制备
称取适量的磷脂加入到圆底烧瓶中,随后将其置于磁力搅拌水浴装置当中,在持续不断通入保护气体N2条件下,控制温度为85 ℃,以500 r/min的速率搅拌60 min,直到磷脂完全熔化成清澈透明的液体。随后, 按照0%(L0)、10%(L1)、20%(L2)、30%(L3)、40%(L4)的质量分数添加到葵花籽油中,然后分别添加CoQ10至辅酶含量为10%(质量分数)以制备成辅酶自乳化芯液;按照V(自乳化芯液)∶V(水)=1∶10的比例混合,在室温下借助高速剪切分散乳化机,以12 000 r/min的速率均质化处理5 min,进而制备出辅酶-磷脂自乳化乳液。
1.3.2 粒径和zeta电位测定
采用动态光散射(dynamic light scattering,DLS)法测定乳液平均粒径及zeta电位。测定前将样品以去离子水稀释至透明溶液。
1.3.3 流变特性
在剪切速率0.01～100 s-1对乳液样品的黏度进行测量。在0.5%应变条件下进行1～100 Hz频率扫描试验,测量乳液的储存模量(G′)和损耗模量(G″)。
1.3.4 微观结构
将样品滴加于载玻片上,加盖玻片封片后使用光学显微镜观察微观结构,进一步使用尼罗红溶液染色后通过CLSM进行成像观察。
1.3.5 离心稳定性测定
通过稳定性分析仪对乳液样品稳定性进行评估。实验条件:25 ℃、1 500 r/min离心 15 min。数据通过SepView 6.0软件处理,计算不稳定性指数。
1.3.6 大鼠药代动力学测定
1.3.6.1 动物实验
实验动物为6～8周龄的SPF级别雄性SD大鼠,购自河南斯克贝斯生物科技有限公司[许可证号:SCXK(豫)2020-0005]。动物在12 h光照/黑暗周期条件下饲养,适应性喂养1周。实验前禁食12 h,自由饮水。实验流程经南昌大学实验动物福利伦理委员会批准[批准文号:SYXK(赣)2021-0004]。大鼠随机分组,分别口服CoQ10芯液(60 mg/kg)或对照制剂,给药后 在0、1、2、4、8、12、24 h 通过眶后静脉取血,随后血液在4 ℃、3 000 r/min离心15 min,提取上层保存于-80 ℃ 待测。
1.3.6.2 血浆中CoQ10定量
取150 μL血浆,加入300 μL异丙醇,涡旋混匀5 min。8 000 r/min、离心5 min,取上清液,随后通过0.22 μm有机滤膜用于三重四极杆液质联用仪分析。CoQ10的分离程序依托Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱(2.1 mm×100 mm, 3.5 μm)进行,柱温30 ℃。流动相为V(5 mmol/L甲酸铵-甲醇)∶V(甲酸体积分数为0.1%的异丙醇溶液)=55∶45,设置0.8 mL/min的恒定流速。注射量10 μL。质谱分析采用多反应监测 (multi-reaction monitoring,MRM) 模式进行,正离子模式,裂解电压220 V,碰撞能40 eV,母离子880.7裂解为子离子碎片197.1。通过标准曲线(浓度与定量器离子峰面积)进行定量。
1.4 数据统计与分析
实验数据以“平均值±标准差”表示。药代动力学参数采用DAS 2.0软件计算。统计学分析采用SPSS 26.0软件,显著性水平设为 P<0.05。绘图使用Origin 2021与GraphPad Prism 8软件。除特别说明外,所有实验均重复3次以上。
2 结果与分析
2.1 不同配方芯液乳化所得的乳液外观
如图1所示,不添加磷脂时(L0),乳液发生严重分层,表明缺乏乳化剂无法形成稳定的乳状液体系。而当磷脂添加量(质量分数)增至10%(L1)、20%(L2)、30%(L3)和40%(L4)时,所有乳液均呈现外观均一、没有油水相分离的状态,表现出良好的物理稳定性。这一结果表明,磷脂的添加是芯液具有自乳化能力的必要条件。
图1 不同磷脂添加量CoQ10芯液自乳化乳液的外观
