沙棘(Hippophae rhamnoides L.)是一种营养成分丰富、生物活性多样化的果实[1-2]。目前关于沙棘的研究主要集中于营养成分、抗氧化活性[3-4]、沙棘的果油[5]和酵素产品开发[6]等方面。然而,沙棘汁有机酸含量高,约占鲜果的2.40%～5.40%[7],且主要以苹果酸为主,约占总酸的90%[1,8],影响沙棘汁产品的消费者接受度[9],制约沙棘加工业发展。为改善沙棘汁尖锐酸感,降低有机酸含量是有效的方法。
非酿酒酵母中的毕赤酵母属,具有良好的发酵特性和酸耐性[10-11],被广泛应用于果蔬汁发酵领域[12-13]。有研究证明毕赤酵母在降解山楂、柑橘中柠檬酸[14-15]的同时又促进香气化合物的生成,尤其是促进酯类化合物的积累,赋予更多的果香和花香[14-17]。然而,毕赤酵母应用于沙棘产品的研究较少,尤其是降酸发酵后沙棘汁口感以及风味影响的研究还存在空白。
本实验室前期研究发现,经毕赤酵母WJL-M4(Pichia terricola WJL-M4)发酵后的沙棘汁的口感和风味明显改善,推测发酵沙棘汁除有机酸降低外也会影响挥发性化合物构成。本实验在HPLC分析有机酸等理化指标变化基础上,通过电子鼻检测和顶空固相萃取与气相色谱质谱联用(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME-GC-MS)技术分析发酵前后沙棘汁挥发性化合物的变化,进一步探讨毕赤酵母WJL-M4降酸发酵对沙棘汁风味物质的影响,以期为促进沙棘汁产品的深加工提供理论依据和技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料与菌株
沙棘,黑龙江省尚志市;毕赤酵母WJL-M4(CGMCC No.30666),由本实验室从沙棘鲜果中筛选具有高效降解苹果酸能力的非酿酒酵母,保藏于东北林业大学食品微生物实验室。
1.1.2 试剂
苹果酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、草酸、α-酮戊二酸、芦丁、没食子酸均为标准品,上海源叶生物科技有限公司;磷酸、磷酸二氢钾、甲醇、2-辛醇均为色谱纯,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;苹果酸,酵母浸粉,蛋白胨、琼脂、无水碳酸钠、九水合硝酸铝、福林酚、亚硝酸钠均为分析级,上海麦克林生化科技股份有限公司。
1.1.3 培养基
苹果酸液体培养基(g/L):酵母浸粉10、苹果酸20、蛋白胨20。
苹果酸固体培养基(g/L):酵母浸粉10、苹果酸20、蛋白胨20、琼脂2.5。
1.2 仪器与设备
ZQZY-78AV恒温气浴摇床,常州金坛良友仪器有限公司;SW-CJ-1F单人双面超净工作台,深圳市三莉科技有限公司;MJX-250恒温培养箱,杭州聚同电子有限公司;KL05A台式低速离心机,湖南凯达科学仪器有限公司;LW520卧式离心机,成都智楷分离科技有限公司;SJL810C立式压力蒸汽灭菌器,上海浚和仪器科技有限公司;Agilent Technologies 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色谱仪、Agilent Poroshell 120 EC-C18(4.6 nm×150 mm,4 μm)色谱柱,美国安捷伦公司;数字恒温水浴锅,常德比克曼生物科技有限公司;RF006手持糖度计,广州涓涓电子科技有限公司;PB-10型pH计,上海诺萱科学仪器有限公司;CM-23 d色差仪,北京翁开尔科技有限公司;PEN3电子鼻、GCMS-QP2050气相色谱质谱联用仪、DB-5MS毛细管色谱柱,上海岛津实验器材有限公司;57330-U SPEM手柄、57060-U DVB/CAR/PDMS萃取头,美国Supelco公司。
1.3 实验方法
1.3.1 毕赤酵母WJL-M4种子液的制备
保藏于-80 ℃斜面培养基的毕赤酵母WJL-M4挑取一环接种于苹果酸液体培养基,在180 r/min、28 ℃下活化24 h,将活化好的菌液稀释涂布于苹果酸固体培养基,挑取一环菌落于苹果酸液体培养基,同条件下振荡培养24 h,制成种子液,并调整菌悬浓度为108 CFU/mL[18]。
