‘深秋红’沙棘(Hippophae rhamnoides‘Shenqiuhong’)是目前国内广泛种植的经济林沙棘品种,具有抗寒、耐旱、耐贫瘠等特点[1]。果实通常呈橘红色圆柱形,富含维生素C、黄酮、脂肪酸和类胡萝卜素等多种活性物质,具有较高的营养功效价值[2]。其果实有机酸以苹果酸和奎宁酸为主,其中苹果酸含量约为11～60 g/L,占总酸量的50%～70%[3],较高含量的苹果酸是导致沙棘饮品口感酸涩,影响消费接受度的主要原因。为了改善沙棘饮品风味,提高沙棘产品的市场接受度,目前生产中通常会通过添加糖分、稀释、复配其他果蔬汁等方法调整沙棘饮品的口感,这些操作往往会导致沙棘产品糖分过高、风味稀释和营养功效下降等问题,难以满足消费者对高品质健康饮品的需求[4]。
果蔬饮品降酸的方法主要有物理、化学和生物方法,物理法通过物理手段(如温度、压力、过滤等)降低饮品酸度,降酸效果有限且操作复杂成本较高;化学法是利用碱性化学试剂降酸,易导致产品质量不稳定且受现代消费习惯排斥;生物降酸可利用微生物(乳酸菌、酿酒酵母),靶向分解果汁中的有机酸,达到降酸目的[5]。目前常用的是乳酸菌的苹果酸-乳酸发酵,但大多乳酸菌的最低启动pH值为3.2～3.5,而‘深秋红’沙棘的pH值一般为2.8～3.0,乳酸菌生物降酸发酵不易启动,效果较差[5-6];酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)也可通过苹果酸-乙醇发酵降酸,但其最佳生长pH值约为4～6[6],在pH值为3.0和2.5时生长缓慢或被完全抑制,同样不适宜沙棘降酸[7]。非酿酒酵母粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)能在低至3左右的pH值下生长,通常用于高酸葡萄汁的降酸,苹果酸降解率可达90%[8],是降解苹果酸的理想菌株,且可将苹果酸转化为乙醇和二氧化碳,这一特性使其在降解沙棘中的苹果酸方面具有显著优势,实验室前期的实验结果也证实了这一点[9]。
目前,S.pombe主要应用于葡萄酒生产中改善葡萄酒的色泽和香气构成[10],而关于S.pombe发酵在沙棘生物降酸方面的应用研究鲜见报道,本研究以‘深秋红’沙棘原浆为原料,选用商业化S.pombe(SP1757、SP58027、SP16979)和甘肃农业大学葡萄酒微生物实验室筛选并保藏的S.pombe(SP1620)进行降酸发酵,基于降酸量和降酸速率,确定沙棘原浆降酸发酵菌株;同时,通过单因素和响应面试验,优化其降酸发酵工艺;分析降酸样品和沙棘原浆的理化指标、活性成分和感官品质,讨论S.pombe降酸发酵对沙棘原浆品质的影响,探讨S.pombe生物降酸在沙棘饮品生产中的应用前景,旨在为产业化应用S.pombe降酸,改善沙棘饮品风味提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料
浆果于2023年10月完全成熟时采自新疆布尔津汇源生物科技有限公司沙棘基地,农场遵循标准化的栽培管理措施,浆果采摘后经过冷冻处理、脱果、解冻、破碎、压榨制浆、果油分离、巴氏灭菌制成沙棘原浆[pH值为(2.86±0.03);可溶性固形物含量为(12.53±0.12)°Brix]。
1.1.2 菌种与培养基
S.pombe(SP1620),甘肃农业大学葡萄酒微生物实验室保藏;S.pombe(SP1757),中国食品发酵工业研究院有限公司;S.pombe(SP58027),北京百欧博伟生物技术有限公司;S.pombe(SP16979),北京科展生物技术有限公司;YM肉汤培养基,北京奥博星生物技术有限责任公司。
1.1.3 主要试剂
