酱腌芥菜是我国传统发酵食品的典型代表,拥有两千余年的历史底蕴[1-3]。早期,由于芥菜组织富含水分,易滋生微生物,高盐腌制成为其长期保藏的主要手段[4-5]。随着现代健康理念的普及,产业正逐步从传统高盐工艺向低盐技术转型,以顺应高质量发展趋势[6-7]。然而,盐分降低显著改变了酱腌芥菜的渗透压环境,使得腐败微生物(如芽孢杆菌属、不动杆菌属等)的生长抑制能力减弱,导致产品货架期大幅缩短[8]。目前广泛使用的化学防腐剂(山梨酸钾、苯甲酸钠)虽成本低廉,但存在低效问题和安全隐患[9-12]。因此,开发高效、安全的新型复配天然防腐剂,以保障低盐酱腌芥菜的品质稳定,已成为替代传统化学防腐剂的关键突破口。
天然防腐剂因其天然、安全的特性备受关注,这类防腐剂源自食品成分,对人体无害,还能优化食品风味品质[13],可推动食品防腐技术向天然化转型[14]。目前,ε-聚赖氨酸、乳酸链球菌素、壳聚糖和肉桂醛等天然防腐剂已成为国内外研究热点[15],各具特色:ε-聚赖氨酸作为一种阳离子抗菌肽,具有水溶性好、无毒无味、可生物降解等优势,其广谱抑菌特性及宽pH使用范围使其在食品保鲜领域应用广泛[16];乳酸链球菌素作为研究最深入的细菌素,能高效抑制革兰氏阳性菌,如芽孢杆菌[17-18];壳聚糖由甲壳素脱乙酰基制得,兼具抑菌功能和成本优势,对多种细菌和真菌均有抑制作用[19-20];肉桂醛作为植物次级代谢产物,因其广谱抑菌作用而被视为极具开发价值的天然防腐成分[21]。研究发现,单一天然防腐剂虽对特定微生物有效,但普遍存在抗菌谱系有限、作用时效短等问题[15]。通过科学复配多种天然防腐剂,可产生协同增效作用,不仅能拓宽抑菌谱(对革兰氏阳性菌、阴性菌及真菌均有效),还能显著延长食品保质期。然而,关于新型复配天然防腐剂技术方案并针对性应用于酱腌芥菜防腐保鲜的研究仍未见报道。
前期研究采用高通量技术对酱腌芥菜样品进行微生物群落测序,确定其主要腐败菌为贝莱斯芽孢杆菌与鲍曼不动杆菌,次要腐败菌为盐枝芽孢杆菌和短小芽孢杆菌;并结合传统培养法对上述腐败菌进行分离、纯化及16S rDNA鉴定。在此研究基础上,本研究首先通过最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)试验筛选出高效天然防腐剂;其次采用棋盘稀释法构建二元复配体系,结合分级抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index,FICI)评估协同效应;进一步通过单因素试验并应用响应面法优化防腐剂的最佳配比;最后通过加速试验验证复配天然防腐剂对酱腌芥菜的防腐效果。该研究旨在开发一种高效新型复配天然防腐剂技术方案,在保持酱腌芥菜原有营养品质和风味特征的前提下延长产品货架期,为酱腌芥菜工业化生产提供可靠的技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
供试菌株:贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、盐枝芽孢杆菌(Virgibacillus salarius)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),湖南海霸食品有限公司提供的酱腌芥菜中分离纯化,经分子生物学方法鉴定。
