中国传统食醋大多以高粱、小麦、麸皮、稻壳为原料,采用开放式固态发酵酿造而成。四川麸醋作为中国四大名醋之一[1],因具有醇香回甜、酸味柔和的特点,广受消费者喜爱。四川麸醋采用多边发酵,其糖化、酒精发酵、醋酸发酵同池同步进行,具有工艺简单、生产成本低等特点。此外,由于四川麸醋的曲药制作过程中添加了白叩、砂仁、杜仲、当归等10位中药[2-3],使得四川麸醋中黄酮、多酚等物质多于相同陈酿年份的其余四大名醋[4],而黄酮、多酚具有抗氧化和预防心血管疾病的功效[5]。
金山醋酸乳杆菌(Acetilactobacillus jinshanensis)首先由YU等[6]从镇江香醋发酵过程中分离获得,属于醋酸乳杆菌属,为该属唯一物种。该菌广泛存在于我国传统白酒酿造、食醋固态发酵的生产过程中。ZHOU等[7]研究表明金山醋酸乳杆菌为谷物发酵白酒中优势菌,平均丰度达93.4%。ZHANG等[8]研究表明醋酸乳杆菌具有与脂肪酸合成相关基因高度表达水平,与白酒风味形成密切相关。黄婷[9]对镇江香醋的研究表明金山醋酸乳杆菌与还原糖、乙醇等呈负相关,与乙酸、柠檬酸、10种氨基酸、8种风味物质呈正相关。王晶等[10]研究表明金山醋酸乳杆菌在赤水晒醋发酵过程中丰度增加,其与总酸、乳酸、氨基酸态氮呈正相关。上述研究均表明金山醋酸乳杆菌对中国传统固态发酵食品有着积极的影响,尤其是对食醋发酵过程中的有机酸和挥发性风味物质有着突出贡献。已有研究表明金山醋酸乳杆菌是四川麸醋发酵过程中的优势微生物[11],但是其在四川麸醋中发酵功能尚不清楚。为挖掘金山醋酸乳杆菌在四川麸醋中的作用,本研究将金山醋酸乳杆菌接种至四川麸醋中,系统地研究其对四川麸醋的影响,为后续生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
麸皮、小麦、回糟、曲药等发酵物料由四川某麸醋厂提供;金山醋酸乳杆菌从四川麸醋中分离获得,-80 ℃保藏。
亚铁氰化钾、无水葡萄糖、重铬酸钾、甲醛溶液、氢氧化钠,成都市科隆化学品有限公司;乳酸、乙酸、琥珀酸、草酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸有机酸标准品,天津市光复精细化工研究所;醋酸菌发酵剂(菌种为沪酿1.01),济宁祥园生物科技有限公司;庚酸甲酯标准品,Sigma-Aldrich公司;3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS),生工生物工厂(上海)股份有限公司。
改良MRS液体培养基,由四川农业大学研发[12]。
1.2 仪器与设备
7890A-5975C气相-质谱联用仪,安捷伦科技有限公司;DVB/CAR/PDMS三极萃取纤维头,Supelco公司;Ultimate 3000型液相色谱仪,Stratos16R台式离心机,赛默飞世尔科技公司;PHSJ-3F pH计,上海仪电科学仪器股份有限公司;DHG-9070电热鼓风干燥箱、DHG-9162电热恒温培养箱,上海一恒科学仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 金山醋酸乳杆菌菌液的活化
将金山醋酸乳杆菌接种至装有杜氏小管的MRS改良培养基中33 ℃培养3～5 d,直至杜氏小管中产生气泡,活化2～3次。将活化后的菌液4 000 r/min离心10 min,收集沉淀,生理盐水洗涤2～3次。采用无菌生理盐水进行重悬,调整菌液浓度至108 CFU/mL,制备成金山醋酸乳杆菌发酵剂。
1.3.2 四川麸醋固态发酵及投料
以四川麸醋发酵工艺为参考,进行投料和发酵[13]。将混合均匀后的发酵物料A在121 ℃灭菌20 min,后将冷却后的发酵物料A与发酵剂B充分混合。发酵物料A经灭菌处理后与四川麸醋生料发酵具有一定差异,但这排除了发酵物料A中金山醋酸乳杆菌等微生物的干扰,同时发酵物料A中淀粉经高温糖化后更易被微生物利用。主要发酵物料如表1所示,其中实验组(DJC)、空白组(DC)的差异为是否添加金山醋酸乳杆菌,其余物料均相同,2组总质量约为1 kg。将混合均匀的物料置于2 L烧杯中,在30 ℃恒温培养箱中进行发酵,每隔48 h翻醅1次并进行取样。当总酸含量达到4 g/100 g时则终止发酵。
表1 四川麸醋发酵主要原料
Table 1 Main raw materials for fermentation of Sichuan bran vinegar