Fig.1 Macroscopic appearance of the emulsions formed by the self-emulsifying CoQ10 softgel cores with different phospholipid concentrations
基于此,本研究选择L1、L2、L3和L4作为后续深入研究的对象,以系统探究磷脂浓度在满足基本稳定性的情况下,对乳液微观结构、流变特性及稳定性的精细化影响规律,并最终为体内生物利用度研究筛选出最优配方组。本研究旨在阐明不同磷脂用量的芯液与乳液性能之间的构效关系,而非仅验证其乳化能力,故未将不稳定的L0组纳入后续分析。
2.2 粒径和zeta电位
图2-a结果显示,在磷脂质量分数从10%提升到40%的过程当中,主峰一直持续朝着小尺寸区域进行移动,说明磷脂浓度的升高有助于生成尺寸更微小的纳米液滴,当磷脂浓度增加到30%和40%时,两者的分布曲线开始趋于重合,这表明液滴尺寸的均质化进程已经进入稳定阶段。图2-b显示乳液平均粒径会随着磷脂质量分数提升而明显降低(P<0.05),具体是从L1组的(539.67±11.01) nm逐步下降到L4组的(256.23±20.1) nm,这种变化说明磷脂质量分数升高能够提供更多界面活性物质,可促进对油相的包裹与破碎进而形成更微小纳米液滴[12]。值得注意的是,当磷脂质量分数增加到30%[L3组,(268.53±33.66) nm]之后,再进一步提高到40%(L4组)时粒径并未产生显著变化(P >0.05),这表明磷脂界面吸附存在饱和点,超出该点后过量磷脂对粒径缩小的效果将会大幅减弱,此结论和Liang等[13]关于向日葵卵磷脂的研究结果一致,也就是磷脂浓度达到一定程度后其对粒径的影响会进入平台期。这个“平台期”效应可以通过界面吸附理论来深入解释说明[14],当乳化剂使用量处于较低水平的时候,如L1和L2组,提高其浓度能够增加界面活性分子的数量,进而让液滴的尺寸有所减小。然而,当乳化剂在新生成的油-水界面形成单分子层饱和吸附之后,其浓度就会变成制约因素,这会导致体系里所有可接触的界面都被完全占据,从而让界面特性维持在稳定状态。此时,过量的磷脂主要是以存在于连续相中的胶束为主,并且不会再对界面组分或者最终的液滴大小产生影响。这一规律和Cabezas等[15]对改性向日葵卵磷脂的研究报道一致,在达到某个特定浓度之后,磷脂分子能够把液滴界面完全包裹起来,继续增加磷脂的添加量对液滴大小不会有显著的改变。与粒径变化相协同,乳液的zeta电位随磷脂质量分数的增加呈现出明确的规律性变化(图2-c),其绝对值由L1组的(29.8±0.78) mV持续增大到L4组的(38.17±1.99) mV,这表明液滴表面吸附的磷脂量增加导致带负电的磷酸基团密度提高,进而显著增强界面电荷强度,更高的zeta电位绝对值意味着液滴间静电斥力增强,这对防止纳米乳滴聚集维持长期胶体稳定性有关键作用[16]。特别值得注意的是L3与L4组的zeta电位均低于-35 mV,表明两者均可通过静电稳定机制实现高度分散化的体系。
a-粒径分布;b-平均粒径;c-zeta电位
图2 不同配方乳液的粒径分布,平均粒径和zeta电位
Fig.2 Droplet size distribution,average size, and zeta potential of L1-L4 emulsion droplets
注:不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)(下同)。
a-光学显微镜图像;b-CLSM图像
图3 L1～L4组的微观结构
Fig.3 Microstructure of L1-L4 emulsion droplets
注:使用尼罗红(红色,油相)染色。
2.3 微观结构