ε-聚赖氨酸(食品级),捷恒生物科技有限公司;ε-聚赖氨酸盐酸盐(食品级),江苏一鸣生物股份有限公司;乳酸链球菌素(食品级)、溶菌酶(食品级),河南中辰生物科技有限公司;壳聚糖(食品级),河南万邦化工科技有限公司;肉桂醛(食品级),武汉拉那白医药化工有限公司;茶多酚(食品级),安徽红星药业股份有限公司;苯甲酸钠(食品级),武汉有机实业有限公司;山梨酸钾(食品级),山东昆达生物科技有限公司;乙酸(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;麦氏比浊管,比克曼生物科技有限公司;营养琼脂培养基、LB肉汤培养基、平板计数琼脂培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂、无菌磷酸盐缓冲溶液袋,青岛海博生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
HVA-85全自动压力蒸汽灭菌锅,江苏肯尔菲实验仪器贸易有限公司;BIOsafe12生物安全柜,上海力申科学仪器有限公司;LRH-250生化培养箱,上海一恒科技有限公司;DKZ-450B电热恒温振荡水槽,上海森信实验仪器有限公司;H1850高速台式离心机,湘仪离心机仪器有限公司;RT-2100C酶标分析仪,深圳雷杜生命科学股份有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌悬液的制备
细菌在营养琼脂培养基上38 ℃活化24 h,备用。将活化后的菌种用无菌磷酸盐缓冲液配制成浓度1×108 CFU/mL(麦氏比浊管法)菌悬液,备用。
1.3.2 混合细菌的制备
将4株供试菌株分别接种到5 mL的LB液体培养基中,37 ℃培养24 h后,分别取1 mL菌悬液混合(1∶1∶1∶1),9 000 r/min离心8 min,再用无菌磷酸盐缓冲液洗涤沉淀,然后用5 mL的无菌磷酸盐缓冲液重悬浮沉淀,得到1×107 CFU/mL菌悬液。
1.3.3 MIC和MBC的测定
称取一定量防腐剂分别加入到LB肉汤培养基中,进行2倍梯度稀释,按照6 400、3 200、1 600、800、400、200、100、50、25、12.5 μg/mL质量浓度从高到低的顺序,依次加入到8×12型无菌96孔板中,每孔中添加量为200 μL。再向每孔中加入5 μL浓度为1×106 CFU/mL菌悬液,加样完成后用酶标仪测定0 h的OD630,然后将微孔板放入37 ℃培养箱中静置培养24 h。培养完成后,再次测定每孔OD630,2次测定OD630数值变化量ΔOD630≤0.2的浓度即为该防腐剂的MIC。同时结合肉眼观察也可判定MIC。第11孔不加防腐剂为阳性对照组,第12孔不加菌液为阴性对照组,若阴性对照组污染,则试验失败。
在无菌条件下,从MIC以及大于MIC浓度的96孔板中取出50 μL培养液,然后分别涂布到营养琼脂培养基平板上,细菌放置在37 ℃培养箱培养24 h。培养完成后观察是否有菌落生长,最低浓度下没有菌落生长的平板为该防腐剂的MBC。
1.3.4 防腐剂联合抑菌效果的测定
1.3.4.1 棋盘法的测定
采用棋盘式微量液体稀释法(棋盘法)[22]测定防腐剂协同使用(乳酸链球菌素+壳聚糖;乳酸链球菌素+肉桂醛;乳酸链球菌素+ε-聚赖氨酸;壳聚糖+肉桂醛;壳聚糖+ε-聚赖氨酸;肉桂醛+ε-聚赖氨酸)对腐败菌的抑菌效果。
在无菌条件下,利用96孔板中的第1列至第8列以及A行至H行组成的64孔“棋盘”来进行加样。如图1所示,每个孔中包括含有不同浓度A、B防腐剂的LB培养基共200 μL。最后向每个孔中接种5 μL浓度为1×106 CFU/mL的菌悬液,混合均匀,用酶标仪测定每个样品在0 h的OD630,记录数值。将96孔板盖好盖子,放入37 ℃静置培养24 h后,测定每个样品24 h的OD630,并记录数值。
图1 联合MIC示意图
Fig.1 Schematic diagram of combined MIC
1.3.4.2 FICI的测定
结果以FICI作为联合防腐剂试验的判断依据[23]:FICI≤0.5为协同作用;0.5
