哈萨克奶酪,俗称奶疙瘩,是新疆哈萨克族传统发酵乳制品的典型代表,具有独特的地域特征和民族特色。同时,哈萨克奶酪还是一种典型的酸凝奶酪,由天然存在的乳酸菌自发发酵而成,其制作流程主要包含3个阶段:酸化、凝乳和成熟[1]。与工业奶酪添加外源凝乳酶不同,哈萨克奶酪依赖乳酸菌代谢产酸促使酪蛋白凝固,随后经自然发酵成熟[2]。哈萨克奶酪奶香浓郁、味道微酸、口感醇厚,因其较高的营养价值而深受当地牧民青睐。奶酪中富含蛋白质、脂肪、糖类、有机酸、矿物质和脂溶性维生素,是必需氨基酸的良好来源[3-4]。新疆地处“三山夹两盆”地形,沙漠与绿洲交错,气候极端且昼夜温差大,其独特的地理环境和气候条件塑造了奶酪发酵中特殊的微生物群落与风味成分。在奶酪发酵过程中,风味物质主要来源于乳基质中碳水化合物分解、蛋白质水解和脂质降解[5-6]。其中乳糖经糖酵解代谢产生乳酸,赋予奶酪强烈的乳酸风味;蛋白质和脂质在微生物和酶的作用下,生成氨基酸和脂肪酸等前体物质。这些前体物质在奶酪成熟过程中会进一步被转化为醇类、酸类、醛类、酮类和酯类等风味化合物[7]。
微生物是风味形成的关键驱动因素,传统发酵食品中的微生物主要来源于开放环境,其发酵过程依赖于多菌种协同作用。奶酪中的微生物群落以乳酸菌和酵母菌为核心,二者通过协同作用共同调控发酵进程。研究发现,乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)和乳球菌属(Lactococcus)占主导地位,同时协同伊萨酵母属(Issatchenkia)、德巴利酵母属(Debaryomyces)和假丝酵母属(Candida)等共同参与发酵过程。这些功能微生物通过代谢互作调控乙酸乙酯、2-庚酮、丁酸、壬醛和己醛等关键风味物质,从而塑造奶酪的风味轮廓[8-9]。哈萨克奶酪由当地牧民采用传统工艺手工制作,其风味品质和微生物群落受环境与地域差异影响。因此,本研究采集了新疆不同地区的8份代表性奶酪样品,通过16S rRNA/ITS高通量测序技术深入解析其微生物群落。同时,结合有机酸、游离氨基酸及挥发性化合物的分析,探讨微生物群落与风味成分之间的相关性。研究结果对提升哈萨克奶酪品质稳定性及实现标准化生产具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 研究材料
本研究于2023年2月在新疆不同地区采集了8份哈萨克奶酪样品,这些样品由当地牧民依据传统工艺自然发酵而成,详细信息如表1所示。每个样品平均分成3份,保存于-80 ℃冰箱备用。
表1 新疆哈萨克奶酪样本信息
Table 1 Sample information of Xinjiang Kazak cheese
1.1.2 化学试剂
硫酸铜(分析纯),上海毕得医药科技股份有限公司;硫酸钾、硼酸、溴甲酚绿、甲基红、石油醚(分析纯),上海国药集团化学试剂有限公司;硫酸、氢氧化钠、盐酸(分析纯),重庆川东化工集团有限公司;有机酸标准品(色谱级)、磺基水杨酸(分析纯),北京索莱宝生物科技有限公司;磷酸二氢钾(分析纯),重庆跃翔化工有限公司;甲醇(色谱级),上海麦克林生化科技股份有限公司;2-辛醇标准品(纯度>99%),成都科龙化工试剂厂。
1.2 仪器与设备
DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱,上海一恒科学仪器有限公司;pHS-3C型pH计,上海仪电科学仪器股份有限公司;G210全自动滤袋式脂肪仪,上海晟声自动化分析仪器有限公司;K1100F全自动凯氏定氮仪,山东海能科学仪器有限公司;L-8900全自动氨基酸分析仪,日本日立公司;LC-20A高效液相色谱仪、GCMS-QP 2010 Plus气相色谱-质谱联用仪,日本岛津公司。
1.3 实验方法
1.3.1 基本组成测定
水分的测定参考GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》;蛋白质含量的测定参考GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》;脂肪含量的测定参考GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》;pH值的测定参考XU等[1]的方法,将奶酪和蒸馏水以1∶10(g∶mL)的料液比混合均匀后用pH计测定。
1.3.2 有机酸测定
准确称取0.3 g样品,加入4 mL 0.01 mol/L硫酸溶液涡旋混匀,8 000 r/min离心10 min后取上清液,经0.22 μm滤膜过滤。色谱条件:Agilent Zorbax SB-AQ柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱温:35 ℃;流动相为V(0.06 mol/L KH2PO4)∶V(甲醇)=97∶3,磷酸调pH值至2.8;流速:0.8 mL/min;进样量:20 μL;紫外检测器,检测波长210 nm[10]。草酸、丙酮酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸及琥珀酸标准品配制成系列浓度梯度的标准溶液,经0.22 μm滤膜过滤后进样,线性范围0.005～0.5 mg/mL。
