酱油原液气味萃取方法优化与其成分表征

酱油作为一种传统的发酵调味品,其独特的风味深受消费者喜爱。酱油的风味不仅决定了其品质,还在中式烹饪中扮演着重要角色。近年来,随着人们对食品风味研究的深入,酱油中的香气成分及其形成机制逐渐成为研究热点。酱油的香气成分复杂多样,主要源于发酵过程中的微生物代谢、美拉德反应以及油脂的热解等[1]。鉴于其香气体系的复杂性,需采用适宜的前处理方法,才能真实、准确地揭示香气成分组成[2]。

目前香气成分的提取与收集常采用蒸馏法、顶空分析技术、直接萃取方法(液液萃取、液固萃取和超临界萃取)等。上述提取方法常与气相色谱质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)、气相色谱嗅觉检测技术(gas chromatography-olfactometry,GC-O)等分离技术联合应用。黄冰羽等[3]利用电子鼻结合顶空固相微萃取-气相色谱-质谱(headspace-solid-phase micro-extraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)技术分析了不同陈酿时间黑豆酱油和豆粕酱油挥发性香气成分的差异, 研究通过气味活性值(odor activity values,OAV)共鉴定出132种关键香气成分(OAV>1),其中醛类、酚类和萜类对整体香气贡献显著。顶空固相微萃取法无需有机溶剂且操作便捷,但对高沸点化合物的吸附效率较低,且易受基质中水分干扰。白佳伟等[4]对比了溶剂辅助风味蒸发(solvent assisted flavor evaporation,SAFE)和Mono Trap有机溶剂法对高盐稀态酱油气味活性化合物提取效果,SAFE能萃取更多的香气活性成分,尤其适合低挥发性气味活性化合物的富集浓缩,但由于溶剂延迟,低保留指数的化合物无法检测到。王军喜等[5]采用同时蒸馏萃取(simultaneous distillation extraction,SDE)和固相微萃取(solid-phase micro-extraction,SPME)提取酱油中挥发性香气成分,结合GC-MS进行检测,结果得出SDE法更有利于萃取酱油中碳氢类及呋喃类(18.16%)等重要的挥发性风味物质,SPME法未检出碳氢类且对呋喃类(2.55%)的吸附相对较少。冯云子[6]优化了SDE法的萃取条件,结果显示,有92.45%的物质相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)<20%、50.94%的化合物RSD<10%,表明该优化方法稳定,有良好的重现性。SDE通过高温蒸馏与溶剂萃取联用,可高效提取酱油中呋喃类和碳氢类物质,但长时间高温处理可能导致热敏性风味物质降解。唐源等[7]发现利用搅拌棒吸附萃取(stir bar sorptive extraction,SBSE)方法萃取郫县豆瓣酱香气化合物,其数量远高于SPME和SAFE。SBSE依赖高吸附容量的聚二甲基硅氧烷涂层搅拌棒,对中极性化合物(如酯类)富集效果显著,但萃取时间较长且对低沸点挥发性成分的捕获能力有限。相比之下,动态顶空制样(dynamic headspace sampling,DHS)通过连续N2流将挥发性成分吸附至Tenax TA柱,其疏水特性与高比表面积可有效克服高水分基质的干扰,优先富集低沸点醛类、酮类等关键香气物质,同时弥补了传统提取方法(如SDE高温降解、SPME基质干扰)的不足,在酱油等复杂发酵体系的风味分析中展现出独特优势。但现在运用DHS方法萃取酱油香气的研究很少,并且多集中在单一方法的比较或特定成分的分析。不同的方法具有不同的提取效果和目标物质,使用单一的提取方法可能会导致提取结果与酱油的真实香气成分之间存在差异,从而影响分析结果。因此,本文比较了4种前处理方法的提取效能,旨在为酱油香气的全面表征提供技术支撑。