组别物料DJC组/gDC组/g物料A 回糟500500小麦120120水220220麸皮200200发酵剂B曲药2323醋酸菌发酵剂22金山醋酸乳杆菌发酵剂20—
注:—表示不添加。
1.3.3 基础理化指标的测定
醅温采用金属温度探测器测量,每天早中晚各测定1次。水分含量采用烘干法进行测定。总酸含量采用GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定(含第1号修改单)》中的pH计电位滴定法测定。氨基酸态氮含量采用GB 5009.235—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》中酸度计法测定。淀粉含量采用GB 5009.9—2023《食品安全国家标准 食品中淀粉的测定》的酶水解法测定。采用DNS法测定样品中的还原糖含量[14]。
1.3.4 有机酸种类及含量的测定
参考COCCHI等[15]方法,利用HPLC对食醋中乳酸、乙酸、琥珀酸、草酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸这7种有机酸含量进行分析,具体方法如下:
样品前处理:准确称取6.00 g醋醅,加入24 mL 9 mmol/L H2SO4溶液,28 ℃超声萃取30 min,4 ℃ 8 000 r/min离心10 min,收集上清液。随后取上清液6 mL,加入2 mL硫酸锌(30%,质量分数)、2 mL亚铁氰化钾(10.6%,质量分数)和2 mL超纯水,混匀后静止30 min,4 ℃ 8 000 r/min离心10 min,收集上清液。上清液过活化后的Sep-Pak C18固相萃取小柱,最后过0.22 μm滤膜,滤液用于有机酸的HPLC分析。
HPLC分析条件:HICHROM ALLTECH OA-1000色谱柱(300 mm×6.5 mm,9 μm);流动相:100% 9 mmol/L H2SO4溶液;进样量:10 μL;柱温:75 ℃;流速:0.6 mL/min;检测波长:210 nm。
定量分析:通过测定不同浓度的有机酸标准样品,构建标准曲线,确定样品中各有机酸含量。
1.3.5 挥发性风味物质含量的测定
参考WU等[16]方法采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)测定醋醅中挥发性风味物质,具体方法如下:
取2.00 g醋醅于样品瓶中,同时加入20 μL 0.1 mg/mL庚酸甲酯内标物,置于40 ℃水浴锅中,预热30 min,固相微萃取30 min,随后250 ℃解吸5 min。
色谱条件:DVB/CAR/PDMS三极性萃取头;HP-5MS弹性毛细管柱;以氦气为载气,流量1.2 mL/min,不分流;柱温:起始温度30 ℃,以3 ℃/min的速度升至150 ℃,之后以5 ℃/min的速度升至180 ℃,再以10 ℃/min速度升至250 ℃并保持3 min。
质谱条件:进样口温度:250 ℃;离子源温度:230 ℃;传输线温度:280 ℃;四级杆温度:150 ℃;电子能量:70 eV;扫描范围m/z:30～400。
数据分析:检索谱库使用NIST20谱库,选择匹配度需大于80%的物质,通过峰面积归一化法来测定化合物的含量,并进行统计分析。
1.4 数据分析
每个实验重复3次,采用Microsoft Excel 2021进行数据处理,采用IBM SPSS Statistics 27进行显著性分析,最后采用Origin 2022进行绘图。
2 结果与讨论
2.1 四川麸醋发酵过程中理化指标变化
温度和水分含量是反应四川麸醋发酵状态的重要指标,四川麸醋发酵过程中温度和水分含量变化如图1所示。在发酵过程中培养箱控制温度均为30 ℃,但由于醋醅中微生物的生长代谢,醅温始终大于30 ℃。在发酵过程中醅温呈现先升高后降低的变化趋势。DJC组中添加了金山醋酸乳杆菌,其微生物代谢更加旺盛,使得DJC组的醅温在发酵过程中始终大于DC组(图1-a)。醋醅中的水分变化与微生物代谢、醅温变化以及原料结构密切相关[17]。在发酵过程中醋醅中的水分含量呈升高趋势(图1-b),这可能与微生物在代谢过程中产生的水分和醋醅中的麸皮等原料具有良好的吸水能力有关。
a-温度;b-水分
图1 四川麸醋发酵过程中温度和水分变化趋势
