在食品行业中,β-葡萄糖苷酶(β-glucosidases,BGL)能够有效水解苦杏仁苷、异黄酮等糖苷类化合物,释放出具有独特功能的单体成分,可以有效改善食品风味[1];在医药行业中,可将大分子糖苷大豆异黄酮、人参皂苷分解为小分子活性成分,提高其在人体内的吸收和利用效率,将植物中的白藜芦醇苷水解为高药用价值的白藜芦醇,用于药用活性化合物的制备[2];更为重要的是,BGL是分解纤维素的关键限速酶,对提高纤维素的糖化率、推进新一代工业发酵用碳源-秸秆糖的产业化进程具有重要作用。黑曲霉(Aspergillus niger)是BGL的主要生产者[3],使用生物技术提升黑曲霉的产酶性能,将有助于推进BGL在食品、医药、生物能源和生物化工等领域中的广泛应用。

高效原生质体的制备、转化、再生是建立非模式黑曲霉遗传转化体系与基因编辑技术的关键,但不同来源的黑曲霉在这些方面存在显著差异。ZHENG等[4]制备黑曲霉CBS513.88的原生质体所使用的是单一的溶壁酶,LIU等[5]报道制备黑曲霉N1原生质体时,又需要附加溶菌酶、蜗牛酶、几丁质酶才能获得大量原生质体;本团队以自主筛选出的具有较强BGL生产能力的野生黑曲霉An-1为对象,研究发现使用常规的聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)-原生质体转化方法,无法将操作质粒引入到该菌株中。因此,建立针对非模式黑曲霉菌株An-1稳定的遗传转化体系至关重要。与此同时,随着基因编辑技术的快速发展,利用分子生物学手段选育高产木聚糖酶、海藻糖酶和BGL等酶制剂的黑曲霉菌株成为研究热点。例如,LI等[6]利用基因组编辑将xynA定点整合表达在黑曲霉AG11的基因组上,使木聚糖酶活力提高到1 460 U/mL;DONG等[7]在黑曲霉HL-1通过多拷贝表达TreM,相应转化子的海藻糖酶活力最高可达1 943.06 U/mL;CAI等[8]在黑曲霉ZJUBE-1中利用强启动子Pgpd分别过表达了同源的BGL1和BGL2,纯酶的比酶活力为20 U/mg;WANG等[9]在黑曲霉ATCC 20611中利用其自身启动子PfopA过表达了bglA基因,使酶活力达到17.84 U/mL。本团队自主筛选高产BGL酶活力的黑曲霉菌株An-1,通过测序发现该菌株含有11条BGL相关基因[10],但关键BGL基因筛选和高效过表达的相关研究尚未见报道。

为了有效改造黑曲霉An-1,提升其产BGL活力,本研究拟通过优化原生质体的制备条件与再生方法,建立稳定的非模式黑曲霉An-1遗传转化体系;以表达红色荧光蛋白作为报告基因,建立BGL表达盒,筛选出野生黑曲霉An-1的关键BGL基因;构建非模式黑曲霉An-1基因编辑体系,并期望实现关键BGL基因的高效表达,为分子改造非模式黑曲霉An-1、实现BGL的高效生产奠定了科学基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

本研究的黑曲霉菌株An-1为实验室筛选,保存于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M2024768;大肠杆菌DH5α,南京诺唯赞生物科技有限公司;pFC332质粒,湖南丰晖生物科技有限公司;pUC-sgRNA和puc-mCherry,南京金唯智生物科技有限公司;引物由上海生工生物工程有限公司合成,序列见表1。

1.1.2 试剂

限制性内切核酸酶BglⅡ,北京NEB公司;质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、2×Rapid Taq Master Mix、2×Phanta Max Master Mix (Dye Plus)、DL5000 DNA Marker、Ultra Gel Red (10 000×),南京诺唯赞公司;琼脂糖凝胶,上海生工生物工程有限公司;50×(Tris-acetate-EDTA),碧云天生物公司;无缝克隆试剂盒,上海都友生物公司;基因组提取试剂盒、潮霉素、溶壁酶、蜗牛酶和溶菌酶,北京索莱宝有限公司;纤维素酶,麦克林有限公司。

TC(Tris calcium)缓冲溶液:5.5 g/L CaCl2,1.2 g/L Tris,定容到1 L。

STC(sorbitol Tris calcium)缓冲溶液:242.3 g D-山梨醇,TC缓冲液定容到1 L。

50%(质量分数)PEG缓冲溶液:5 g PEG-6000,TC缓冲液定容到10 mL。

1.1.3 培养基

PDA培养基(g/L):200马铃薯,20葡萄糖。用于转化子筛选时加入潮霉素B,终质量浓度为300 μg/mL。

CD(chemically defined)高渗固态培养基(g/L):3 NaNO3,2 KCl,0.5 MgSO4·7H2O,1 K2HPO4·3H2O,0.01 FeSO4·7H2O,342 蔗糖,pH 5.5。上层、下层培养基分别加入10 g/L、20 g/L琼脂粉。