1.3.3 游离氨基酸测定
准确称取0.2 g样品,加入2 mL磺基水杨酸(50 g/L)溶液沉淀蛋白质和肽,涡旋混匀后4 ℃静置过夜。8 000 r/min离心10 min后取上清液经0.22 μm滤膜过滤。采用全自动氨基酸分析仪在440 nm(脯氨酸)和570 nm处进行检测,外标法测定18种蛋白水解氨基酸标准溶液用于定性定量分析[4]。
1.3.4 挥发性成分测定
样品处理[11]:采用顶空固相微萃取(headspace solid phase microextraction,HS-SPME)结合GC-MS对样品中挥发性成分进行测定。准确称取2.0 g样品于20 mL顶空瓶中,加入10 μL 2-辛醇(100 mg/L)内标,并用聚四氟乙烯盖密封。样品经60 ℃水浴平衡30 min后,插入SPME纤维萃取针于60 ℃下吸附30 min,随后立即转移至GC-MS进样口分析。
GC条件:采用DB-5MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);载气为高纯氦气,流速1 mL/min;升温程序:初始温度40 ℃保持4 min,以3 ℃/min升温至100 ℃保持2 min,再以4 ℃/min升温至150 ℃保持2 min,最后以10 ℃/min升温至230 ℃保持3 min;进样口温度:250 ℃;进样方式:不分流进样。
MS条件:电子轰击离子源(EI),离子源温度230 ℃;电离能量70 eV;接口温度230 ℃;质量扫描范围m/z 40～400。
定性定量分析:化合物通过NIST17标准谱库(匹配度大于80%)定性,内标法定量,根据公式(1)计算挥发性成分含量:
挥发性成分含量
(1)
相对气味活性值(relative odor activity value,ROAV)用于评估各挥发性化合物对整体香气的贡献,根据公式(2)计算ROAV值[12]:
(2)
式中:Ci,化合物i的相对含量,μg/kg;Cmax,最高气味活性值(odor activity value,OAV)化合物的相对含量,μg/kg;Tmax/Ti,化合物i与最高OAV化合物的阈值比值。
1.3.5 高通量测序
采用E.Z.N.A.® soil DNA kit试剂盒,按照操作手册提取样品总DNA,并通过1%琼脂糖凝胶电泳评估DNA质量,DNA浓度和纯度采用NanoDrop 2000进行测定。对于细菌,选用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对16S rRNA基因的V3～V4可变区进行扩增。对于真菌,采用ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)对ITS1 rDNA区域进行扩增。
1.4 统计分析
实验均设3个重复,结果以“平均值±标准差”表示。采用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析,并通过Duncan多重比较法检验显著性(P<0.05)。数据可视化由Origin 2021实现,微生物多样性分析依托美吉生物云平台(https://cloud.majorbio.com),Spearman相关性分析在联川生物云平台(https://www.omicstudio.cn/tool)上完成。
2 结果与分析
2.1 基本组成分析
由表2可知,哈萨克奶酪的pH值为3.74～4.38,水分含量为9.05%～40.52%,脂肪含量为6.18%～21.58%,蛋白含量为42.70%～64.06%,这些发现与之前的研究结果一致[13]。整体而言,哈萨克奶酪属于高蛋白、低脂肪的酸性半硬质奶酪,样品平均pH 3.94,水分含量为24.73%,脂肪含量为13.74%,蛋白含量为53.15%。其中pH较传统干酪更低,这主要归因于乳酸菌发酵过程中的产酸作用。此外,哈萨克奶酪的水分含量波动较大,样品A41(40.52%)水分含量最高,表现出鲜奶酪的特征;样品A19(9.05%)和A42(14.69%)则具有硬质奶酪的特性。哈萨克奶酪由牧民手工制作,干燥方式依赖于自然蒸发,在本研究中导致奶酪水分含量波动较大的主要原因可能是其成熟时间不一致。
表2 新疆哈萨克奶酪基本组成
Table 2 Proximate composition of Xinjiang Kazak cheese
注:不同小写字母表示同列数据差异显著(P<0.05),除pH和水分含量外,其余指标均按干基计算。
2.2 有机酸分析