本研究以2种市售酱油(传统工艺酱油A与低温短时工艺酱油B)为对象,系统比较SAFE、SDE、SBSE及DHS四种前处理技术的性能差异,结合全二维气相色谱-嗅闻-质谱联用技术(comprehensive two-dimensional gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry,GC×GC-O-MS)与感官评价,实现关键气味活性化合物的精准鉴定与定量分析。通过揭示不同萃取方法对挥发性组分的富集特性,明确DHS技术在低沸点化合物捕获中的优势,并解析原料组成与工艺条件对酱油香气特征的影响规律,为酱油风味品质调控提供方法学支持与理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2种原料和生产工艺不同的市售酱油A、B。

酱油A:采用传统酿造工艺,原料以大豆、小麦为主,小麦比例较高;生产工艺中设置高温阶段(>120 ℃),并延长加热时间。

酱油B:采用配制工艺,原料为大豆,麸皮替代小麦,生产工艺为低温短时工艺。

He(99.999 0%)、N2(99.999 0%),北京氦普北分气体工业有限公司;2-甲基-3-庚酮、正构系列烷烃(C8～C30)、二氯甲烷、3-甲基-1-丁醇、2,6-二甲基吡嗪、3-甲硫基丙醛、糠醛、苯甲醛、苯乙醛、愈创木酚、4-乙基愈创木苯酚、3-甲基丁醛、2,3-丁二酮、辛醛、三甲基吡嗪、壬醛、2-乙酰基呋喃、苯乙醇、癸醛和己醛(色谱纯),美国 Sigma-Aldrich 公司。

1.2 仪器和设备

7890A/7000B气相色谱-质谱联用仪、8890-5977B型GC×GC-O-MS,美国Agilent 公司;柱老化器、动态顶空瓶、MPS多功能进样器、Tenax吸附柱、TDU热脱附系统、CIS冷却进样系统、Aux-163柱老化器、ADM2000气体流量计、ODP4型嗅闻仪、PTV冷却型进样口(cool injection system,CIS)、玻璃衬管、聚二甲基硅氧烷涂层的SBSE棒,德国Gerstel公司;极性DB-WAX毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)、DB-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色谱柱、DB-17(1.85 m×0.18 mm×0.18 μm),美国J&W Scientific公司;Sniffer 9100嗅闻仪,瑞士Brechbu-hler公司;溶剂辅助风味蒸发装置,德国Clasblaserei Bahr公司;Vigreux柱(10 cm×1 cm),北京半夏科技发展有限公司;HN200氮吹仪,济南海能仪器股份有限公司;JA5003电子天平,上海舜宇恒平科学仪器有限公司;SSM1800固态调制器,雪景电子科技(上海)有限公司;恒温循环水浴,美国PolyScience公司。

1.3 实验方法

准确量取酱油40 mL,用蒸馏水定容至100 mL,并加入2 μL 2-甲基-3-庚酮(0.816 μg/μL,内标),分别用50 mL二氯甲烷萃取2次后,合并萃取液。在40 ℃的真空环境下进行SAFE蒸馏,将所得馏出物用Na2SO4(无水)干燥,使用Vigreux柱浓缩至10 mL,然后氮吹至500 μL,进样1 μL,每种样品重复3次[7]。

在500 mL圆底烧瓶中加入100 mL酱油样品、2 μL内标物2-甲基-3-庚酮(0.816 μg/μL)和磁力搅拌子,同时装上蒸馏萃取装置,采用集热式恒温加热磁力搅拌锅进行油浴,加热物料至(140±2) ℃,转速设置为120 r/min。另在100 mL圆底烧瓶中加入50 mL乙醚萃取溶剂,采用水浴锅保持(55±2) ℃。连续提取一定时间(1～4 h),冷却至室温后收集萃取溶剂部分。除水过滤,使用Vigreux柱浓缩过滤,氮吹浓缩至500 μL,进行GC×GC-O-MS分析。

参考ZHAO等[8]的SBSE萃取法并修改。将15 g酱油原液、15 g蒸馏水、2 μL内标物2-甲基-3-庚酮(0.816 μg/μL)同时放入搅拌棒萃取器(聚二甲基硅氧烷涂层,长10 mm、厚度0.5 mm),在55 ℃下设定转速120 r/min,萃取90 min,萃取结束后用超纯水清洗晾干,转移到玻璃热脱附管中进行解析。每种样品重复3次。