生长培养基(g/L):6酵母浸粉,3蛋白胨,20葡萄糖,0.5 KH2PO4,0.5 (NH4)2SO4,1 MgSO4·7H2O。

LB培养基(g/L):10 NaCl,10蛋白胨,5酵母浸粉,自然pH。

1.2 仪器与设备

ZQLY-180V生化培养箱、ZQZY-78BV恒温培养摇床,上海知楚仪器有限公司;MX-307高速冷冻离心机,日本TOMY有限公司;AZY1603149紫外可见分光光度计,日本岛津有限公司;PSH-3E雷磁精密pH计,上海图新电子科技有限公司;ICX41-EX31-OD4000UHW10荧光倒置显微镜,宁波舜宇仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 黑曲霉菌丝体的培养

将黑曲霉接种于PDA固体平板上,28 ℃倒置培养4 d,用0.9%(质量分数)NaCl溶液制作孢子悬液。

液体培养菌丝体:利用血球计数板计数,取约1×107个孢子接种量接种于生长培养基,28 ℃、200 r/min振荡培养16～18 h,经无菌滤袋过滤、生理盐水洗涤,获得菌丝体。

固体培养菌丝体:取100 μL黑曲霉孢子悬液均匀涂布在铺有玻璃纸铺在PDA培养基平板上,于28 ℃培养箱培养16～18 h,此时菌丝体附着于玻璃纸上。

1.3.2 高效稳定的非模式黑曲霉菌株An-1遗传操作体系的构建

1.3.2.1 原生质体的制备及条件优化

称取0.25 g摇瓶培养的菌丝体,分别加入10 mL的单一裂解酶(2%溶壁酶,质量分数)和复合酶液(1%纤维素酶+0.5%蜗牛酶+0.25%溶菌酶,质量分数),于37 ℃酶解2 h,记录酶解液中的菌体形态变化,并取适量酶解液置于显微镜下,观察原生质体的释放情况,探究不同酶解液对制备黑曲霉原生质体的影响。

采用上述方法,使用10 mL的复合酶液处理摇瓶培养所获菌丝体。对于固体平板所培养的菌丝体,使用无菌镊子将附有菌丝体的玻璃纸,置于含有10 mL复合酶液的无菌培养皿中酶解处理2 h。取适量酶解液置于显微镜下,观察原生质体的释放情况,探究不同菌丝体对制备黑曲霉原生质体的影响。

将固体培养菌丝置于10 mL复合酶液中,分别处理1.5、2.0、2.5、3.0 h,取适量酶解液置于显微镜下,观察原生质体的释放情况,探究酶解时间对制备黑曲霉原生质体的影响。

菌丝体在经过酶解处理后,使用尼龙布过滤酶解液,从菌丝体中分离出原生质体,滤液经5 000 r/min,离心10 min,获得沉淀,并使用STC缓冲溶液洗涤2次后进行悬浮,得到用于转化的原生质体。

1.3.2.2 PEG介导的原生质体转化

取100 μL原生质体,加入3 μg质粒,混合均匀,冰浴20 min。加等体积的50%(质量分数)PEG缓冲溶液,混合均匀后,置于25 ℃下,孵育20 min。

1.3.2.3 原生质体的固体与液体再生

原生质体的固体再生:在转化体系中,加入4 mL CD上层软琼脂培养基,混合均匀后,铺板于含300 μg/mL潮霉素的CD下层培养基上,28 ℃培养3～5 d,观察转化子的生长情况。

原生质体的液体再生:在转化体系中,加入2 mL的STC缓冲液,混合均匀,置于28 ℃静置孵育4 h后,5 000 r/min,离心10 min,弃上清液,使用残留液体悬浮菌体沉淀,均匀涂布于含300 μg/mL潮霉素的CD培养基上,28 ℃培养3～5 d,观察转化子的生长情况。

1.3.2.4 菌丝破碎方法、转化子的筛选及验证方法优化

待抗生素CD平板上长出单菌落后,挑取转化子接种于含有300 μg/mL潮霉素的PDA固体平板上,28 ℃培养2～3 d,分离并筛选出抗性转化子。挑取菌丝,分别采用以下方法破菌,使用pFC332-F/R进行菌丝PCR验证。

热处理破菌:挑取适量菌丝于50 μL的TE缓冲液中,混匀后95 ℃加热10 min,裂解液于12 000 r/min离心10 min后,取2 μL上清液作模板。

超声破菌:挑取适量菌丝于50 μL的Tris-EDTA(TE)缓冲液中,混匀后置于超声清洗仪中处理10 min,裂解液离心后,取上清液作模板。

热处理+超声组合破菌:按上述方法先热处理10 min,接着置于超声下处理10 min,裂解液离心后,取上清液作模板。

碱裂解破菌:挑取适量菌丝于含有45 μL 2 mol/L NaOH溶液的离心管中,混匀后95 ℃加热10 min,待冷却后加入5 μL 2 mol/L Tris-HCl溶液,裂解液离心后,取上清液作模板。