有机酸主要由糖酵解途径和其他生化过程产生,是引起奶酪酸味的主要原因。如表3所示,哈萨克奶酪中共检出8种有机酸,包括草酸、酒石酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸和苹果酸,与BULAT等[14]对开菲尔奶酪的研究结果类似。乳酸(43.15～73.32 mg/g)是含量最高的有机酸,平均占比70.03%,可赋予奶酪浓烈的乳酸风味;而草酸含量最少(0.09～0.28 mg/g),平均占比仅0.23%。乙酸呈辛辣味,奶酪中乙酸平均占比7.55%,仅次于乳酸,可为奶酪带来一些刺激性气味。酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸等在奶酪中含量较低,但其味道温和,可以减轻乙酸的刺激性,平衡奶酪风味。丙酮酸是最简单的α-酮酸,是一种重要的代谢枢纽物质,可参与丙氨酸合成和糖异生[15]。值得注意的是,哈萨克奶酪中丙酮酸含量普遍较低,在样品A19和A42中均未检出。
表3 新疆哈萨克奶酪有机酸含量 单位:mg/g
Table 3 Content of organic acids in Xinjiang Kazak cheese
注:不同小写字母表示同行数据差异显著(P<0.05),“/”表示未查到阈值,“—”表示未检出(下同)。
2.3 游离氨基酸分析
游离氨基酸具有增香、调味和营养强化功能。如表4所示,哈萨克奶酪中共检出16种游离氨基酸,总含量为1 264.05～7 227.73 mg/kg。按其呈味特性,苦味氨基酸平均占比36.23%,甜味氨基酸31.53%,鲜味氨基酸10.98%。其中样品A2、A27和A29以苦味氨基酸居多,而样品A19、A23、A35、A41及A42则以甜味氨基酸居多。亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、丙氨酸、赖氨酸和脯氨酸是奶酪中含量最高的6种氨基酸,平均占比61.38%。其中丝氨酸、丙氨酸呈甜味,对改善奶酪风味有益;苯丙氨酸和亮氨酸呈苦味,对奶酪滋味不宜,但它们可作为相关香气化合物的重要前体物质,从而对奶酪风味的发展产生积极作用[10]。此外,奶酪中还检出7种人体必需氨基酸,平均占比37.76%。
表4 新疆哈萨克奶酪游离氨基酸含量 单位:mg/kg
Table 4 Content of free amino acids in Xinjiang Kazak cheese
2.4 挥发性风味成分分析
2.4.1 挥发性成分组成及含量分析
本研究在新疆哈萨克奶酪中共鉴定出89种挥发性成分,包括13种醇类、10种酸类、12种醛类、8种酮类、9种萜烯类、34种酯类和3种其他类,具体见电子版增强出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.042552,下同)。结合图1可知,样品A27(51种)、A29(55种)和A35(53种)中挥发性物质种类丰富,以酯类化合物为主,分别占比53.70%、43.64% 及45.14%。相对而言,样品A41(33种)和A42(34种)中挥发性物质种类较少,以酮类(66.68%)和萜烯类(30.61%)化合物为主。各组样品中检出共有挥发性成分11种,包括1-辛醇、1-壬醇、辛酸、癸醛、壬醛、反式-2-壬烯醛、反式-2-癸烯醛、2-壬酮、D-柠檬烯、辛酸乙酯及癸酸乙酯。
a-挥发性物质种类;b-挥发性物质含量
图1 新疆哈萨克奶酪挥发性物质种类及其含量
Fig.1 Types and contents of volatile compounds in Xinjiang Kazak cheese
醇类物质主要通过微生物代谢及氨基酸降解途径形成,可赋予奶酪酒香味。新疆哈萨克奶酪中醇类物质种类丰富且含量差异显著,样品A35中醇类物质总量最高,达840.52 μg/kg,占该样品挥发性成分总量的19.50%。值得注意的是,1-辛醇(26.22～118.23 μg/kg)和1-壬醇(3.37～34.59 μg/kg)作为共有成分存在于所有样品中,可赋予奶酪花香和酒香。进一步分析发现,超半数样品中检出庚醇、异戊醇、1-辛烯-3-醇、芳樟醇和苯乙醇等,其中庚醇和芳樟醇可带来酒味和花香;异戊醇由亮氨酸脱氨基反应产生,是鲜奶酪中的关键香气化合物[2]。1-辛烯-3-醇散发典型的蘑菇香,是切干达干酪的关键呈香物质[17]。苯乙醇由酵母通过苯丙氨酸代谢途径产生,具有独特的玫瑰和蜂蜜香气[18]。
酸类化合物主要来源于乳酸代谢、乳脂水解和蛋白质降解过程[19]。新疆哈萨克奶酪共鉴定出10种酸类化合物,其中乙酸、丁酸、己酸、辛酸和癸酸在大多数样品中普遍存在。从其呈味特性来看,乙酸、辛酸和癸酸主要贡献果香酸味;丁酸则呈腐臭味,与己酸的共同作用会产生脚臭和汗臭味,是导致奶酪不良风味的重要因素之一[20];己酸是乳脂分解产生的短链脂肪酸,具有辛辣味和酸味,在低浓度时可呈现浓郁的奶油香味[21]。此外,在奶酪样品中还检测到了戊酸、庚酸等脂肪酸,但由于其较高的气味阈值,对奶酪整体风味贡献较小。