通过光学显微镜观察乳液微观结构(图3-a),结果显示所有样品都形成球形液滴且均匀分散在水相里,但磷脂浓度不同造成了明显的形貌差异,L1与L2组视野中能看到少量较大尺寸液滴,这表明其分散均匀性还需要进一步改善,而L3与L4组呈现出液滴分布更密集且尺寸更均匀的微观特征,这表明其乳化效果会更好。为精确描述油相分布并确定乳液类型,接下来采用CLSM来观察(图3-b),经过尼罗红(红色)特异性染色之后,所有样品都显示出明亮的红色球形液滴且无不规则聚集现象,这种形态属于典型的水包油(O/W)型乳液结构[17],这和前面的乳化结果一致。CLSM图像的定量分析验证了粒径分析得出的结论,L1组(10%磷脂)的液滴尺寸明显偏大且数量密度比较低,这和其界面磷脂覆盖相对不足、未能有效抑制乳化过程中液滴聚并有关,最终使得其平均粒径达到最大值(539.67 nm)。与之相比,L3与L4组展现出尺寸较小且分布高度均匀的液滴形态,并且液滴数量有显著增多,这充分证明30%及以上的磷脂添加量能让体系获得饱和的界面覆盖,进而凭借强大的空间位阻效应有效阻止液滴聚集,实现最佳的乳化效率和微观结构稳定性,最终得到最优的乳化与稳定效果。
2.4 流变特性
图4-a展示出4组样品的静态黏度测试结果,各样品都展现出剪切稀化的典型特征,也就是表观黏度会随着剪切速率提升而下降,这体现出假塑性流体的非牛顿特性,在特定剪切速率下,乳液的表观黏度会随磷脂质量分数增加呈持续上升态势(L1
a-稳态黏度-剪切速率;b-频率扫描
图4 L1～L4组的流变特性
Fig.4 Rheological profiles of L1-L4 emulsion droplets
图4-b频率扫描结果能看出,当角频率从1 rad/s提升到100 rad/s期间,所有样品储能模量(G′)都高于损耗模量(G″),呈现出典型类固体凝胶特性,这证实样品由致密液滴群构成稳定弹性网络[20]。该结构形成是因为高内相中紧密排列液滴间存在相互作用,虽说4组样品模量数值比较相近,但L3与L4组曲线基本处于重合状态,表明二者形成网络强度大致相当,这意味着液滴浓度达到特定阈值后,体系宏观弹性主要由体积分数决定,对液滴尺度细微变化不再敏感[21]。频率扫描数据和稳态剪切测试及粒径分析结果相互支持,一同证明磷脂质量分数在30%时可构建有理想黏弹特性的乳液体系。
2.5 离心稳定下测定
图5-a的数据显示L1、L2、L3及L4组的不稳定性指数分别是0.064±0.008、0.041±0.009、0.016±0.005和0.014±0.006,其中L1组的指标值明显偏高存在统计学差异P<0.05,这反映出该体系稳定性是4组中最弱的情况或许与其粒径较大且zeta电位较低有关,相比之下L3和L4组均展现出了优异的稳定性且二者无统计学差异,这主要归因于它们具备纳米级小粒径、较高zeta电位和更大连续相黏度,结果清楚表明当磷脂质量分数从30%增至40%时稳定性未获进一步显著提高,这一结论与不稳定动力学曲线即图5-b以及离心后管底部115～130 mm处透光率分布图即图5-c～图5-f结果完全吻合,L1组和L2组透光率快速攀升意味着样品出现显著乳析和相分离现象,而L3和L4组透光率波动较小证实其具有更佳离心稳定性[22]。
a-不稳定性指数;b-透光率-时间动力学曲线;c-L1透射曲线;d-L3透射曲线;e-L2透射曲线;f-L4透射曲线
图5 L1～L4组的离心稳定性
Fig.5 Centrifugal stability of L1-L4 emulsion droplets
根据粒径、zeta电位以及流变学数据,这种差异能够得到合理的解释,L1组液滴尺寸是最大的[(539.67±11.01) nm],大液滴在离心作用下会迅速上浮,直接造成了严重的分层现象,同时其zeta电位绝对值是最低的[(29.8±0.78) mV],这表明界面电荷密度存在不足,液滴间静电排斥力比较弱,容易在碰撞时发生聚集的情况,加之其黏度是最低的且液滴网络结构较为疏松,缺乏空间位阻对液滴运动形成限制,微观与宏观层面的缺陷共同作用,导致该组稳定性是最差的,相比之下,L3组和L4组展现出更优的稳定性,这和它们的综合性能密切相关,首先较小的粒径显著降低了上浮速率,其次较高的zeta电位形成了有效的静电势垒,可阻止液滴发生聚并,最后高黏度及强弹性凝胶网络(G′>G″)构建了“类固体”三维结构,从动力学层面有效延缓了液滴的迁移和重排,从而实现了最佳的稳定性。
2.6 药代动力学分析