1.3.3 高效的非模式黑曲霉菌株An-1基因编辑体系的构建与BGL关键基因的过表达、筛选

1.3.3.1 红色荧光蛋白和黑曲霉An-01的11条BGL的表达

以黑曲霉An-1基因组为模版,分别以gpd-F/R、gla-F/R和T-F/R为引物,扩增启动子Pgpd、启动子Pgla和终止子Tgla片段。以puc-mCherry质粒为模板,mCherry-F/R为引物,扩增红色荧光蛋白mCherry片段,对PCR产物进行纯化回收。经融合PCR,分别组装Pgpd-mCherry-Tgla与Pgla-mCherry-Tgla荧光表达盒。使用BglⅡ酶切处理pFC332质粒,经无缝克隆,将Pgpd-mCherry-Tgla与Pgla-mCherry-Tgla荧光表达盒整合至pFC332线性化载体。挑取多个转化子,使用pFC332-F与T-R进行菌液PCR验证,经琼脂糖凝胶电泳,将片段大小正确的表达质粒,送至生工生物公司测序检测。将构建成功的红色荧光表达质粒,按上述方法进行原生质体转化,导入至黑曲霉中,经筛选、验证得到黑曲霉红色荧光蛋白表达菌株。进一步使用荧光倒置显微镜,在绿色荧光激发下,观察黑曲霉转化子菌丝中的荧光强度,用于判断基因的过表达强度。

按照红色荧光蛋白表达载体的构建方法,经融合PCR组装完成各个BGL基因过表达盒子Pgpd-SP-bgl-Tgla,再整合至pFC332载体上,将所构建的载体转化至黑曲霉中An-1中,实现各个BGL在黑曲霉中的过表达。

1.3.3.2 CRISPR-Cas9靶向质粒及供体片段的构建

使用CHOPCHOP(http://chopchop.cbu.uib.no/)在线设计kusA基因的靶位点,将靶位点设计进5S-kus-R和sgRNA-kus-F中。以黑曲霉基因组为模板,5S-kus-F/R扩增携带靶位点的5S rRNA启动子片段,以puc-sgRNA质粒为模版,sgRNA-kus-F/R为引物扩增携带靶位点的sgRNA,PCR产物进行纯化回收。5S rRNA和sgRNA片段按1∶1的摩尔比进行融合PCR扩增,获得5S rRNA-kusA-sgRNA表达盒。使用BglⅡ酶切处理pFC332质粒,经无缝克隆,将5S rRNA-kusA-sgRNA表达盒整合至pFC332线性化载体。挑取多个转化子,使用pFC332-F/R进行菌液PCR验证,经琼脂糖凝胶电泳,将片段大小正确的Cas9与sgRNA共表达质粒pFC332-Cas9-sgRNA,送至生工生物公司测序检测。对于敲除供体片段的构建,以黑曲霉基因组为模板,kus-up-F/R和kus-down-F/R为引物,扩增靶位点附近的kusA基因上下游片段。经融合PCR,以kus-up-F和kus-down-R为引物将上下游片段融合为供体片段。将PCR产物通过醋酸钠-乙醇沉淀法纯化回收。

按照上述方法,分别构建用于敲除与过表达HQM9510的靶向质粒与供体片段。

1.3.3.3 基因编辑菌株的构建、BGL基因的过表达及筛选

采用上述的原生质体转化方法,100 μL转化体系中加入3 μg pFC332-Cas9-sgRNA质粒和3 μg供体片段,转化体系在液体再生后,均匀涂布于含300 μg/mL潮霉素的CD培养基上,28 ℃培养3～5 d。

待转化子长出后,在抗性PDA平板上进行分离筛选,并使用kusyz-F/R进行菌丝PCR,根据电泳条带大小,初步判断黑曲霉An-1的kusA基因是否发生敲除,再进一步测序检验菌株的正确性。

按照上述方法,分别构建HQM9510的敲除与过表达的菌株。

1.3.4 黑曲霉菌株的发酵与酶活测定

将黑曲霉接种于PDA固体平板上,28 ℃倒置培养4 d,用0.9%(质量分数)NaCl溶液制作孢子悬液。利用血球计数板计数,取约1×107个孢子接种量接种于生长培养基,30 ℃、200 r/min振荡培养4 d。取适量发酵液,12 000 r/min离心10 min后取上清液进行酶活力测定。以纤维二糖和p-硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷2种底物测定BGL活力。

2 结果与分析

2.1 五种不同条件对非模式黑曲霉An-1原生质体转化的影响

2.1.1 不同酶解液对制备黑曲霉An-1原生质体的影响

酶解作用下菌丝体的细胞壁被破坏,使原生质体释放。溶壁酶能够水解细胞壁葡聚糖的糖苷键,对大多数真菌都有较好的脱壁效果,例如,ZHENG等[4]使用单一溶壁酶处理黑曲霉菌丝体后,获得了大量原生质体用于PEG介导的转化。纤维素酶、蜗牛酶、溶菌酶等均能水解细胞壁组分的糖苷键,LIU等[5]将这些酶按一定比例混合后,处理高产淀粉的黑曲霉,所制备的原生质体数量能达到105～106个/mL。DONG等[7]在构建高效表达海藻糖酶的工程黑曲霉时,制备原生质体时所使用的也是以纤维素酶为主的混合酶。因此,本研究系统比较了单一溶壁酶和混合酶在制备产BGL黑曲霉原生质体的效率。