醛类化合物是奶酪风味的重要组成部分,一般由脂肪酸代谢、氨基酸降解及Strecker降解产生[22]。本研究共检出12种醛类物质,其中样品A23中醛类物质含量最高,达1 025.19 μg/kg,占其挥发性成分总量的22.85%;而样品A2含量最低,仅占1.55%。不同奶酪样品中醛类物质组成不同,12种醛类化合物中仅4种在所有样品中检出,包括癸醛(4.64～16.71 μg/kg)、壬醛(62.59～340.95 μg/kg)、反式-2-壬烯醛(3.19～60.77 μg/kg)和反式-2-癸烯醛(2.61～56.71 μg/kg)。尽管这些醛类化合物的含量相对较低,但由于其较低的气味阈值从而对奶酪整体风味贡献较大,表现出花香、果香和脂肪香。此外,苯甲醛、苯乙醛、己醛、庚醛和反式-2-庚烯醛等也在哈萨克奶酪中普遍检出,这些发现与卢灏泽等[23]对牦牛奶酪研究的结果一致。
酮类化合物可以通过氨基酸降解或多不饱和脂肪酸氧化形成[24]。在哈萨克奶酪中检出2种关键酮类化合物,2-庚酮(0～1 728.86 μg/kg)和2-壬酮(44.06～1 894.69 μg/kg)。2-庚酮和2-壬酮通常由饱和脂肪酸的β-氧化和β-酮酸的连续脱羧产生,可赋予样品果香和奶酪味,是羊奶酪和切达干酪中的关键香气物质[25-26]。在本研究中,样品A41中酮类化合物含量最高,占其总挥发性成分的66.68%,其中2-庚酮和2-壬酮的含量分别达到1 728.86、1 894.69 μg/kg。此外,奶酪样品中还检出8-壬烯-2-酮和3-羟基-2-丁酮等酮类物质。据报道,3-羟基-2-丁酮与乳酸菌的柠檬酸代谢有关,对未成熟干酪的风味轮廓有重要作用[27],在样品A35和A42中检出。与酮类物质相比,萜烯类物质在奶酪中的含量相对较少,其中仅D-柠檬烯(37.13～949.39 μg/kg)在所有样品中检出。
酯类化合物是奶酪中含量较多的一类风味物质,其生物合成主要依赖于酯化反应和氨基酸代谢。这类化合物普遍具有甜香、果香和花香特征,不仅能赋予奶酪典型风味,还能有效中和乙酸、丁酸等短链脂肪酸产生的刺激性异味,起到风味平衡作用。研究结果显示,乙酯类物质在奶酪酯类成分中占主导地位,其中辛酸乙酯(14.36～1 111.90 μg/kg)和癸酸乙酯(1.76～705.17 μg/kg)在所有样品中稳定检出,且相对含量较高,对提升奶酪整体风味品质有重要作用。此外,还大量检测到具有特征风味的庚酸乙酯(果香、酒味)、己酸乙酯(果香、酒味)和乙酸异戊酯(苹果味、香蕉味、梨味)等,这些发现与XIAO等[28]的研究结果相符。据报道,奶酪中乙酯类物质的富集现象与其合成途径密切相关,以游离脂肪酸为前体,通过与醇类,特别是乙醇发生酯化反应,最终导致乙酯类化合物富集[29];此外,微生物对酯类物质的生成与积累也具有显著影响,其中真菌群落的作用尤为突出。
2.4.2 香气活性物质分析
挥发性成分对整体风味的贡献程度不仅取决于其含量高低,还需结合其阈值进行综合评价[30]。ROAV是评估单一挥发性化合物对整体香气贡献度的重要指标,其数值大小与物质的风味贡献度呈正相关。通常ROAV≥1的化合物被视为样品中的关键香气成分,而0.1≤ROAV<1的化合物则被认为对样品风味具有修饰作用[12]。如表5所示,本研究共鉴定出29种ROAV≥0.1的挥发性化合物,包括6种醇类、7种醛类、5种酮类、2种萜烯类以及9种酯类。其中21种化合物对奶酪香气有显著贡献(ROAV≥1),8种化合物对奶酪风味起修饰作用。具体而言,样品A2、A19、A23、A27、A29、A35、A41、A42中分别含有13、6、12、12、14、9、13、9种关键香气成分。其中,乙酸异戊酯(苹果味、香蕉味、梨味)作为主要香气贡献成分,在样品A2(ROAV=45.15)、A27(ROAV=77.79)、A35(ROAV=100)和A41(ROAV=17.42)中占据主导地位;而样品A19、A23、A29、A42则以壬醛和反式-2-壬烯醛为主要香气贡献成分,推测这种差异可能与奶酪制作工艺及微生物代谢有关。值得注意的是,8组样品均检出7种共有关键香气物质,包括壬醛、反式-2-壬烯醛、反式-2-癸烯醛、2-壬酮、D-柠檬烯、辛酸乙酯和癸酸乙酯。共有关键香气物质以醛类化合物为主,其香气特征可归纳为酒香、花香、果香、奶酪香和脂肪香。这些特征香气物质通过协同作用,共同构建了新疆哈萨克奶酪的芳香轮廓。此外,异戊醇(花香、焦糖味)、芳樟醇(花香、柠檬味、玫瑰香)、庚醛(柑橘香, 坚果味)和己酸乙酯(果香、酒味)等物质在超半数样品中普遍检出且具有较高的ROAV,进一步丰富了哈萨克奶酪风味的复杂性和层次感。
表5 新疆哈萨克奶酪主要呈香物质
Table 5 Key aroma compounds in Xinjiang Kazak cheese
注:气味描述参考参考在线风味数据库(https://www.femaflavor.org/flavor-library)。