基于前述体外研究结果,磷脂浓度对于乳液的粒径、zeta电位以及流变特性存在协同调控作用,这种作用会共同对乳液物理稳定性产生影响,在没有继续增加磷脂使用量的状况下,L3组也就是30%磷脂组已经呈现出和L4组相近的稳定性水平,考虑到原料成本以及工艺经济性等方面因素,进一步提高磷脂质量分数对产品性能提升效果比较有限,所以确定L3配方为最优体系并且开展其体内药代动力学研究,为了系统地比较吸收效果,专门设置了6个对照组,分别是CoQ10原料粉末、普通辅酶Q10软胶囊(C1)、普通辅酶Q10软胶囊十倍剂量组(C2)、市售水溶型CoQ10软胶囊(C3)、市售还原型CoQ10软胶囊(C4)以及实验组L3,所有组别在进行灌胃操作之前都统一调整到相同的CoQ10浓度,其中原料粉末组采用5 g/L的羧甲基纤维素钠溶液来进行分散。
口服给药后,血药浓度-时间曲线和详细的药代动力学参数见图6和表1。结果显示原料组,C1组,C2组和L3实验组的Tmax值为8 h,C3组和C4组的Tmax值分别为2、4 h,Cmax值原料组为(71.018±17.943) ng/mL,C1组为(125.078±37.391) ng/mL,C2组为(399.922±136.022) ng/mL,C3组为(332.625±86.662) ng/mL,C4组为(375.678±154.942) ng/mL,L3实验组为(443.874±70.248) ng/mL,相比于原料组,L3实验组和商业制剂(C1～C4组)的Cmax都有明显提升,其中L3组和C2～C4组有显著性提升(P<0.05),同时观察到L3组相比于原料组和商业制剂组(C1～C4)有更大的Cmax值,更是普通原料组的6.25倍(P<0.05),AUC0-24 h结果显示,原料组为(684.214±158.072) μg/(L·h),C1组为(839.348±187.564) μg/(L·h),C2组为(2 634.052±1 167.436) μg/(L·h),C3组为(1 895.062±579.009) μg/(L· h),C4组为(2 458.622±816.558) μg/(L· h),L3实验组为(3 430.772±569.72) μg/(L· h),L3实验组和商业制剂(C1～C4组)的AUC0-24 h相比于普通原料组都有提升,其中L3组和C2～C4组有显著性提升(P<0.05),L3组相比于原料组和商业制剂组(C1～C4)有更大的AUC0-24 h值(P<0.05),约是原料组的5.01倍(P<0.05),是普通CoQ10软胶囊(C1)组的4.1倍。关于生物利用度的提高,Niu等[23]研究结果表明,负载CoQ10的纳米乳液和富含CoQ10的饮料比商业CoQ10产品相比,生物利用度分别提高了约1.8、2.8倍。Belhaj等[24]报告,与商业CoQ10-油混合物相比,CoQ10纳米乳液的生物利用度提高了1.7倍,这两者都与本研究结果一致。此外,还有其他研究结果表明使用基于乳剂的技术提高CoQ10吸收的可能性[25]。
表1 药代动力学参数
Table 1 Pharmacokinetic parameters for each group
组别Tmax/hCmax/(ng/mL)AUC0-24 h/[(μg/(L·h)]原料871.018±17.943a684.214±158.072aC18125.078±37.391a839.348±187.564aC28399.922±136.022b2 634.052±1 167.436bcC32332.625±86.662b1 895.062±579.009bC44375.678±154.942b2 458.622±816.558bL3(30%)8443.874±70.248b3 430.772±569.72c
注：不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。
图6 六组口服给药后的血药浓度—时间曲线
Fig.6 Pharmacokinetic plasma concentration-time profiles.