黑曲霉菌丝体酶解流程如图1-A所示。将液体培养所获得的菌丝体,按照1.3.2.1节的方法,使用不同类型的酶液进行处理。如图1-B和图1-C所示,单一溶壁酶处理2 h后,菌丝球保持较完整状态,酶解液较透亮,而在混合酶液(1%纤维素+0.5%蜗牛酶+0.25%溶菌酶)的作用下,菌丝球分散开,酶解液比较浑浊。酶解液的镜检分析如图1-D和图1-E所示,菌丝球经单一溶壁酶处理后,视野比较干净,仅存在少量菌丝,未出现原生质体。然而,在混合酶的酶解液中,能观察到大量分散的菌丝和少量原生质体的存在。以上结果表明,混合酶液在制备黑曲霉An-1的原生质体时具有良好的酶解脱壁效果。

2.1.2 菌丝培养方式对制备黑曲霉An-1原生质体的影响

以上研究发现,液体摇瓶培养的菌球所制备原生质体的数量极少,且大多附着在菌丝上(图1-D),使用过滤的方式难以将菌丝体和原生质体进行有效地分离,残留的大量菌丝会干扰转化效率。赵君[11]通过优化黑曲霉液体培养时间、改进培养基配方,减少了菌球形成,使原生质体悬液浓度从1×104 个/mL提升至4×105 个/mL。

本研究前期尝试优化液体培养方式,获得相对分散的菌丝体,结果并没有获得理想的酶解材料。LI等[12]和QIAN等[13]在制备草酸青霉与里氏木霉的原生质体时,使用的酶解材料是附着在玻璃纸上的菌丝体。对于高产的糖化酶工业黑曲霉菌株,LIU等[5]使用固体培养菌丝体制备的原生质体浓度最高达到1.7×107 个/mL。因此,本部分探究了固体培养菌丝的酶解脱壁效果。

按照1.3.2.1节方法使用固体培养菌丝进行酶解处理,镜检视野中原生质体从菌丝体中释放到酶解液中,与液体培养菌丝体的酶解液相比,数量有了明显提升,且体积较大(图2)。在黑曲霉菌丝长度方面,固体培养比液体培养的较短,菌丝虽然相互缠绕,但不存在抱团现象,其相对分散的菌丝状态增加了与酶液的接触,有利于菌丝体的充分酶解。以上结果表明,固体培养菌丝在制备黑曲霉An-1的原生质体时具有良好效果。

2.1.3 酶解时间对制备黑曲霉原生质体An-1的影响

菌丝酶解时间过短,大量的原生质体还未得到释放,充分地酶解有利于提升原生质体的制备效率,然而,过度地酶解处理会破坏原生质体的完整状态,因此,按照1.3.2.1节方法对酶解时间进行了研究。将固体培养的菌丝用混合酶液,分别酶解不同时间后进行镜检,结果如图3所示,酶解处理1.5 h,视野中约有14颗原生质体;酶解2.0 h后,原生质体数量增长至23颗;酶解处理2.5～3.0 h,原生质体的数量出现下降,不足10颗。从以上结果可知,原生质体的数量随酶解时间的延长先增加后减少,对于黑曲霉An-1,最佳酶解时间为2.0 h。朱思远[14]在优化黑曲霉CICC2169原生质体的制备条件时,发现最佳的酶解处理为2.5 h。赵君[11]在酶解处理黑曲霉CBS 513.88时,发现原生质体的最佳酶解时间为1.5 h。由此可见,不同黑曲霉菌株的酶解处理时间存在一定差异。具体见图3。

2.1.4 再生方式对PEG介导黑曲霉An-1原生质体转化效率的影响

原生质体需要在适宜的条件下再生出细胞壁,才能回复正常的生长,因此,原生质体的再生对于黑曲霉的转化起到了关键作用。通常来说,在黑曲霉等丝状真菌进行原生质体再生时多采用双层平板法,原生质体在无抗的高渗固体培养基中完成再生[4-5,7]。本研究在使用该方法时发现,双层平板上长出致密的黑曲霉菌落,但是这些菌落无法生长于抗性PDA,因此,使用双层平板进行黑曲霉An-1进行固体再生,存在大量假阳性现象(图4-A)。

黑曲霉SJ1和ATCC12846在PEG介导完转化后,直接涂布于抗性PDA上进行转化子的筛选[15]。黑曲霉AG11采用的是将转化液直接转移至抗性高渗固体平板,进行再生培养[8]。为了使黑曲霉An-1的原生质体得到较好的再生,本研究按照1.3.2.2节和1.3.2.3节的方法将转化体系在STC缓冲液中进行孵育后,再在抗性高渗固体平板进行筛选。结果如图4-B所示,使用液体再生的方法成功获得了具有抗性的黑曲霉转化子,一个转化体系能获得100个左右的转化子。随机挑取的转化子转接于抗性平板上,均表现出良好抗性,不存在假阳性菌株。