风味化合物阈值/(μg/kg)[31]气味描述ROAVA2A19A23A27A29A35A41A42己醇5.6香蕉味、花香、青草香———————1.05庚醇5.4青草味、甜味—0.570.930.560.730.350.680.46异戊醇4花香、焦糖味7.352.641.4813.4811.5016.585.87—1-辛烯-3-醇1.5蘑菇味、花香——4.32—0.19—0.680.442-壬醇58黄瓜味0.27—————0.34—芳樟醇0.22花香、柠檬味、玫瑰香15.63—9.20—23.32——19.61庚醛2.8柑橘香, 坚果味—9.359.40—9.760.59—9.13癸醛3花香、橙皮味0.230.360.590.730.800.240.220.71苯乙醛6.3玫瑰香、蜂蜜味、甜味———0.610.440.29——壬醛1.1脂肪味、花香、柠檬味8.1318.6244.3114.6236.2115.698.8624.19反式-2-壬烯醛0.19甜味、黄瓜味2.4016.9545.7310.2145.012.813.667.84反式-2-癸烯醛0.34脂肪味、甜橙味2.551.1023.855.5812.131.832.053.28己醛5苹果香、脂肪味——4.36—1.51——1.672-庚酮140奶酪味、果香、坚果味1.140.160.56———1.77—2-十一酮5.5柑橘味、玫瑰香——————3.87—3-羟基-2-丁酮14黄油味、奶油味—————0.05—0.462-癸酮8.3脂肪味、果香0.28—————0.31—2-壬酮41果香、牛奶味4.100.562.270.790.940.156.610.29月桂烯1.2花香、果香、青草味————10.83——9.59D-柠檬烯34柑橘味、薄荷味1.140.430.783.613.990.162.511.70丁酸乙酯0.9苹果、黄油、奶酪、菠萝———7.33—23.56——丁酸异戊酯15果香、甜味———1.58—0.84——庚酸乙酯1.9果香、酒味1.70—0.283.301.180.611.44—辛酸乙酯19.3酒味、脂肪味、花香、菠萝味4.910.622.5311.568.243.232.540.11癸酸乙酯5酒味、葡萄味、梨味8.730.793.1820.1614.135.802.490.05癸酸甲酯3花香、酒味、果味——0.370.84————己酸乙酯5果香、酒味6.612.534.3218.4711.158.774.65—乙酸异戊酯0.15苹果味、香蕉味、梨味45.15——77.7921.87100.0017.42—乙酸己酯115苹果味、香蕉味、青草味——0.23—0.230.14——
2.5 微生物多样性与群落结构分析
2.5.1 多样性分析
基于Bray-Curtis距离矩阵的主坐标分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)结果表明(图2),不同样本间微生物群落的Beta多样性呈现显著的空间分异特征。如图2-a所示,在细菌群落中,样品A2、A23、A27、A29、A41在第一、四象限形成显著的空间聚类,表明这些样本间具有较高的细菌群落相似性。值得注意的是,样品A19和A42分别独立分布于第三和第二象限,空间分离特征显著(P<0.05),提示这2组样品的细菌群落组成存在显著差异。如图2-b所示,真菌群落的PCoA结果显示,各样本呈现相对离散的分布模式,反映出样品间真菌群落结构的异质性。具体而言,样品A27与A35具有较近的空间距离,表明其真菌群落组成具有一定相似性。值得关注的是,样品A19在细菌和真菌群落中均表现出显著的空间分离特征,表明该样品微生物群落组成特异。综上所述,除样品A19和A42外,不同组奶酪样品的细菌群落结构呈现显著的空间聚集特征,而真菌群落则表现出更高的差异性。
a-细菌属水平;b-真菌属水平
图2 新疆哈萨克奶酪微生物多样性分析
Fig.2 Microbial diversity analysis of Xinjiang Kazak cheese
2.5.2 群落结构分析
如图3-a所示,哈萨克奶酪中的优势细菌属主要包括乳杆菌属、链球菌属和乳球菌属,累计占细菌总丰度的85.96%。特别地,在样品A19中,乳球菌属以44.33%的丰度成为绝对优势属,而在其余样品中,乳杆菌属与链球菌属占据主导地位,这一结果与2.5.1节的多样性分析结果相符。乳杆菌属、链球菌属和乳球菌属是一类产酸细菌,在发酵乳制品中已被广泛报道,是奶酪凝乳和风味形成的主要驱动力[32-33]。这类细菌还可通过代谢活动降低乳基质pH,抑制有害微生物生长,对延长奶酪保质期具有重要意义[34]。此外,奶酪中还检出无色杆菌属(Achromobacter,3.96%)和不动杆菌属(Acinetobacter,1.57%)等非乳酸菌属,平均相对丰度大于1%。
a-细菌属水平;b-真菌属水平
图3 新疆哈萨克奶酪微生物群落组成