1.3.2 样品制备
将沙棘榨汁,用8层纱布过滤去掉果渣,再利用离心机脱去沙棘果油,置于灭菌锥形瓶中巴氏杀菌处理(80 ℃,15 min)后,冷却至室温得到沙棘汁(SJ),接种毕赤酵母WJL-M4种子液进行降酸发酵,条件为:接种量5%(体积分数)、温度25 ℃、转速180 r/min、装液量30 mL/250 mL,振荡发酵24 h获得沙棘发酵汁(SJF)。设置沙棘汁(SJ)和在温度25 ℃、转速180 r/min、装液量30 mL/250 mL条件下振荡24 h的振荡沙棘汁(SJO)2组对照组。SJ、SJO、SJF均使用离心机在8 000 r/min下离心5 min,取上清液,用于进一步分析。
1.3.3 理化指标检测
参考文献[19]利用手持糖度计测定可溶性固形物。按照GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定(含第1号修改单)》测定总酸,以苹果酸计。参考文献[20]用色差仪中CIELab系统测定色差。参考文献[21]采用福林酚法测定样品中总酚。参考文献[22]采用硝酸铝比色法测定样品中总黄酮。用pH计测定pH值。
有机酸检测利用高效液相色谱法[23]。流动相A为0.5%(质量分数)的磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH=2.4),流动相B为甲醇,A、B体积比为97∶3,进样量为10 μL,柱温为35 ℃,等度洗脱设定10 min,流速设定0.7 mL/min,检测波长设定210 nm。采用外标法对沙棘汁中的有机酸定量,有机酸标准曲线和相关系数如表1所示。
表1 有机酸标准曲线和相关系数
Table 1 Standard curve and correlation coefficient of organic acids
有机酸种类标准曲线相关系数苹果酸y=780.17x-0.894 70.999 9柠檬酸y=935.32x-1.269 30.999 8乳酸y=502.66x-6.6950.999 9酒石酸y=1 234.40x+20.2410.999 5草酸y=7 116.30x-42.6770.999 6α-酮戊二酸y=6 594.70x-1.444 10.999 8
1.3.4 感官评定
参考文献[24]选取50名受试者。选择整体可接受性、风味、颜色、外观和口感5个方面,每个方面为20分满分,总分为100分,建立发酵前后沙棘汁感官评分标准,如表2所示。
表2 沙棘汁感官评定标准
Table 2 Standard for sensory evaluation of sea buckthorn juice
1.3.5 电子鼻检测
使用配备10个金属氧化物半导体传感器PEN3电子鼻,参考文献[25]建立程序。将每个样品(5 mL)置于装有硅隔膜的螺盖棕色样品瓶中。分析程序包括180 s的冲洗时间、持续10 s的自动零点调整、设置为600 mL/min的内部流速和入口流速以及150 s的测量时间。PEN3电子鼻传感器及传感器代表的敏感物质如表3所示。
表3 PEN3电子鼻传感器敏感物质
Table 3 Schematic diagram of the electronic-nose measurements and the gas flow of PEN3
1.3.6 挥发性物质检测
参考文献[25]对挥发性化合物进行检测和分析。以800 μg/L的2-辛醇(10 μL)作为内标,加入含1.5 g NaCl的5 mL样品中,然后将DVB/CAR/PDMS萃取头(50/30 μm)插入样品的顶部空间,以2.5 Hz的搅拌速率在40 ℃下平衡50 min。GC-MS系统载气为氦气,流速为1 mL/min,进样口升温程序为6 ℃/min,从40 ℃升至250 ℃。使用DB-5MS毛细管色谱柱,在GC-MS的进样口中将纤维头在250 ℃下解吸4 min。质荷比扫描范围为33～550 amu,使用NIST 17质谱库鉴定化合物。每组样品重复3次,考虑匹配度大于85的挥发性化合物进行定性分析。采用半定量法,利用内标物(2-辛醇)代入公式(1)进行定量分析:
(1)
式中:挥发性化合物含量为Cd;挥发性化合物峰面积为Ad;内标物峰面积为A1;2-辛醇质量浓度为C1,μg/L。
挥发性化合物的气味活度值(odor activity value,OAV)[26]计算如公式(2)所示:
(2)
式中:该挥发性化合物香气阈值为A0。
1.4 数据处理与统计分析
每项实验均重复3次,结果以“平均值±标准差”表示。采用Excel和IBM SPSS Statistics 25软件进行数据处理与显著性分析、Origin 2025b软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 不同样品的理化指标
根据表4可知,除乳酸和草酸外,SJO和SJF组中有机酸质量浓度与SJ组相比均呈现降低趋势,在SJF组中下降幅度最高。SJF组中乳酸质量浓度有小幅度增加,这可能是毕赤酵母WJL-M4在以苹果酸为碳源代谢过程中涉及苹果酸乳酸代谢途径[27]。SJF组中苹果酸质量浓度降至(2.18±0.02) g/L,降解率达到(85.37±0.67)%。苹果酸是沙棘汁中主要的有机酸[28],也是导致沙棘酸味主要的酸[29];酒石酸与苹果酸共存情况下会增强沙棘汁酸味[30],发酵后苹果酸和酒石酸质量浓度的减少使酸感明显降低,从而改善沙棘汁口感。SJF组中pH值为3.30±0.02,总黄酮质量浓度为(88.29±0.98) mg Rutin/L,显著高于SJ和SJO组。同时,根据色差结果显示,SJF组的a*、b*值最高,表明发酵会改善沙棘汁颜色。黄酮类化合物的增加可使沙棘汁黄色变浓郁[31],提升感官吸引力并促进消费者购买欲望[32],因此降酸发酵沙棘汁对品质提升具有积极作用。
表4 不同样品的理化指标
Table 4 The physicochemical parameters of different samples
注:GAE为gallic acid equivalent,表示为没食子酸当量;Rutin表示为芦丁当量;n.d.:表示未检测到;数值以平均值±标准差(n=3)表示,每行不同的字母表示有显著差异(P<0.05)(下同)。
2.2 不同样品的感官评定
从整体可接受性、风味、颜色、外观和口感5个方面对不同样品进行感官评价,结果由图1所示。与SJ和SJO组相比,SJF组每项指标评分最高。在风味上,酯类化合物能为沙棘汁提供主要的花香和果香,SJF组得分最高原因可能与降酸发酵后沙棘汁酯类化合物显著增加有关。SJF组在颜色方面得分最高原因可能是毕赤酵母WJL-M4能将黄酮类大分子转化成的小分子[26],发酵过程中又能分泌甘露糖蛋白[33],两者结合使沙棘汁黄色变浓郁。在外观上,3个样品组得分差异不大。在口感上,3个样品组差异较大,这与沙棘汁总酸有关,经发酵后沙棘汁总酸显著降低。果汁中高含量的有机酸会形成难忍的酸感[23],经毕赤酵母WJL-M4发酵后,沙棘汁中pH值显著升高,总酸显著降低,进而改善尖锐酸味。降酸发酵后沙棘汁挥发性化合物显著增加赋予其更丰富风味,总酸显著降低明显改善口感使整体可接受度增加。
图1 不同样品的感官评定
Fig.1 Sensory evaluation of different samples
2.3 不同样品的电子鼻分析
为探讨气味的差异,采用电子鼻技术对不同样品组进行分析,并将响应值归一化处理,各样品组在气味特征上的差异如图2所示。同一传感器对不同样品组的响应值表现出一定的差异性,SJF组与其他组差异最明显,除W3C和W5C外,其他传感器均对SJF组的响应值最高,表明降酸发酵沙棘汁样品中含有较高的芳烃化合物、氮氧化物、氢化物等。SJF组总响应值最高,表明毕赤酵母WJL-M4降酸发酵可能利于形成更复杂的香气特征[4]。
图2 不同样品的电子鼻响应雷达图
Fig.2 Electronic nose response radar map of different samples