2.1.5 菌丝破菌方式对黑曲霉An-1转化子鉴定和筛选的影响

黑曲霉菌丝的细胞壁结构致密,破菌成功率会影响转化子验证的正确性。因此,本研究进一步优化了菌丝破壁方式,以提高黑曲霉An-1转化子的验证效率。张晓娟等[16]利使用微波处理置于10×TE缓冲液中的黑曲霉菌丝,裂解上清液直接用于PCR扩增,然而微波炉处理极易造成裂解液的喷溅。赵杰宏等[17]使用高温水浴、超声的方式处理丝状真菌,裂解液上清液均能作为DNA模板用于PCR扩增。罗中钦等[18]使用氢氧化钠悬浮菌丝并进行加热处理,快速制备的丝状真菌的模板DNA用于转化子的快速筛选。结合以上研究,本部分按照1.3.2.4节的方法比较了高温水浴、超声处理、高温水浴和超声组合处理以及碱裂解4种方式,对黑曲霉An-1检测效率的影响。结果如图5-A所示,以上方法中,高温水浴处理的检测效率低于10%,而碱裂解法的检测效率最高为97%,另外2种方式的检测效率较低,约为20%和50%。以上结果说明,碱裂解法实现了菌体的高效裂解,适用于黑曲霉An-1转化子的快速鉴定和大量筛选。

2.2 非模式黑曲霉An-1基因编辑体系的构建与11条BGL的表达

2.2.1 红色荧光蛋白报告基因及11条BGL基因在黑曲霉An-01中的过表达与筛选

本研究按照1.3.3.1节的方法通过构建红色荧光表达盒子,检测以上遗传转化体系是否适用于蛋白表达。启动子Pgpd和Pgla分别是黑曲霉中的强组成型与诱导型启动子[19],将两者分别用于驱动红色荧光蛋白的表达,通过融合PCR,构建Pgpd-RED-Tgla与Pgla-RED-Tgla的表达盒子,再整合于黑曲霉的游离表达质粒pFC332上,并把重组质粒导入至黑曲霉An-1的原生质体中(图6-A)。抗性转化子Pgpd-RED和Pgla-RED中存在相应的红色荧光蛋白表达盒。荧光观察结果显示,转化子Pgpd-RED和Pgla-RED均能成功地激发出红色荧光,而出发菌株An-1未检测到荧光信号,说明启动子Pgpd和Pgla能够驱动蛋白在黑曲霉An-1中的表达(图6-B～图6-C)。其中,转化子Pgla-RED的荧光强度要低于Pgpd-RED,可能是由于诱导型启动子Pgla未处于适宜的诱导条件。

本团队前期对黑曲霉An-1进行全基因测序,和NCBI黑曲霉基因序列比对分析,发现黑曲霉An-1存在11条BGL编码基因,相关信息见表2。采用1.3.3.3节的方法,构建过表达菌株(图6-D和图6-E),检测酶活力变化以筛选关键BGL基因。发酵结果如图6-E所示,其中HQM5726和HQM4284以对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside,p-NPG)为底物能够检测出酶活力,分别为0.17、0.43 U/mL。HQM5944在p-NPG与纤维二糖为底物时,均能检测出酶活力,分别为0.21、0.26 U/mL。相比之下,HQM9510的酶活力水平最高,以p-NPG与纤维二糖为底物的酶活力分别为2.46、3.18 U/mL。综上,推断HQM9510是黑曲霉An-1的关键BGL编码基因。

2.2.2 非模式黑曲霉中An-1基因编辑体系的建立

基于以上黑曲霉An-1中遗传转化体系的建立和内源蛋白的成功表达,验证CRISPR-Cas9基因组编辑技术在黑曲霉An-1中的可行性。黑曲霉kusA基因的敲除能够提高同源重组的概率,在此选择该基因为敲除靶标。pFC332质粒广泛用于黑曲霉的基因编辑[20-21],本研究选取该质粒为操作工具,按照1.3.3.2节和1.3.3.3节方法建立黑曲霉An-1的基因编辑方法。

如图7-A所示,首先构建5S rRNA-target-sgRNA表达盒,然后将其整合至pFC332质粒中,实现Cas9和靶向sgRNA的共表达。在此,选取kusA基因的上下游500 bp序列融合形成1 kb的供体片段。图7-B显示,靶向质粒与供体片段已成功构建。

通过PEG-原生质体转化法,将靶向质粒与敲除供体共同转化至黑曲霉An-1中,随后把在潮霉素抗性CD高渗固体培养基上的转化子进行传代,转接于抗性的PDA平板上。待转化子长出后挑取菌丝,利用碱裂解法破菌,采用kusyz-F/R引物对转化子进行PCR检测,结果显示,未敲除成功的条带长度为1.6 kb,而敲除kusA基因的条带长度仅有1.1 kb(图7-C)。经测序确认,kusA基因被成功敲除,基因编辑体系构建成功(图7-D)。