Fig.3 Microbial community composition in Xinjiang Kazak cheese
如图3-b所示,各组样品真菌群落结构差异显著,主导菌属各不相同,表明不同地区的哈萨克奶酪真菌群落多样丰富且结构差异明显。具体而言,双足囊菌属(Dipodascaceae)在样品A27和A35中的占比均超过88%;青霉属(Penicillium)在样品A19中的占比高达74.67%;伊萨酵母属在样品A19和A29中的占比均超过23%;而德巴利酵母属则在样品A29和A42中占比超过25%。同时,酵母菌属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、有孢圆酵母属(Torulaspora)、梅奇酵母属(Metschnikowiaceae)以及假丝酵母属等也在哈萨克奶酪中离散分布,平均相对丰度大于1%。值得注意的是,双足囊菌属、伊萨酵母属和酵母菌属是哈萨克奶酪共有的优势真菌属,且相对丰度较高,在奶酪的真菌群落中具有普遍性和稳定性。
2.6 微生物与香气活性物质的相关性分析
为探究新疆哈萨克奶酪中优势物种与其香气物质的关系,基于平均相对丰度不低于1%的标准,筛选出6个细菌属和10个真菌属,并采用Spearman相关分析法对29种ROAV≥0.1的香气成分进行相关性分析。选取|r|>0.7且P<0.05的显著关联微生物与香气物质进行可视化分析。图4展示了微生物与香气物质的相关性网络图。由图4可知,无色杆菌属和乳球菌属是连接数较多的2种细菌属,与庚醇、庚醛等香气物质呈显著正相关;链球菌属则与庚酸乙酯呈显著正相关。在真菌群落中,假丝酵母属、德巴利酵母属、双足囊菌属、青霉属及有孢圆酵母属是核心菌群,与13种香气物质呈显著正相关,包括4种醇类(2-壬醇、异戊醇、庚醇、芳樟醇)、2种酮类(2-癸酮、2-壬酮)、5种酯类(丁酸异戊酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、庚酸乙酯)以及2种萜烯类物质(D-柠檬烯、月桂烯)。新疆哈萨克奶酪优势物种与其香气物质之间的相关性分析结果揭示,连接关系较多的菌属可能对其风味成分产生关键影响,进而在深层次上塑造奶酪的整体品质。
图4 新疆哈萨克奶酪中优势菌属与香气物质的相关性分析
Fig.4 Correlation analysis between dominant bacteria genera and aroma compounds in Xinjiang Kazak cheese
注:粉点代表微生物,绿点代表香气物质,实线表示正相关,虚线表示负相关,线的粗细表示相关性强弱
3 结论与讨论
奶酪是一个高度复杂的微生态系统,受多种因素的影响,微生物群落组成及风味品质差异较大。本研究以新疆不同地区哈萨克奶酪为研究对象,通过系统分析其基本组成、有机酸及游离氨基酸含量,并采用HS-SPME-GC-MS方法和高通量测序技术对奶酪挥发性成分及微生物群落进行解析。研究结果显示,哈萨克奶酪具有高蛋白(53.15%)、低脂肪(13.74%)特性,属于酸性半硬质奶酪。奶酪中检出8种有机酸和16种游离氨基酸,其中乳酸(70.03%)和乙酸(7.55%)为主要有机酸;16种游离氨基酸中包含7种必需氨基酸,平均占比37.76%。挥发性物质分析显示,哈萨克奶酪中共鉴定出89种风味化合物,其中21种(ROAV≥1)被确定为关键香气物质。特别指出,壬醛、反式-2-壬烯醛、反式-2-癸烯醛、2-壬酮、D-柠檬烯、辛酸乙酯及癸酸乙酯这7种关键香气物质在所有样本中均检出,可赋予哈萨克奶酪酒香、花香、奶酪香和果香,构成其香气基础。微生物群落分析显示,乳杆菌属、链球菌属和乳球菌属为优势细菌属;双足囊菌属、伊萨酵母属和酵母属为共有优势真菌属。Spearman相关性分析表明,无色杆菌属、乳球菌属和链球菌属与庚醇、庚醛和庚酸乙酯等香气物质呈显著正相关,而优势真菌属则与醇类(2-壬醇、异戊醇、庚醇、芳樟醇)、酮类(2-癸酮、2-壬酮)、酯类(丁酸异戊酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、庚酸乙酯)和萜烯类(D-柠檬烯、月桂烯)香气物质密切相关。
本研究揭示了新疆哈萨克奶酪的风味特征、微生物群落结构及其关联性,为提升哈萨克奶酪品质提供了理论支撑。但该研究仍存在一定局限性,尽管高通量测序揭示了群落组成,但对其功能和代谢途径的解析仍不够深入。未来应结合宏基因组学和代谢组学技术,进一步探讨哈萨克奶酪微生物群落与风味形成的具体机制。
[1] XU Z L, CHEN J L, SHI X W, et al.Characteristic physicochemical indexes and flavor compounds in Xinjiang Kazak cheese during ripening[J].Food Bioscience, 2020, 35:100586.