为进一步揭示不同样品组之间的关系,采用主成分分析(principal component analysis,PCA)方法进行分析,主成分1(PC1)占总方差的94.9%,主成分2(PC2)占5.0%,两者总贡献率为99.9%,说明能够解释不同沙棘汁样品之间的区别[34]。通过图3(PCA)可知,各个样品在二维坐标系中的分布呈现出明显的分散趋势,样品组数据信息无交叉说明其存在风味差异[35]。除W3C和W5C传感器外,其他传感器聚集在PCA图的右侧,SJF组与W1S、W5S、W6S和W2W相关性最强,气味特征与SJ和SJO组有差异,发酵会影响氢化物、氮氧化物、部分醇和芳香族化合物的含量,这可能与毕赤酵母的代谢活动改变沙棘汁成分或自身代谢产物有关。SJF组与W3C和W5C相关性较弱。一方面可能是发酵沙棘汁pH值显著增加,影响渗透压进而使极性分子含量降低,另一方面可能是毕赤酵母代谢产物与氨和芳香分子形成氢键或络合物,使这些物质游离状态浓度降低,进而减少挥发[36]。
图3 不同样品的电子鼻主成分分析
Fig.3 PCA of electronic nose data for different samples
2.4 不同样品的挥发性化合物分析
不同样品挥发性化合物检测结果由电子版增强出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.042500,下同)所示。根据附表1和图4可得,3组样品共检测出109种挥发性化合物,包括酯类61种、醛类9种、酸类10种、酮类8种、醇类15种、酚类3种、烯烃类1种、其他3种,挥发性化合物总质量浓度为(3 457.69±203.78)～(5 426.81±246.96) μg/L。与SJ和SJO相比,SJF组中特有的挥发性化合物种类最多,挥发性化合物总浓度最高。
a-挥发性化合物种类;b-韦恩图分析
图4 不同样品的挥发性化合物种类及韦恩图分析
Fig.4 Volatile compound types and Venn diagram analysis of different sample groups
酯类化合物是沙棘主要的香气成分[3],有助于形成水果的典型香气特征[37]。在3组样品中共检测到61种酯类化合物,是沙棘挥发性化合物主要的香气成分。与SJ和SJO组相比,SJF组中大部分酯类化合物浓度呈现增加趋势,这可能与毕赤酵母代谢和有机酸降解有关,如ZHONG等[38]利用毕赤酵母降解蓝莓中有机酸使酯类化合物含量增加,LIU等[39]也发现毕赤酵母参与发酵有助于果汁酯类的积累,从而显着改善产品的果香和花香。SJF组中特有9种酯类化合物,主要能为沙棘汁提供果香,增强降酸沙棘汁特有风味的形成。醛类化合物共检测出9种,其浓度在3组样品中差异较大,为(17.78±3.79)～(149.24±0.36) μg/L。与SJ和SJO相比,SJF组大部分醛类化合物浓度显著降低,醛类浓度降低可减轻刺激性恶臭味[40],还有利于果汁安全性[41]。这与王子萱[42]研究毕赤酵母发酵沙棘汁可使总醛含量降低的结果一致。在3组样品中共检测到10种酸类化合物。与SJ组相比,SJF组酸性化合物浓度显著降低。酸性化合物的减少可能与毕赤酵母的酵解作用和发酵过程中对酸类物质的消耗有关[43]。SJF组中未检测到3-甲基戊酸(刺激的酸性奶酪气味)、庚酸(馊酸味)及己酸,表明毕赤酵母WJL-M4在降酸发酵过程中不会额外产生一些不良气味的酸类化合物。
酮类化合物在3组样品中共检测到8种,SJF组总酮类化合物浓度显著高于SJ组。酮类化合物的嗅觉阈值较低[44],降酸发酵显著增加酮类化合物浓度,使沙棘汁香气变丰富。醇类化合物在3组样品中共检测到15种,SJ、SJO、SJF中醇类化合物总质量浓度分别为(85.95±6.07)、(29.59±1.71)、(1 626.82±36.27) μg/L;特有的醇类化合物种类分别为1、3、4种。SJF组的醇类化合物总浓度和种类均显著高于SJ和SJO组,这可能与毕赤酵母发酵过程中氨基酸降解途径和糖代谢途径有关,其中氨基酸降解途径利用氨基酸作为前体,进行脱氨、脱羧和还原反应以产生相应的高级醇[45]。MINGORANCE-CAZORLA等[46]研究表明毕赤酵母应用于葡萄和橙子发酵能表现出良好性能并促进高级醇的生成,增强花香和果香。酚类、烯烃类和其他化合物在3组样品中检测到的种类较少,浓度占比最低。在酚类化合物中,SJF组中2,4-二叔丁基苯酚的浓度显著高于SJ和SJO组。