Fig.1 Changes of temperature and moisture during the fermentation process of Sichuan bran vinegar
在发酵初期DJC组和DC组中淀粉含量在16.10 g/100 g左右,在曲药中糖化酶、液化酶以及多种霉菌的作用下,使得醋醅中淀粉含量呈下降趋势,淀粉利用率为45%(图2-a)。DJC组中微生物代谢更加旺盛,使得其淀粉利用率较DC组提高了约8.70%。还原糖含量在发酵过程中整体呈现下降趋势(图2-b),四川麸醋采用边糖化边发酵模式,淀粉在被水解的过程中,糖类物质也在一同被消耗。在发酵结束时,DJC组和DC组中还原糖含量分别为1.54、1.77 g/100 g,这也说明了DJC组微生物代谢更旺盛。
a-淀粉含量;b-还原糖含量;c-总酸含量;d-氨基酸态氮含量
图2 四川麸醋发酵过程中理化因子变化趋势
Fig.2 Changes of physicochemical factors during the fermentation process of Sichuan bran vinegar
总酸是评价食醋的重要指标,同时也是判断发酵终点的关键。在发酵过程中总酸呈先升高后趋于稳定(图2-c)。在发酵4～6 d,DC中总酸含量无显著变化,由于金山醋酸乳杆菌具有较强的耐酸能力[18-20],使得DJC组中总酸含量从第4天的3.89 g/100 g升高至第6天的4.18 g/100 g。发酵终点时,DJC组中总酸较DC组提高了9.78%。氨基酸态氮含量的高低反应了食醋中游离氨基酸含量。食醋中氨基酸是主要的呈味物质,具有丰富营养价值[21]。在发酵过程中,由于原料中蛋白质的分解以及微生物在酸性环境下自溶,使得醋醅中氨基酸态氮含量呈上升趋势,在发酵终点DJC组氨基酸态氮含量较DC组提高了8.15%(图2-d)。
2.2 四川麸醋发酵过程中有机酸变化
有机酸是食醋中风味来源之一,采用HPLC对醋醅中7种有机酸进行检测,结果如图3所示。总有机酸含量大体呈上升趋势,发酵终点时DJC组中有机酸含量达到4 500 mg/100 g,比DC组高3.5%左右。乳酸和乙酸是四川麸醋中主要的有机酸,占总有机酸含量可达90%以上。在发酵终点时,DJC组中乙酸含量大于乳酸含量,这与传统发酵的四川麸醋存在差异。导致这种差异的原因可能是本次发酵与传统发酵相比醅层较浅,厌氧程度较低,使得醋酸菌生长更加旺盛,从而产生较多的乙酸。乳酸具有酸味柔和,醇厚的特点。DJC组中添加金山醋酸乳杆菌,使得其乳酸含量显著高于DC组,约是DC组的3倍。孙佳[22]研究表明金山醋酸乳杆菌能够显著提高镇江香醋中乳酸含量,这与本研究一致。金山醋酸乳杆菌具有较强的产乳酸能力,提高食醋中乳酸比例,从而改善食醋的协调性,使得食醋口感更加醇厚。在四川麸醋发酵过程中除乙酸、乳酸外,还检测出琥珀酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、草酸。值得注意,苹果酸在DJC组和DC组发酵前期含量均高于350 mg/100 g,但是随着发酵的进行其含量不断下降,这可能与苹果酸作为生长因子,促进醋酸菌生长有关[23]。
图3 四川麸醋发酵过程中有机酸变化趋势
Fig.3 Changes of organic acids during the fermentation process of Sichuan bran vinegar
2.3 四川麸醋发酵过程中挥发性风味变化
采用HS-SPME-GC-MS测定醋醅中挥发性物质,共检测出48种风味物质,其中醇类5种、酸类4种、酯类27种、醛类3种、酮类5种、其他4种。总挥发性风味物质数量及含量如图4所示,在DJC组和DC组发酵过程中挥发性风味物质含量和数量均呈上升趋势,其中酯类物质数量较多,以乙酸为主的酸类物质含量最高。值得注意的是在发酵过程中酯类物质的含量并非呈一直上升的趋势,发酵第2天的酯类含量显著高于发酵第4天,这可能与四川麸醋的多边发酵相关。
a-挥发性风味物质数量;b-挥发性风味物质含量
图4 四川麸醋发酵过程中挥发性风味物质数量及含量变化趋势
Fig.4 Changes in the quantity and content of volatile flavor compounds during the fermentation of Sichuan bran vinegar