2.2.3 非模式黑曲霉BGL的关键基因An-1 HQM9510的敲除及过表达

HQM9510基因通过鉴定,全长2 583 bp,蛋白分子质量为93.3 kDa,属于GH3家族。使用以上的CRISPR-Cas9基因组编辑技术,对HQM9510基因分别进行敲除和过表达(图8-A和图8-D),经转化子验证D9510与O9510构建成功(图8-B和图8-E)。酶活力比对发现,敲除菌株D9510的p-NPG酶活力出现明显下降,而纤维二糖酶活力几乎检测不到,而过表达菌株O9510的酶活力水平提升明显,以p-NPG与纤维二糖为底物的酶活力分别为12.88、17.10 U/mL,比游离表达菌株B9510酶活力分别提高4.2倍和4.4倍,由此确定了HQM9510为黑曲霉BGL关键基因,并得到过表达HQM9510基因的黑曲霉工程菌株O9510。

3 讨论与结论

黑曲霉广泛使用的转化方法是PEG介导的原生质体转化,原理是去除掉部分细胞壁,在PEG与Ca2+作用下,改变细胞膜的流动性,从而有利于细胞对外源DNA的吸收,在此过程中原生质体的制备、再生是转化成功的关键点。本研究发现所得到的黑曲霉An-1菌丝体呈坚实的球状,难以酶解释放原生质体。相比之下,固体培养的方式能够获得分散的菌丝,有利于酶解过程。因此,分散的菌丝体是丝状真菌制备原生质体的理想材料[13]。市面上有多种制备原生质体的酶制剂,例如默克公司的单一溶壁酶Lysing Enzyme,价格过于昂贵,使用不同比例的混合酶成为平价替代品,但混合酶的酶解不充分,原生质体未能有效释放,而且长时间的酶解处理会破坏原生质体的完整状态。因此,丝状真菌原生质体的酶解效率、酶解液浓度和酶解时间密切相关[18]。固体再生是一种传统技术手段,但是该过程过于复杂和繁琐,而液体再生的方式省时省力,几乎没有假阳性转化子的出现,所以,本研究选用液体再生构建后续的工程菌株。

黑曲霉多条BGL编码基因的存在,给解析该酶的表达调控机制带来了难度,因此有必要对关键BGL基因分析鉴定。经同源或异源过表达以及酶学性质研究,发现BglA具有胞外酶学特征[9],Bgl1B在胞内发挥了转糖苷和降解活性,4条编码基因是没有功能的假基因[22],其他编码基因对黑曲霉酶活力产生何种影响有待进一步研究。PANG等[23]在证明Cel3 J是里氏木霉的关键BGL时所采取的是构建β-葡萄糖苷酶单敲除菌株的手段,而本研究鉴定黑曲霉分解纤维二糖的关键BGL基因采用的是逐个过表达的方式,更为简便、高效。通过对11条BGL的酶活力比较,发现HQM9510(BglA)是关键BGL,基因敲除与过表达实验则进一步验证了该酶在BGL表达中的重要作用,同时在里氏木霉、草酸青霉中也存在异源表达该基因提升BGL酶活力[24-25]。同时,所构建的黑曲霉工程菌株O9150展示出良好的BGL生产潜力,后续研究将采用优化表达元件、多拷贝整合的方式进一步提升黑曲霉中BGL的酶活力,为更好地解决纤维素糖的关键酶源奠定基础。

本研究形成主要结论如下:

a)以自主筛选的产BGL黑曲霉An-1为研究对象,优化了原生质体的制备条件和再生方法,实现了该菌株的高效遗传转化,建立了稳定的非模式黑曲霉An-1的遗传转化体系。所确定的PEG-原生质体转化方法为:将玻璃纸上的幼嫩菌丝,使用1%纤维素+0.5%蜗牛酶+0.25%溶菌酶(均为质量分数)处理2 h,收集原生质体,转化体系中加入3 μg以上的质粒,使用终质量分数为25%的PEG-6000于25 ℃下孵育20 min,将转化体系置于2 mL的STC缓冲液中于28 ℃下孵育4 h后,直接涂布于抗性的高渗固体培养基上进行筛选。菌丝破壁方式的改进,极大提升了转化子进行菌丝PCR的验证效率。转化子的快速验证方法为:挑取适量转化子菌丝置于2 mol/L NaOH溶液中于95 ℃处理10 min 后,加入2 mol/L Tris-HCl溶液进行中和,裂解液上清直接作为PCR模板使用。

b)建立了稳定的非模式黑曲霉An-1的基因编辑体系,并成功应用于BGL的过表达。研究表明启动子Pgpd和Pgla驱动了红色荧光蛋白在黑曲霉An-1的表达,证实了黑曲霉An-1作为蛋白表达宿主的可行性。采用共表达sgRNA与Cas9、线性化供体片段的方式,黑曲霉An-1可有效进行基因组编辑。基于以上遗传转化和基因编辑体系,明确了HQM9510是黑曲霉An-1的关键BGL,获得了过表达HQM9510基因的黑曲霉工程菌株O9510,以纤维二糖和p-NPG为底物的酶活力分别提升至12.88 U/mL和17.10 U/mL,比游离表达菌株B9510酶活力分别提高4.2倍和4.4倍。

本研究为分子改造非模式黑曲霉An-1,实现BGL的高效生产奠定了科学基础。

参考文献

[1] PARK M,JEONG M K,KIM M,et al.Modification of isoflavone profiles in a fermented soy food with almond powder[J].Journal of Food Science,2012,77(1):C128-C134.