(1)
式中:FICI,分级抑菌浓度指数;OICA,2种防腐剂联合使用A防腐剂最小抑菌浓度,μg/mL;OICB,2种防腐剂联合使用B防腐剂最小抑菌浓度,μg/mL;MICA,A防腐剂单独使用最小抑菌浓度,μg/mL;MICB,B防腐剂单独使用最小抑菌浓度,μg/mL。
1.3.5 单一防腐剂抑菌效果测定
不同浓度的单一防腐剂制备:分别制备含不同浓度的ε-聚赖氨酸、乳酸链球菌素、壳聚糖和肉桂醛(500、400、300、200、100、75、50、25、12.5、0 μg/mL)、山梨酸钾和苯甲酸钠(1 000、800、600、400、200、100、50、25、0 μg/mL)的防腐剂溶液,其中乳酸链球菌素、山梨酸钾和苯甲酸钠参照GB 2760—2024 《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中规定最大允许使用范围。
通过添加0.02%(体积分数)无水乙酸模拟酱腌芥菜酸性体系,在细胞培养板的每孔中加入100 μL的LB培养基,向每孔中加入配好的防腐剂100 μL,以未添加防腐剂(添加100 μL无菌水)为对照组,然后向每孔中加入5 μL菌悬液,加样完成后用酶标仪测定0 h OD630,然后将细胞培养板放入37 ℃恒温培养箱中低速振荡培养12 h。培养完成后,测定12 h OD630。根据抑菌率判断防腐剂抑菌效果,计算如公式(2)所示:
(2)
式中:Y,抑菌率,%;A1,阳性对照组0 h吸光值;A2,阳性对照组12 h吸光值;A3,添加防腐剂组0 h吸光值;A4,添加防腐剂组12 h吸光值。
1.3.6 响应面法优化复配天然防腐剂中各成分比例
根据单一防腐剂抑菌效果试验,该试验设计四因素三水平响应面,根据其水平设计,采用不同浓度ε-聚赖氨酸(A)、乳酸链球菌素(B)、壳聚糖(C)、肉桂醛(D)的用量,如表1所示。
表1 Box-Behnken 实验设计与编码水平 单位:μg/mL
Table 1 Experiment design and code level of Box-Behnken design
1.3.7 复配天然防腐剂在酱腌芥菜中防腐效果验证
在传统酱腌芥菜加工过程中添加复配天然防腐剂(ε-聚赖氨酸180 μg/mL、乳酸链球菌素102 μg/mL、壳聚糖121 μg/mL、肉桂醛100 μg/mL),并以企业标准添加化学防腐剂方案(苯甲酸钠266 μg/mL、山梨酸钾266 μg/mL、脱氢乙酸钠80 μg/mL)为阳性对照组,同时将未添加防腐剂为空白对照组。将制备完成的酱腌芥菜用无菌包装袋分装,每袋定量(200±5) g,密封后置于37 ℃恒温培养箱中进行加速贮藏试验。自试验开始之日起,每隔3 d取样一次,检测大肠菌群数和菌落总数。
1.3.8 酱腌芥菜感官质量评价
参照刘腾霞等[24]酱腌菜感官评定的方法以及SB/T 10439-2007 《酱腌菜》标准,并稍作修改。6人组成感官评定小组,第7天对每组样品分别从色泽、香气、滋味、体态、质地等方面进行感官评定,并给出各自评分值,具体评分标准见表2。
表2 酱腌芥菜感官质量评价
Table 2 Sensory evaluation of pickled mustard
指标表征评分色泽表面呈鲜绿褐色,无发霉,有光泽9～10表面呈深绿褐色,无发霉,有较淡光泽6～8表面呈黄褐色,发霉严重,无光泽0～5香气有较强鲜香气,无其他异味9～10有轻微鲜香气,无其他异味6～8无鲜香气,霉味酸味严重0～5滋味酸香爽口,无不良味道9～10鲜香味较淡,无不良味道6～8难以下咽0～5体态饱满,无脱水9～10较饱满,部分脱水6～8凹陷,脱水严重0～5质地脆嫩适口,无粗糙感9～10较脆嫩适口,无粗糙感6～8无脆嫩感,软败0～5