准确称取15 g酱油原液和15 g蒸馏水置于250 mL动态顶空瓶中,加入2 μL内标物,放入搅拌棒,循环水浴60 ℃,搅拌速度800 r/min。恒温孵化20 min使样品中的挥发性化合物趋于平衡状态,之后迅速在三口瓶的一方放置Tenax-TA吸附柱,另一方连接高纯N2,控制其流速150 mL/min,萃取50 min后取下吸附柱,将柱反方向通入N2进行除水处理,除水阶段N2流速设定100 mL/min,除水30 min左右,方可进行后续仪器分析[9]。

1.4 GC-MS参数

1.4.1 GC分析条件

色谱柱:DB-WAX(30 m×0.25 mm,0.25 μm);不分流模式进样;载气为99.999%He,流量1 mL/min,压力15.71 kPa;升温程序:初始温度50 ℃,然后以4 ℃/min的速率升温至230 ℃。

1.4.2 GC×MS分析条件

DHS、SBSE、SAFE和SDE进样,不分流模式;液体进样,采用不分流模式,载气为99.999%He,流量1 mL/min,压力15.71 kPa;进样口温度230 ℃,2根色谱柱分别DB-Wax色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)和DB-17毛细管柱(1.85 m×0.18 mm×0.18 μm);柱温箱升温程序:初始温度40 ℃,然后以4 ℃/min的速率升温至230 ℃;固态调制器测定的冷区温度-50 ℃,加热区的入口和出口温度分别为70、160 ℃;调制周期4 s。热脱附加热程序:初始温度50 ℃,维持1 min,后以100 ℃/min升至280 ℃,维持5 min。冷阱进样系统升温程序:超低温液氮先将CIS温度迅速降到-80 ℃,待TDU解析完成之后,再以10 ℃/min升到250 ℃,维持1 min。

电子轰击(electron impact,EI)离子源,电子能量70 eV,传输线温度280 ℃,离子源温度为230 ℃,四极杆温度为150 ℃,溶剂延迟设定为4 min以排除配制内标溶液时使用的正己烷,质量扫描范围40～400 m/z。

1.4.4 嗅闻仪条件

嗅闻探测器条件:嗅闻口处的温度为200 ℃,使用N2通入超纯水中获得水蒸气以防止实验人员鼻腔干燥。

1.5 气味化合物的定性分析

通过比较酱油样品中气味化合物的MS、保留指数(retention index,RI)、嗅闻结果(olfactometry,O)与标准化合物(standard compounds,STD)对应的数据,来鉴定样品中的气味化合物。每个气味化合物的实际RI是在相同的色谱条件下,采用C8～C25系列正构烷烃计算得到的[10]。

1.6 气味化合物稀释分析(dynamic headspace dilution analysis,DHDA)

利用DHDA对酱油中的气味化合物及其贡献程度进行鉴定[11]。将捕集器吸附时间按1∶3-1∶3-2……比例缩短对样品气味化合物稀释分析。稀释过程中,载气的流速保持150 mL/min不变。在不同稀释倍数下,通过采用GC×GC-O-MS对每个样品进行感官评价。每个样品进行3次测试,直到嗅口无法进一步检测到化合物的气味为止。每个气味活性化合物可被感知的最高稀释度称为风味稀释(flavor dilution,FD)因子。FD因子可以直观地展示气味化合物对样品气味的贡献。

1.7 气味活性化合物的定量分析

本研究所采用的定量方法是外标法,即根据色谱峰的面积、已知目标化合物的峰面积、内标物的峰面积和内标物添加的浓度,则可由色谱图峰面积之比等于浓度之比的公式计算出从酱油筛选出的15种重要的气味活性化合物(FD因子≥81)的浓度。

1.8 OAV计算

OAV定义为香气化合物浓度与阈值之比,可验证香气化合物对样品特征香气的贡献程度。按公式(1)计算:

式中:ρa,化合物a的含量,μg/kg;ρ(OTa),化合物a在水中的阈值,μg/kg。

1.9 数据分析

采用Excel 2019和Origin 2021软件对数据进行整理并绘图。

2 结果与讨论

2.1 四种不同萃取方法分析

采用SAFE、SDE、DHS和SBSE四种气味成分提取方法结合GC×GC-O-MS分析2种酱油中的气味化合物。结果见图1。酱油A中运用SAFE、SDE、SBSE和DHS分别提取香气化合物31、49、39、54种。酱油B中分别提取香气化合物35、50、45、61种。SAFE方法萃取到的物质最少,但是萃取出的浓度较高。从中看出使用DHS方法萃取出的醛类和醇类物质是最多的。

分析挥发性组分的富集特性,DHS相较于其他前处理技术,在酯类、酮类、醛类及醇类等风味物质的捕获效能方面表现出显著优势。本研究发现,因Tenax TA吸附管独特的疏水特性与高比表面积,可有效克服高水分基质对吸附效率的干扰,实现对挥发性组分的选择性富集[12]。实验数据显示,DHS从酱油样品中成功捕获62种特征风味物质,占4种方法总检出量的62.3%,其中6种化合物为DHS专属检出成分。具体而言,该方法对酮类(9种,占比53.3%)、醛类(18种,占比90%)、酯类(8种,占比66.7%)及醇类(12种,占比70.6%)的富集效率显著优于SPME与SBSE,这与顶空富集技术对低沸点化合物的优先捕获特性相吻合[13]。

如电子版增强出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.042983,下同)所示,3-甲基丁醛、辛醛等低沸点醛类在DHS中的浓度最高,表明DHS对低沸点挥发性成分的优先捕获能力,SDE通过高温蒸馏(140 ℃)提取呋喃类和碳氢类物质,但热敏性化合物,在高温下易分解。DHS在常温或低温(60 ℃)下操作,保留了热敏性成分的完整性。如附表1所示,酱油A中3-甲基丁醛的含量(210.239 μg/kg)远超SDE(35.313 μg/kg),在DHS中未受明显损失,而SDE因高温导致其浓度降低。由于Tenax TA吸附柱特性,其疏水表面与高比表面积[12]有效减少了酱油高水分基质对吸附效率的影响。由附表1和附表2得知,酚类化合物(愈创木酚、4-乙基愈创木酚)经DHS检出酱油A含量125.773 μg/kg、酱油B含量205.888 μg/kg,显著高于其他方法。

综合来说,DHS方法凭借其高效富集低沸点化合物、克服高水分基质干扰、保护热敏性物质及高灵敏度等优势,在酱油气味分析中表现最优,萃取到的气味化合物种类最多并且浓度较高。结合GC×GC-O-MS技术,DHS为解析酱油特征风味的分子机制提供了可靠的技术路径,尤其适用于美拉德反应产物(如醛类、吡嗪类)和氨基酸降解产物的精准鉴定。

2.2 酱油中的气味化合物分析

在酱油A中采用SAFE、SDE、DHS和SBSE四种气味成分提取方法结合GC×GC-O-MS分析2种酱油中的气味化合物,如表1所示,酱油A中鉴定出78种气味化合物,包括15种醇类、10种酯类、14种酮类、6种吡嗪类、7种酚类物质、1种呋喃类、19种醛类、1种硫醚类、其他5种。在酱油B里鉴定出89种气味化合物,包括15种醇类、11种酯类、15种酮类、7种吡嗪、7种酚类、3种呋喃类、17种醛类、1种硫醚类、1种酸、其他12种。

4种萃取方法结合仪器分析和嗅闻,在2种酱油样品中共鉴定出8种酯类。在酱油发酵过程中,酯类物质主要由酸类物质和醇类物质发生酯化反应产生,并且大多数酯类能为食品提供水果味和花香[14]。在酱油样品中,乙酸乙酯、乳酸乙酯可以为酱油样品提供水果香气,而γ-丁内酯、γ-己内酯和苯乙酸乙酯提供焦糖、蜂蜜等甜香气味。其中乙酸乙酯通过SDE和DHS两种方法检出,其原因可能是萃取的气味物质在检测过程中,受到了溶剂峰的掩盖作用。