2,4-二叔丁基苯酚本身无明显的气味,但作为微生物发酵过程的代谢产物,具有防腐和抗氧化作用[47],表明经毕赤酵母WJL-M4发酵后的沙棘汁除赋予特有香气外,还能延长贮藏时间。在SJO组中未检测出酚类和烯烃类化合物,但SJF组能检出,这些化合物能为降酸沙棘汁提供柑橘和橙子等果香味,这可能是毕赤酵母WJL-M4在降酸发酵的代谢过程中合成的某些酚类和烯烃类化合物,从而有效保留沙棘汁原有的优良风味。在SJ、SJO与SJF组中均检测到2种其他类化合物,分别为1,1,6三甲基-1,2二氢萘和成龙脑,降酸发酵对沙棘汁中其他类化合物的影响不大。
2.5 不同样品的特征香气分析
为进一步研究沙棘汁降酸发酵前后的每种香气化合物贡献,评估通过HS-SPME-GC-MS鉴定的挥发性化合物的OAV。一般认为OAV>1时,该物质对样本整体风味产生贡献,OAV>10对整体风味产生极大的关键作用[48]。由表5可得,样品组中共有19中挥发性化合物OAV>1,酯类有10种,醛类、酸类和醇类各有3种,主要以酯类和醇类为主,这与MENG等[47]研究一致。SJF组中庚酸乙酯、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯、正己酸乙酯、苯乙酸乙酯均高于SJ和SJO组,这可能是毕赤酵母WJL-M4降酸发酵过程中表现出更强的酯化能力[38],能为降酸发酵沙棘汁带来甜味、果味、花香和干邑朗姆酒风味。发酵后沙棘汁正己酸乙酯OAV从130.06增加到263.02,苯甲醇OAV从10.50增加到35.30,这些化合物高OAV表明它们对沙棘汁风味起主导作用,能为降酸发酵沙棘汁带来明显的果味与花香味,与感官评分中风味提升结果一致,进而表明毕赤酵母降酸发酵为沙棘汁甜味和果味的形成具有显著贡献。SJF组中未检到苯甲醛和庚醛,表明降酸发酵可去除苦杏仁味和醛类物质引起的气味。异戊酸和正戊酸在SJ和SJO组中的OAV>10,对沙棘汁风味影响突出,在SJF组中未检出,表明降酸发酵可去除酸臭和腐烂的难闻气味,从而改善沙棘汁整体风味。己酸仅在SJ组中检出,对沙棘汁处理会使油脂味减轻。
表5 十九种挥发性化合物的OAV
Table 5 OAV values for 19 volatile compounds
注:—表示未检测到。
类别化合物名称阈值[49]/(μg/L)OAVSJSJOSJF香气描述酯类异戊酸乙酯8.49.94<11.87甜味、什锦水果味异戊酸异戊酯2019.5130.3613.10甜味、果味庚酸乙酯1.95.145.2718.19果味和干邑朗姆酒混合味苯甲酸乙酯55.563.893.874.17果味己酸异戊酯673.215.274.64果香辛酸乙酯19.319.0127.2426.98柔和的果香味苯甲酸异戊酯250<11.201.18蜡质味正己酸乙酯5130.06135.54263.02甜味、果味苯乙酸乙酯3.32.85—3.72甜美花香味2-甲基丁酸乙酯0.06340.32——苹果皮、菠萝皮和未成熟李子皮味醛类苯乙醛6.34.646.471.62风信子味苯甲醛143.705.25—苦杏仁味庚醛0.479—3.44—醛类物质气味酸类异戊酸1.821.0215.23—酸臭味正戊酸0.1621.5012.50—腐烂的味道己酸4.88.05——油脂味醇类1-辛烯-3-醇11.09—1.06真菌味苯甲醇0.1—10.5035.30花香味3,7-二甲基-1-辛醇0.79—1.65—醛类物质味、皮革味
3 结论
本研究将毕赤酵母WJL-M4接种于沙棘汁进行降酸发酵,总酸含量显著下降,尤其是苹果酸质量浓度显著降低,感官品质明显改善,酸味和苦味明显减轻。与未降酸相比,电子鼻传感器对降酸沙棘汁响应值最高,说明其气味最浓郁。降酸发酵后沙棘汁酯类和醇类化合物的浓度显著增加,是其主要的挥发性化合物。同时,降酸发酵沙棘汁正己酸乙酯和苯甲醇能为其赋予更多的花香和果香,正己酸、异戊酸和苯甲醛未检测到可去除沙棘汁不良风味。毕赤酵母WJL-M4降酸发酵对沙棘汁改善口感和丰富香气方面具有良好的应用潜力。
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