1.3.9 大肠菌群的测定
按照GB 4789.3—2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》的方法,进行大肠菌群的计数。
1.3.10 菌落总数的测定
按照GB 4789.2—2022 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》的方法,进行菌落总数的测定。
1.4 统计分析
使用SciDAVis 2.9.2软件进行数据统计、分析及绘图。
2 结果与分析
2.1 MIC和MBC的测定
由表3和表4可知,天然防腐剂ε-聚赖氨酸、乳酸链球菌素、壳聚糖和肉桂醛对腐败菌的MIC值和MBC值明显低于化学防腐剂山梨酸钾和苯甲酸钠,其中ε-聚赖氨酸、乳酸链球菌素、壳聚糖和肉桂醛对腐败细菌的MIC值都≤1.6 mg/mL,MBC值都≤6.4 mg/mL,说明天然防腐剂对腐败细菌表现出较好的抑制效果。革兰氏阴性菌鲍曼不动杆菌对ε-聚赖氨酸盐酸盐、茶多酚和溶菌酶都具有很强的耐受作用,MIC值和MBC值均>6.4 mg/mL。因此后续研究将选用ε-聚赖氨酸、乳酸链球菌素、壳聚糖和肉桂醛4种天然防腐剂,并以化学防腐剂山梨酸钾和苯甲酸钠作为对照组,通过响应面试验优化针对酱腌芥菜主要腐败菌的复配防腐方案。
表3 不同防腐剂对腐败菌的MIC 单位:mg/mL
Table 3 MIC of different preservatives against spoilage bacteria
注:-表示防腐剂的MIC>6.4 mg/mL。
表4 不同防腐剂对腐败菌的MBC 单位:mg/mL
Table 4 MBC of different preservatives on spoilage bacteria
注:-表示防腐剂的MBC>6.4 mg/mL。
2.2 防腐剂联合抑菌效果
通过棋盘法计算FICI可以评估防腐剂相互作用关系[25]。由表5可知,壳聚糖和ε-聚赖氨酸对混合细菌呈现协同作用,联合MIC分别为25、100 μg/mL,而对混合细菌单独MIC分别为100、160 μg/mL,表明联合使用防腐剂相比于单独使用防腐剂最小抑菌浓度分别降低了75%和94%。虽然单独使用ε-聚赖氨酸对混合细菌抑菌效果不是很好,但是当2种防腐剂复配却呈现出较好的协同抑菌效果。可能是因为ε-聚赖氨酸能破坏细胞壁结构,引起细胞内容物溶出[26],而壳聚糖氨基的质子化能与细胞膜表面负电荷产生静电相互作用和膜蛋白快速结合,进而加速细胞内容物被完全释放,从而起到较好的协同抑菌效果[27]。相关研究表明壳聚糖和ε-聚赖氨酸均能通过破坏细胞壁和细胞膜、产生氧化应激反应等机制来抑制肉食杆菌的生长[28]。
表5 不同防腐剂对腐败菌的联合抑菌效果
Table 5 Combined antibacterial effect of different preservatives on spoilage bacteria
2.3 单一防腐剂对腐败菌的抑菌效果
如图2所示,天然防腐剂整体呈现显著优于化学防腐剂的抑菌效果:ε-聚赖氨酸在150 μg/mL最佳浓度下,对混合细菌的抑菌率达64.5%;乳酸链球菌素(100 μg/mL)对贝莱斯芽孢杆菌具有86.3%的高效抑菌率,但对鲍曼不动杆菌及混合细菌抑菌效果欠佳;壳聚糖(100 μg/mL)和肉桂醛(100 μg/mL)对混合细菌分别展现出86.1%和83.4%的显著抑菌效果。相比之下,常规化学防腐剂虽表现出随浓度升高抑菌率递增,但对目标腐败菌的整体抑菌效果仍显不足。值得注意的是,尽管化学防腐剂在酱腌菜工业中应用广泛,但其在本研究体系中的实际抑菌效果明显低于天然防腐剂。因此,选用天然防腐剂不仅因其添加量低,且兼具高安全性与显著抑菌效果。