12种醇类物质在2种酱油样品中都被鉴定出来。醇的丰度对酱油有显著影响,醇类化合物主要来自不饱和脂肪酸的氧化降解,是酯化反应的重要前体物。苯丙氨酸通过Strecker降解生成苯乙醛,而后经过还原反应得到苯乙醇,苯乙醇为酱油提供了浓郁的玫瑰花香[15],其在2种酱油的FD因子都高于243,说明苯乙醇是2种酱油中关键的香气活性化合物。在双乙酰还原酶的催化作用下,2,3-丁二酮可以转化为3-羟基-2-丁酮(乙偶姻),而后被还原生产2,3-丁二醇[16]。从酱油中检测到的气味活性化合物性质来看,醇类化合物可有效赋予酱油醇厚口感,并增强麦芽味、果味、蘑菇味及甜味等风味层次。

2种酱油中共鉴定出20种醛类气味化合物,其中12种在2种酱油中都可以通过DHS方法鉴定出来。3-甲基丁醛为酱油提供麦芽香气,在嗅闻口处可以被嗅出浓郁的黑巧克力味,主要通过Strecker降解途径或其他微生物反应分解相应的氨基酸(异亮氨酸和亮氨酸)产生,呈花香的苯乙醛和呈杏仁香的苯甲醛都被认为是有助于酱油风味形成的关键香气化合物[17]。酱油A的高温工艺促进了美拉德反应,生成了1 195.275 μg/kg的苯乙醛,浓度远高于酱油B,酱油B的低温工艺抑制美拉德反应,但麸皮可能提供更多呋喃类前体,如5-甲基糠醛含量为170.493 μg/kg。

酚类化合物主要为酱油样品提供焦糖和烟熏香气。酱油A的小麦木质素在高温下降解生成酚类,如4-乙基愈创木酚,含量为323.631 μg/kg,而酱油B的含量为44.218 μg/kg,酱油B的麸皮可能含更多游离酚酸,如愈创木酚,但低温可抑制进一步转化。

吡嗪类物质是提供烤香和爆米花味道的主要气味化合物,是发酵豆制品中非常重要的一类物质。在2种酱油中鉴定出的吡嗪大多为烷基吡嗪,可带给人们烤肉、烤坚果、巧克力、可可、咖啡等烘培样香气。2,6-二甲基吡嗪提供浓郁的烤香,是高温发酵和烘焙类食品中的关键气味化合物[18]。三甲基吡嗪提供烤土豆味。这2种物质在2种酱油中的FD因子都大于243,并且4种萃取方法均能萃取到,说明它们是酱油中关键的香气活性物。酱油A的高温延长加热显著促进烷基吡嗪的产生,如2,6-二甲基吡嗪的含量为238.39 μg/kg,是酱油B的5.5倍,酱油B的低温工艺可能通过微生物代谢途径生成特殊吡嗪,如3,5-可可吡嗪。

2.3 酱油中的气味活性化合物分析

从气味活性化合物角度来看,4种萃取方法共鉴定出42种气味活性化合物。如表2所示,从酱油A中筛选出FD因子≥243的气味活性化合物11个,酱油B中气味活性化合物12个。这些化合物都可以被DHS有效萃取,均证明DHS萃取方法具有较高的灵敏度和选择性。

在嗅闻过程中,3-甲硫基丙醛和苯乙醇气味十分强烈,证明这2类物质是构建酱油基础香韵的核心组分,与此前酱油香气研究[19]相吻合。该发现为阐释酱油特征风味的分子基础提供了直接证据,同时为定向调控发酵工艺(如优化美拉德反应条件)以强化关键香气成分提供了理论依据。3-甲基丁醛具有麦芽香和坚果香,对酱油的香气特征有重要贡献,是酱油前香的重要组成成分,特别是在增加酱油香气的醇厚感方面。这2种酱油中均呈现出强烈的黑巧克力风味特征。3-甲硫基丙醛具有烤土豆、肉汤类香气,是酱油标志性风味的核心组分,来源于含硫氨基酸(如蛋氨酸)的热解或Strecker降解反应。酱油A的高温工艺显著促进美拉德反应产物(醛类、吡嗪类)的生成,但可能导致热敏性酯类的降解,而酱油B的低温工艺保留挥发性酯类和呋喃类,但减少了高温特征香气物质。