[2] KANNAN P,SHAFREEN M M,ACHUDHAN A B,et al.A review on applications of β-glucosidase in food,brewery,pharmaceutical and cosmetic industries[J].Carbohydrate Research,2023,530:108855.

[3] FITZPATRICK J,KRICKA W,JAMES T C,et al.Expression of three Trichoderma reesei cellulase genes in Saccharomyces pastorianus for the development of a two-step process of hydrolysis and fermentation of cellulose[J].Journal of Applied Microbiology,2014,117(1):96-108.

[4] ZHENG X M,CAIRNS T,ZHENG P,et al.Protocol for gene characterization in Aspergillus niger using 5S rRNA-CRISPR-Cas9-mediated Tet-on inducible promoter exchange[J].STAR Protocols,2022,3(4):101838.

[5] LIU D D,LIU Q,GUO W Z,et al.Development of genetic tools in glucoamylase-hyperproducing industrial Aspergillus niger strains[J].Biology,2022,11(10):1396.

[6] LI Y Y,LI C,MUHAMMAD AQEEL S,et al.Enhanced expression of xylanase in Aspergillus niger enabling a two-step enzymatic pathway for extracting β-glucan from oat bran[J].Bioresource Technology,2023,377:128962.

[7] DONG L B,YU D,LIN X T,et al.Improving expression of thermostable trehalase from Myceliophthora sepedonium in Aspergillus niger mediated by the CRISPR/Cas9 tool and its purification,characterization[J].Protein Expression and Purification,2020,165:105482.

[8] CAI L N,XU S N,LU T,et al.Directed expression of halophilic and acidophilic β-glucosidases by introducing homologous constitutive expression cassettes in marine Aspergillus niger[J].Journal of Biotechnology,2019,292:12-22.

[9] WANG L,XIE Y J,CHANG J J,et al.A novel sucrose-inducible expression system and its application for production of biomass-degrading enzymes in Aspergillus niger[J].Biotechnology for Biofuels.2023,16(23):1-20.

[10] 龚大春,马东旭,王昕,等.一种高产BGL黑曲霉菌及其构建方法与应用:中国,CN 202510036900X[P].2025-01-09.GONG D C,MA D X,WANG X,et al.A high-yield BGL Aspergillus niger strain,its construction method and application:China,CN 202510036900X[P].2025-01-09.

[11] 赵君.黑曲霉胞β-葡萄糖苷酶的鉴定及其在纤维素降解酶系合成调控中的作用[D].郑州:河南农业大学,2021.ZHAO J.Identification of intracellular β-glucosidase from Aspergillus niger and its role in the synthesis and regulation of cellulolytic enzyme system[D].Zhengzhou:Henan Agricultural University,2021.

[12] LI Z H,YAO G S,WU R M,et al.Synergistic and dose-controlled regulation of cellulase gene expression in Penicillium oxalicum[J].PLoS Genetics,2015,11(9):e1005509.

[13] QIAN Y C,ZHONG L X,GAO J,et al.Production of highly efficient cellulase mixtures by genetically exploiting the potentials of Trichoderma reesei endogenous cellulases for hydrolysis of corncob residues[J].Microbial Cell Factories,2017,16(1):207-223.

[14] 朱思远.无抗黑曲霉表达系统构建及脂肪酶的表达[D].无锡:江南大学,2019.ZHU S Y.Construction of non-resistant Aspergillus niger expression system and expression of lipase[D].Wuxi:Jiangnan University,2019.

[15] 应汉杰,张涛,陈勇,等.一株重组黑曲霉基因工程菌及构建方法和应用:中国,CN202110095568.6[P].2020-07-31.YING H J,ZHANG T,CHEN Y,et al.A recombinant Aspergillus niger genetically engineered strain,construction method and application:China,CN202110095568.6[P].2020-07-31.

[16] 张晓娟,刘松青,夏珊,等.一种用于PCR扩增的丝状真菌DNA快速提取方法:中国,CN201510918551.0[P].2016-02-10.ZHANG X J,LIU S Q,XIA S,et al.A rapid extraction method for filamentous fungal DNA for PCR amplification:China,CN201510918551.0[P].2016-02-10.

[17] 赵杰宏,桂艳玲,韩洁,等.一种丝状真菌快速PCR模板的简易制备方法:中国,CN202110031221.5[P].2021-05-18.ZHAO J H,GUI Y L,HAN J,et al.A simple method for preparing a rapid PCR template for filamentous fungi:China,CN202110031221.5[P].2021-05-18.

[18] 罗中钦,程琳,张茜,等.丝状真菌PCR模板DNA的快速制备方法[J].生物技术通报,2015(9):79-83.LUO Z Q,CHENG L,ZHANG X,et al.A rapid method of preparing DNA template of filamentous fungi for PCR amplification[J].Biotechnology Bulletin,2015(9):79-83.