a-ε-聚赖氨酸;b-乳酸链球菌素;c-壳聚糖;d-肉桂醛;e-山梨酸钾;f-苯甲酸钠
图2 不同防腐剂对腐败菌的抑菌效果
Fig.2 Antibacterial effect of different preservatives on spoilage bacteria
2.4 响应面法优化复配天然防腐剂中各成分比例
由表6可知,根据Design Expert 8.0.6 trial软件进行Box-Behnken设计得到29组实验,根据此29组实验设计进行具体试验,其中每组试验设3组平行,以菌落总数为响应值(R1),实验结果经软件分析得到R1与四因素(A、B、C、D)的回归方程,R1极值即为预期菌落总数,所对应的四因素取值即为复配防腐剂中各组分配比。
表6 Box-Behnken试验设计及结果
Table 6 Design and results of Box-Behnken test
续表6
利用Design-Expert 13软件对实验数据进行多元回归拟合,得到以菌落总数为目标函数的回归方程:
Y=173.90A2+232.96B2+322.65C2+375.46D2+160.00AB-72.50AC-158.75AD-247.50BC+174.38BD-306.25CD-237.08A+66.04B-492.08C-67.29D+812.00。
对回归方程进行方差分析,由表7可知,建立的菌落总数回归模型达到极显著水平(F=40.16,P<0.000 1);失拟项差异不显著(P=0.269 8>0.05),说明该模型的拟合程度较好,试验模型合理。此外,方程相关系数为R2=0.975 7,调整相关系数为
说明该模型可以解释防腐剂对菌落总数的变化,可以用于复配防腐剂配方优化的理论预测。回归模型的方差分析可以判断自变量对因变量的影响程度[29]。进一步分析表明,一次项A、C对响应值的影响较大,达到了极显著水平(P<0.01),而B、D对响应值的影响则表现为显著水平(P<0.05);模型中的交互项AB、AD、BC、BD、CD对响应值的影响较大,达到极显著水平(P<0.01),而AC影响则不显著(P>0.05);二次项A2、B2、C2、D2对响应值的影响较大,都达到极显著水平(P<0.01)。比较各因素F值大小可知,防腐剂对酱腌芥菜菌落总数的影响大小依次为:壳聚糖(C)>ε-聚赖氨酸(A)>肉桂醛(D)>乳酸链球菌素(B)。
表7 回归方程的方差分析
Table 7 Analysis of variance of regression model
注:*表示显著(P<0.05);**表示极显著(P<0.01);—表示不显著(P>0.1)。
由图3可知,响应值随着ε-聚赖氨酸与壳聚糖两者浓度的变化幅度较小,说明ε-聚赖氨酸与壳聚糖交互作用对酱腌芥菜菌落总数的影响较小;而壳聚糖与
图3 防腐剂交互作用对菌落总数的响应面图
Fig.3 Response surface plot of preservative interaction effects on total bacterial count
肉桂醛两者浓度的变化幅度较大,说明壳聚糖与肉桂醛交互作用对酱腌芥菜菌落总数的影响较大。此外,根据二次多元回归方程优化结果,该复配天然防腐剂的最佳配方为:ε-聚赖氨酸180 μg/mL、乳酸链球菌素102 μg/mL、壳聚糖121 μg/mL和肉桂醛100 μg/mL(考虑到实际生产要求,已经对预测值进行校正)。在该配方条件下,酱腌芥菜的菌落总数预测值为508 CFU/mL。为检验响应面模型的可靠性,在该配方条件下进行6次重复试验,酱腌芥菜(常温25 ℃,贮存3 d)的菌落总数实际值为533 CFU/mL,与模型理论预测值的偏差约为4.92%,说明该响应面回归模型具有准确性和可靠性,可用于确定复配天然防腐剂中各成分比例。