[2] ZHANG X, ZHENG Y R, FENG J, et al.Integrated metabolomics and high-throughput sequencing to explore the dynamic correlations between flavor related metabolites and bacterial succession in the process of Mongolian cheese production[J].Food Research International, 2022, 160:111672.
[3] ZHENG X C, GE Z K, LIN K, et al.Dynamic changes in bacterial microbiota succession and flavour development during milk fermentation of Kazak artisanal cheese[J].International Dairy Journal, 2021, 113:104878.
[4] ZHANG X, ZHENG Y R, ZHOU R, et al.Comprehensive identification of molecular profiles related to sensory and nutritional changes in Mongolian cheese during storage by untargeted metabolomics coupled with quantification of free amino acids[J].Food Chemistry, 2022, 386:132740.
[5] LI J, HUANG Q, ZHENG X C, et al.Investigation of the lactic acid bacteria in Kazak cheese and their contributions to cheese fermentation[J].Frontiers in Microbiology, 2020, 11:228.
[6] LI S, LI Y D, DU Z X, et al.Impact of NSLAB on Kazakh cheese flavor[J].Food Research International, 2021, 144:110315.
[7] XIANG Q, XIA Y X, SONG J H, et al.Characterization of the key nonvolatile metabolites in Cheddar cheese by partial least squares regression (PLSR), reconstitution, and omission[J].Food Chemistry, 2023, 403:134034.
[8] ZHENG X J, LIU F, LI K X, et al.Evaluating the microbial ecology and metabolite profile in Kazak artisanal cheeses from Xinjiang, China[J].Food Research International, 2018, 111:130-136.
[9] CHEN C, NIE H X, TIAN H X, et al.Flavor profiles and microbial communities of Chinese acid-curd cheeses:A review of recent research[J].Trends in Food Science &Technology, 2024, 144:104308.
[10] WANG Y D, ZENG H, QIU S Z, et al.Identification of key aroma compounds and core functional microorganisms associated with aroma formation for Monascus-fermented cheese[J].Food Chemistry, 2024, 434:137401.
[11] 田同辉. 高达奶酪香气品质研究及再制产品开发[D].上海:上海应用技术大学, 2023.TIAN T H.Study on the aroma quality of gouda cheese and the development of its processed product[D].Shanghai:Shanghai Institute of Technology, 2023.
[12] WANG Y, HE Y H, LIU Y, et al.Analyzing volatile compounds of young and mature Docynia delavayi fruit by HS-SPME-GC-MS and rOAV[J].Foods, 2023, 12(1):59.
[13] 王绒雪, 王小雨, 边冉, 等.新疆地区奶疙瘩样品中挥发性风味组分研究[J].中国乳品工业, 2018, 46(9):8-12;22.WANG R X, WANG X Y, BIAN R, et al.Study of volatile compounds of kuruts from Xinjiang by SAFE-GC-MS[J].China Dairy Industry, 2018, 46(9):8-12;22.
[14] BULAT T, TOPCU A.Influences of oxidation-reduction potential on kefir:Microbial counts, organic acids, volatile compounds and sensory properties[J].LWT, 2021, 144:111195.
[15] XU S Z, MA Z W, CHEN Y, et al.Characterization of the flavor and nutritional value of coconut water vinegar based on metabolomics[J].Food Chemistry, 2022, 369:130872.