[19] KLUGE J,TERFEHR D,KÜCK U.Inducible promoters and functional genomic approaches for the genetic engineering of filamentous fungi[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2018,102(15):6357-6372.

[20] ZHENG X M,ZHENG P,ZHANG K,et al.5S rRNA Promoter for guide RNA expression enabled highly efficient CRISPR/Cas9 genome editing in Aspergillus niger[J].ACS Synthetic Biology,2019,8(7):1568-1574.

[21] DONG L B,LIN X T,YU D,et al.High-level expression of highly active and thermostable trehalase from Myceliophthora thermophila in Aspergillus niger by using the CRISPR/Cas9 tool and its application in ethanol fermentation[J].Journal of Industrial Microbiology &Biotechnology,2020,47(1):133-144.

[22] ZHAO J,SHI D C,YANG S,et al.Identification of an intracellular β-glucosidase in Aspergillus niger with transglycosylation activity[J].Applied Microbiology Biotechnology,2020,104(19):8367-8380.

[23] PANG A P,WANG H Y,LUO Y S,et al.Investigating the cellular functions of β-glucosidases for synthesis of lignocellulose-degrading enzymes in Trichoderma reesei[J].Engineering Microbiology,2023,3(4):100105.

[24] GAO J,QIAN Y C,WANG Y F,et al.Production of the versatile cellulase for cellulose bioconversion and cellulase inducer synthesis by genetic improvement of Trichoderma reesei[J].Biotechnology for Biofuels,2017,10:272.

[25] 阚钦标.草酸青霉β-葡萄糖苷酶的过表达及纤维素酶新调控位点的筛选[D].济南:山东大学,2016.KAN Q B.Penicillium oxalate Kan QB.Overexpression of β-glucosidase of Penicillium oxalate and screening of new regulatory sites for cellulase[D].Jinan:Shandong University,2016.

Construction of a genetic editing system for non-model Aspergillus niger An-1 and high-efficiency expression of β-glucosidase

ZHANG Hui1,LIANG Yuxin1,WANG Xin1,2*,MA Dongxu3,GONG Dachun1,2,LYU Yucai1,2

1(College of Biological &Pharmaceutical Sciences,China Three Gorges University,Yichang 443002,China)2(Hubei Engineering Research Center for Biological Jiaosu,China Three Gorges University,Yichang 443002,China)3(College of Hydraulic &Environmental Engineering,China Three Gorges University,Yichang 443002,China)

ABSTRACT β-Glucosidase (BGL),as an important glycoside hydrolase,plays a crucial role in synthesizing functional active substances,improving food flavor,and enhancing the nutritional value of food.BGL is also a key rate-limiting enzyme for the preparation of sugar from straw to provide a next-generation carbon source for industrial fermentation.To effectively enhance the BGL activity,this study systematically optimized the preparation conditions and regeneration methods for the protoplasts and established a stable genetic transformation system for Aspergillus niger An-1.The optimal conditions of protoplast preparation were to use the mycelium cultured on solid plates as the enzymatic material and treat it with a mixture of enzymes (1% cellulose+0.5% snail enzyme+0.25% lysozyme) for 2 hours.After incubating the transformation system in STC buffer,the positive rate of transformants during resistance screening reached 100%.Subsequently,different cell wall-breaking methods were compared to optimize the efficiency of mycelial PCR.The alkaline lysis method had the highest detection efficiency of 97% when its lysate was used as the template.HQM9510 was identified as the key BGL of A.niger An-1 via the overexpression of eleven BGL genes with the red fluorescent protein as the reporter gene,Pgpd as the promoter and Tgla as the terminator.The kusA gene on the genome was precisely knocked out when the plasmid pFC332-Cas9-sgRNA and linear knockout donor (kus-up-F and kus-down-R as primers) were co-transformed into A.niger An-1.The O9510 strain overexpressing HQM9510 was obtained.With cellobiose and p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside as substrates,the BGL activity of O9510 reached 12.88 U/mL and 17.10 U/mL.This study lays a scientific foundation for the molecular engineering of A.niger An-1 to enhance its enzyme production capacity.

Key words Aspergillus niger; protoplast; genome editing; β-glucosidase; overexpression

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.042735

引用格式：张慧,梁宇馨,王昕,等.非模式黑曲霉An-1的遗传编辑体系构建及其对β-葡萄糖苷酶的高效表达[J].食品与发酵工业,2026,52(2):192-202.ZHANG Hui,LIANG Yuxin,WANG Xin,et al.Construction of a genetic editing system for non-model Aspergillus niger An-1 and high-efficiency expression of β-glucosidase[J].Food and Fermentation Industries,2026,52(2):192-202.

第一作者：硕士研究生(王昕副教授为通信作者,E-mail:wangxin54656@foxmail.com@.edu.cn)

基金项目：湖北省教育厅科学技术研究计划青年人才项目(Q20231201);湖北省自然科学基金创新发展联合基金项目(2024AFD178)

收稿日期：2025-03-16,改回日期:2025-05-22