2.5 复配天然防腐剂对酱腌芥菜防腐效果验证
2.5.1 酱腌芥菜感官质量评价
对添加不同防腐剂(天然防腐剂、化学防腐剂)及未添加防腐剂的酱腌芥菜进行了感官评价分析。如图4-a所示,3种处理的酱腌芥菜在感官品质上存在显著差异。在色泽方面,添加防腐剂(尤其是天然防腐剂)的样品呈现鲜亮的绿褐色且富有光泽,而未添加组则表现为暗沉的深绿褐色。香气特征显示,天然防腐剂处理组具有突出的鲜香气息和协调的酸味,其他2组仅呈现轻微鲜香。滋味评价中,添加防腐剂的产品酸香爽口、风味协调,而未添加组则出现明显的风味劣变。质构特性方面,防腐剂处理组保持了良好的脆嫩质地和饱满体态,而未添加组出现部分软化和脱水现象。综合各感官指标,天然防腐剂处理组在色泽、香气、滋味和质地等方面均表现出最优的感官品质,其次为化学防腐剂组,未添加防腐剂组的整体感官评分最低。这一结果说明适当添加防腐剂,特别是天然防腐剂,能有效保持酱腌芥菜的感官品质。
a-感官评分雷达图;b-大肠菌群的变化;c-菌落总数的变化
图4 防腐剂对酱腌芥菜的防腐效果
Fig.4 Preservative efficacy of preservatives on pickled mustard
2.5.2 大肠菌群的变化
如图4-b所示,与未添加防腐剂的对照组相比,经天然防腐剂和化学防腐剂处理的酱腌芥菜中大肠菌群数量均显著降低。在21 d的贮藏期内,2组防腐剂处理的大肠菌群数量均在12 d达到峰值,其中天然防腐剂组为350 CFU/mL,较化学防腐剂组(376 CFU/mL)低6.9%。这一差异表明,天然防腐剂在抑制大肠菌群增殖方面具有相对优势,其保鲜效果优于企业现行使用的化学防腐剂。
2.5.3 菌落总数的变化
如图4-c所示,添加天然防腐剂和化学防腐剂处理后酱腌芥菜中的菌落总数显著低于未添加防腐剂处理组。值得注意的是,天然防腐剂组在整个贮藏期间表现出更稳定的抑菌效果,其菌落总数波动范围明显小于化学防腐剂组。贮藏至第18天时,天然防腐剂组的菌落总数(8×103 CFU/mL)远低于化学防腐剂组(1.15×104 CFU/mL)。结果表明,所采用的复配天然防腐剂不仅能有效维持酱腌芥菜的微生物安全性,其防腐效果还优于企业目前采用的化学防腐剂方案。
3 结论
本研究旨在研发一种新型复配天然防腐技术,在维持酱腌芥菜产品品质的前提下延长其货架期,为企业长期面临的防腐保鲜难题提供解决方案。通过系统评估选用ε-聚赖氨酸、乳酸链球菌素、壳聚糖和肉桂醛4种天然防腐剂,采用棋盘法分析二元复配体系的协同效应,发现壳聚糖与ε-聚赖氨酸联合使用对混合腐败菌(FICI=0.5)呈现协同作用,联合MIC较单独应用降低75%～94%,其机制可能与壳聚糖破坏细胞膜、ε-聚赖氨酸诱导细胞壁破裂的协同作用相关。单因素试验证实,天然防腐剂的抑菌效果显著优于传统化学防腐剂。通过响应面法优化的复配配方(ε-聚赖氨酸180 μg/mL、乳酸链球菌素102 μg/mL、壳聚糖121 μg/mL、肉桂醛100 μg/mL),菌落总数降至533 CFU/mL(预测值偏差4.92%)。感官评价显示,复配天然防腐剂组在色泽、香气和质地上均优于化学防腐剂组,且无风味劣变。通过复配技术解决了单一天然成分的抑菌局限性,结合响应面模型实现配比精准优化,为低盐酱腌芥菜提供了一种高效、安全的防腐替代方案。该研究不仅减少了对化学防腐剂的依赖,还提升了产品的感官品质,符合酱腌菜工业绿色转型需求。未来需进一步探究复配天然防腐剂在不同贮藏条件下的长期稳定性及其对风味物质的影响,以推动防腐技术的规模化应用。
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