[16] DUAN F X, LUO Y, LI D F, et al.Kaili Red sour soup:Correlations in composition/microbial metabolism and flavor profile during post-fermentation[J].Food Chemistry, 2024, 435:137602.
[17] XIANG Q, XIA Y X, CHEN L, et al.Flavor precursors and flavor compounds in Cheddar-flavored enzyme-modified cheese due to pre-enzymolysis combined with lactic acid bacteria fermentation[J].Food Bioscience, 2023, 53:102698.
[18] SIEIRO-SAMPEDRO T, FIGUEIREDO-GONZ
LEZ M, GONZLEZ-BARREIRO C, et al.Impact of mepanipyrim and tetraconazole in Mencía wines on the biosynthesis of volatile compounds during the winemaking process[J].Food Chemistry, 2019, 300:125223.
[19] GUAN T, LIU B, WANG R, et al.The enhanced fatty acids flavor release for low-fat cheeses by carrier immobilized lipases on O/W Pickering emulsions[J].Food Hydrocolloids, 2021, 116:106651.
[20] FACCIA M, TRANI A, NATRELLA G, et al.Short communication:Chemical-sensory and volatile compound characterization of ricotta forte, a traditional fermented whey cheese[J].Journal of Dairy Science, 2018, 101(7):5751-5757.
[21] SONG Z Y, CAO Y J, QIAO H J, et al.Analysis of the effect of Tenebrio molitor rennet on the flavor formation of Cheddar cheese during ripening based on gas chromatography-ion mobility spectrometry (GC-IMS)[J].Food Research International, 2023, 171:113074.
[22] NIRO S, SUCCI M, TREMONTE P, et al.Evolution of free amino acids during ripening of Caciocavallo cheeses made with different milks[J].Journal of Dairy Science, 2017, 100(12):9521-9531.
[23] 卢灏泽, 吕嘉伟, 杨帆, 等.西藏牦牛奶酪的微生物群落结构与风味物质分析[J].食品与发酵工业, 2023, 49(6):179-186.LU H Z, LYU J W, YANG F, et al.Microbial community structure and flavor analysis of Tibetan yak cheese[J].Food and Fermentation Industries, 2023, 49(6):179-186.
[24] ZHANG W J, DENG Z Y, LIU T Y, et al.Fermentation with edible mushroom mycelia improves flavor characteristics and techno-functionalities of soybean protein[J].Food Bioscience, 2024, 59:104123.
[25] TIAN H X, SUN X F, YU H Y, et al.Characterization of the key aroma compounds in Yunnan goat milk cake using a sensory-directed flavor analysis[J].Journal of Food Science, 2020, 85(11):3981-3997.
[26] 王姣, 许凌云, 张晋华, 等.不同成熟时间切达奶酪中挥发性香气成分及其电子鼻判别分析[J].食品科学, 2020, 41(20):175-183.WANG J, XU L Y, ZHANG J H, et al.Cheddar cheese with different ripening times:Analysis of volatile aroma components and electronic nose discrimination[J].Food Science, 2020,41(20):175-183.
[27] CINCOTTA F, CONDURSO C, TRIPODI G, et al.Comparison of lactose free and traditional mozzarella cheese during shelf-life by aroma compounds and sensory analysis[J].LWT, 2021, 140:110845.
[28] XIAO J, CHEN Y, LI J, et al.Evaluation of the effect of auxiliary starter yeasts with enzyme activities on Kazak cheese quality and flavor[J].Frontiers in Microbiology, 2020, 11:614208.
[29] KHATTAB A R, GUIRGUIS H A, TAWFIK S M, et al.Cheese ripening:A review on modern technologies towards flavor enhancement, process acceleration and improved quality assessment[J].Trends in Food Science &Technology, 2019, 88:343-360.
[30] JIANG H, ZHANG M T, YE J J, et al.HS-SPME-GC-MS and OAV analyses of characteristic volatile flavour compounds in salt-baked drumstick[J].LWT, 2022, 170:114041.
[31] 里奥·范海默特, 王凯, 冒德寿, 等.化合物嗅觉阈值汇编[M].北京:科学出版社, 2018.VAN GEMERT L J, WANG K, MAO D S. Compilations of Odour Threshold Values in Air, Water and Other Media[M]. Beijing: Science and Technology Press, 2018.
[32] CHEN C, HUANG K, YU H Y, et al.The diversity of microbial communities in Chinese milk fan and their effects on volatile organic compound profiles[J].Journal of Dairy Science, 2021, 104(3):2581-2593.
[33] BERESFORD T P, FITZSIMONS N A, BRENNAN N L, et al.Recent advances in cheese microbiology[J].International Dairy Journal, 2001, 11(4-7):259-274.
[34] ALLAM M G M, DARWISH A M G, AYAD E H E, et al.Lactococcus species for conventional Karish cheese conservation[J].LWT-Food Science and Technology, 2017, 79:625-631.