采用气味活性分析(odor active value,OAV)对发酵过程中的挥发性风味物质进行研究,一般认为OAV>1说明该物质对样品风味具有重要作用。在发酵过程中共有2种醇类、9种酯类、2种醛类、1种酮类以及3种其他类物质被认为对风味有着重要的影响(图5)。
图5 四川麸醋发酵过程中特征风味物质热图
Fig.5 Heatmap of characteristic flavor compounds during the fermentation process of Sichuan bran vinegar
苯乙醇、异戊醇在DJC组和DC组中均检出,这2种醇类物质分别赋予食醋花香和果香。酯类物质具有低阈值的特点,能赋予食醋独特的水果甜味和花香味。在发酵终点时,DJC组中乙酸戊酯(香蕉味)、月桂酸乙酯(果香味)、乙酸苯乙酯(玫瑰香)含量最高,而DC组中乙酸异戊酯(香蕉味)、乙酸己酯(苹果香)、乙酸异丁酯(水果香)含量最高,这种差异可能与金山醋酸乳杆菌代谢相关。苯甲醛和壬醛在DJC组中含量高于的DC组,其中苯乙醛具有花香味是某些氨基酸的前提物质[24],壬醛具有柑橘香和花香。3-羟基-2-丁酮呈现愉悦的奶油香,在四大名醋中均有所检出[25],是食醋中重要的风味物质之一。在DJC组发酵过程3-羟基-2-丁酮不断累积,其含量显著高于DC组。在发酵终点时,DJC组中2-正戊基呋喃含量显著高于DC组,有研究报道2-正戊基呋喃可能是紫林牌食醋的特征性风味成分,其具有果香味[26]。愈创木酚(辛辣味)和4-乙烯基愈创木酚(香辛料味)等被认为是酱油中的特征风味物质[27],在发酵终点时DC组含量高于DJC组。上述结论表明金山醋酸乳杆菌在食醋发酵过程中可以在一定程度上提高特征风味物质含量,改善食醋风味。
2.4 主成分分析
选择四川麸醋发酵过程中的理化指标及主要有机酸、特征风味物质进行主成分分析,结果如图6所示。图6-a结果显示,第一主成分贡献率为63.3%,第二主成分贡献率为16.2%,累积贡献率为79.5%;图6-b结果显示,第一主成分贡献率为46.7%,第二主成分贡献率为29.4%,累积贡献率为76.1%,两者累积贡献率均超过75%,因此可以很好地代表样品的整体信息[28]。由图6-a可知,随着DC组发酵不断的进行,其与乙酸、氨基酸态氮、总酸正相关性不断增加,但依然与乳酸呈负相关,而DJC组与氨基酸态氮、总酸、乙酸、乳酸等均呈正相关。在发酵终点时,DJC-6 d在总酸、氨基酸态氮、乙酸、乳酸等的正向投影长度均大于DC-6 d,这说明DJC组发酵终点时与总酸、氨基酸态氮、乙酸、乳酸的相关性强于DC组[29]。以上分析表明,通过添加金山醋酸乳杆菌可以有效提高四川麸醋发酵过程中总酸、氨基酸态氮、乙酸、乳酸等含量。由图6-b可知,DJC-6 d与DC-6 d具有较大差异,DJC-6 d主要与3-羟基-2-丁酮、乙酸戊酯、乙酸己酯、苯乙醇、壬醛等风味物质呈正相关,DC-6 d主要与乙酸异丁酯、乙酸苯乙酯、4-乙烯基愈创木酚等风味物质呈正相关。DJC-6 d与DC-6 d相比,其与更多的风味物质呈正相关,这说明金山醋酸乳杆菌参与四川麸醋发酵可以在一定程度上能改善食醋风味。
a-理化指标和主要有机酸与组别的主成分分析;b-挥发性风味物质与组别的主成分分析
图6 主成分分析
Fig.6 Principal component analysis
3 结论
通过模拟四川麸醋发酵过程,添加金山醋酸乳酸菌确定其对四川麸醋发酵品质的影响。对发酵过程中理化指标进行测定,实验结果表明添加金山醋酸乳杆菌使得四川麸醋发酵过程醅温更高,发酵终点淀粉利用率提高了8.70%,总酸含量提高了9.78%,氨基酸态氮含量提高了8.15%。这说明金山醋酸乳杆菌参与四川麸醋发酵,可以有效提高原料利用率,增加食醋得率。采用HPLC对发酵过程中有机酸含量进行测定,结果表明金山醋酸乳杆菌使得四川麸醋中乳酸含量提高近3倍,说明金山醋酸乳杆菌具有较强的产乳酸能力。HS-SPME-GC-MS结合OAV对四川麸醋发酵过程中挥发性风味物质进行分析,结果表明金山醋酸乳杆菌显著提高了四川麸醋中乙酸戊酯、月桂酸乙酯、苯甲醛、壬醛、3-羟基-2丁酮、2-正戊基呋喃等风味物质含量,在一定程度上改善了四川麸醋风味品质。
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