2.4 酱油原液中关键化合物的定量分析和OAV分析

采用内标矫正的外标定量曲线法进行定量实验。其结果如表3所示,线性方程拟合良好。2,6-二甲基吡嗪(烤香)、2-乙酰基呋喃(焦糖香)和3-甲基-1-丁醇(麦芽香)在2种酱油中含量均较高。

OAV是评估样品中化合物气味强度的重要指标。表3显示了酱油中重要香气活性化合物的OAV。共有12种气味活性化合物的OAV≥1分别是3-甲基丁醛、2,3-丁二酮、己醛、3-甲基-1-丁醇、辛醛、2,6-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、壬醛、3-甲硫基丙醛、苯乙醛、愈创木酚和4-乙基愈创木酚。在酱油A、酱油B中,提供麦芽香的3-甲基-1-丁醇浓度接近,可能的原因是酱油B的低温工艺可保留更多酵母活性,促进异亮氨酸降解生成3-甲基-1-丁醇,而高温可加速醇类挥发或转化。2,3-丁二酮具有奶油、黄油和甜香,是酱油中重要的甜香成分,在发酵过程中,微生物代谢产生2,3-丁二酮;在美拉德反应中,氨基酸与还原糖反应也会生成2,3-丁二酮[20],DHS避免高温萃取,两者浓度相近,表明DHS有效保护热敏性物质。若采用SDE,酱油A的高温可能导致其降解。辛醛的阈值较低,少量即可显著提升酱油的爆米花香。醛酮类化合物主要呈现麦芽香气、青草香和甜香等风味[21],酱油中的醛酮类化合物主要为3-甲硫基丙醛、苯乙醛、3-甲基丁醛等,是由酱油发酵中微生物代谢或者由酱油中产生的氨基酸经过美拉德反应生成[22],酱油A的3-甲硫基丙醛浓度比酱油B高的原因可能是高温促进蛋氨酸Strecker降解生成3-甲硫基丙醛,而酱油B的低温可能通过微生物缓慢释放含硫前体。酚类物质尤其是愈创木酚、4-乙基愈创木酚具有典型的烟熏风味,是酱油中常见的重要风味物质[23]。酚类含量主要的影响因素可能是原料配比,小麦含量越高,木质素来源丰富,酚类物质就会增加。综上所述,原料和生产工艺都与酱油中各种香气化合物的生成和含量密切相关。

3 结论

本研究通过SAFE、SDE、DHS和SBSE四种气味成分提取方法结合GC×GC-O-MS分析2种酱油中的气味化合物,并探讨了4种萃取方式效果的差异。结果显示:在2种酱油样品中,共检测出105种气味化合物。DHS是综合4种萃取方法中最优的,一共萃取出76种气味化合物,它可以高选择性富集低沸点化合物。通过分析酱油中的气味化合物可知,2种酱油中主要的气味活性化合物包括3-甲基丁醛、2,3-丁二酮、己醛、辛醛、3-甲基-1-丁醇、2,6-二甲基吡嗪、壬醛、三甲基吡嗪、3-甲硫基丙醛、苯乙醛、愈创木酚、4-乙基愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚。研究发现,延长加热显著促进美拉德反应,醛类及吡嗪类浓度更高,赋予浓郁烤香、坚果香与烟熏香。低温抑制美拉德反应,麸皮原料可提供更多呋喃前体,并保留酯类(γ-壬内酯)及酵母代谢产物(3-甲基-1-丁醇),使香气更偏向甜香、焦糖香与果香。本研究采用DHS可以成功鉴定出酱油体系中关键气味化合物。这些风味物质主要源于美拉德反应及油脂热解等生化过程,其协同作用对酱油特征风味轮廓的形成具有决定性影响。不仅为酱油品质调控建立了分子层面的科学基础,同时创新性地构建了食品风味解析技术体系,为复杂食品基质的香气分子机制研究提供了可借鉴的研究范式与技术路径。

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