Plasma concentration-time curves for six groups
这种显著提升的体内暴露量,与L3的体外优势形成了良好的机制对应:首先L3拥有较小的平均粒径,极大增加了药物与消化液的界面接触面积,加速了CoQ10的释放与胶束化过程,其次该添加量下的磷脂不仅在乳液中提供了饱和且稳定的界面层,同时作为生物膜的主要成分,可直接增强肠道对脂溶性分子的转运,发挥吸收促进作用,最后L3所具备的高黏度与强弹性凝胶网络,可能在胃肠环境中形成“缓释-持续供药”效应,从而避免药物的过快沉降和局部聚集,提高吸收的充分性与稳定性。与市售制剂的对比结果来看,在剂量仅为C2组十分之一的情况下,L3便实现了相近(Cmax)甚至更优(AUC0-24 h)的血药暴露,凸显了其通过提高吸收效率而非依赖高剂量实现药效的处方优势。同时,L3在总吸收量(AUC0-24 h)上显著领先于高端制剂C3和C4,说明通过优化粒径与网络结构即可实现甚至超越复杂商业体系的药动学性能。
综上,体内外数据表明:L3凭借较优的粒径、界面稳定性与流变特性,实现了CoQ10吸收利用最大化,为该递送体系的高效应用提供了有力的支撑。
3 结果与讨论
本研究对磷脂含量给CoQ10自乳化芯液特性带来的影响机制进行系统考察,研究揭示增加磷脂用量可有效改善乳液微观形态及稳定性特征,乳滴尺寸会随磷脂添加比例提高而逐步降低,表面电荷密度则呈现出上升的趋势,当磷脂添加量达到30%(L3)时体系形成平均粒径268.53 nm且分布均匀纳米乳液,同时展现出良好流变特性和离心稳定性(分层指数0.016),继续提升磷脂添加量至40%(L4)后各参数指标无统计学差异(P>0.05),说明界面吸附已达平衡状态,综合考虑性能与经济性确定L3为最佳配比,动物实验证实该配方具有明显优势,基于L3制备的软胶囊在大鼠体内吸收表现十分突出,其峰浓度和暴露量分别为原料对照组的6.25、5.01倍,即使减低给药量其生物利用度仍超越多种市售产品,这证明将芯液磷脂质量分数控制在30%可构建高效自乳化系统,纳米乳液增大了药物溶出界面,而饱和磷脂层既维持了体系稳定性又可能通过界面作用增强肠道摄取,该研究阐明了磷脂用量与自乳化效率及体内吸收的量效关系,为开发高活性CoQ10制剂提供理论支撑。但本研究亦存在一定的局限性。例如,药代动力学研究只选取了生理特征更稳定的雄性SD大鼠,以初步控制变量,揭示磷脂调控的核心规律,后续工作应当拓展到雌雄双向动物模型方面,要进一步评估该递送系统的适用范围,同时要详细分析不同生理状态下CoQ10的吸收与代谢特性,以此来促进它在临床领域的实际应用。
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