氢氧化钠、碳酸钠、乙醇、甲醇和没食子酸等常规试剂(分析纯),天津市光复精细化工研究所。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-2FD超净工作台,苏州安泰空气技术有限公司;EX-150-Ⅱ生化培养箱,上海跃进医疗器械有限公司;LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器,上海申安医疗器械厂;H2050R台式高速冷冻离心机,长沙湘仪离心机仪器有限公司;Genesis10 s紫外-可见分光光度计、Thermo Scientific Ultimate 3000高效液相色谱仪,美国Thermo Scientific公司;PR-PAL-1数显糖度计,上海仪电物理光学仪器有限公司;F-100S超声仪,深圳富阳有限公司;CM-700 d色差仪,柯尼卡美能达有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌株活化、接种
参照高娉娉等[11]的方法,菌株接种于YM肉汤培养基中28 ℃下培养48 h,再以2%的接种量接种于YM肉汤培养基,于28 ℃培养48 h后再进行接种实验。
1.3.2 降酸菌株的选择
将4株S.pombe菌液SP1620、SP1757、SP16979、SP58027按5%接种量接入沙棘原浆,在发酵温度25 ℃ 的条件下发酵,发酵期间,每2 d取样测定可滴定酸含量,比较菌株降酸能力,选择降酸速度快和降酸量高的菌株。
1.3.3 降酸工艺优化
1.3.3.1 单因素试验
单因素试验参考文献[12]及前期试验基础设计试验梯度:发酵时间2、3、4、5、6 d;S.pombe添加量:1%、3%、5%、7%、9%(以下添加量均为体积分数);发酵温度:21、23、25、27、29 ℃;以苹果酸降解率为评价指标,研究降酸发酵条件对试验中苹果酸降解率的影响。
1.3.3.2 响应面优化S.pombe降酸工艺
在单因素试验的基础上,以发酵温度、发酵时间、S.pombe添加量3个因素为自变量,苹果酸降解率为响应值,进行三因素三水平的响应面设计,结果如表1所示。
表1 响应面试验因素与水平设计
Table 1 Factors and levels of response surface experiment design
水平因素A发酵温度/℃BS.pombe添加量/%C发酵时间/d-125340275512976
1.3.4 指标测定
1.3.4.1 理化指标的测定
还原糖、pH值、可滴定酸和可溶性固形物参照WANG等[9]的方法检测;酒精度采用酒精计进行测定;参考赵曼等[13]方法,采用福林-肖卡试剂法测定总酚,结果以没食子酸计(mg/mL),亚硝酸钠-氯化铝比色法测定总类黄酮,结果以芦丁计(mg/mL);参考贺静[14]的石油醚-丙酮萃取法测定总类胡萝卜素;采用色差仪测定颜色指标。
1.3.4.2 苹果酸的测定
参考陆敏等[15]方法略作调整,采用高效液相色谱仪进行检测。1 mL沙棘原浆,加入9 mL 超纯水,40 ℃下超声提取20 min,12 000 r/min(16 062×g)离心10 min,取1 mL上清液与等体积的0.02 moL/L KH2PO4溶液混合,离心后过0.22 μm滤膜备用。色谱条件:XSelect HSS T3色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为CH3OH-0.02 mol/L KH2PO4溶液(体积比为5∶95),H3PO4调节pH值至2.7,流速0.5 mL/min,柱温30 ℃,检测波长215 nm,进样量20 μL。以外标法定性定量,得到苹果酸的标准曲线方程为y=22.027x+4.029 9,R2=0.999 5。
1.3.4.3 感官评价
由经过培训的10名专业人员组成评分小组,采用九点标定法进行感官评价,每项满分为9分,分别从酸味、涩味、苦味、总体接受度等7个方面进行感官品质评价[16]。感官属性的评分范围从1(低强度)到9(高强度),颜色评分1～9分,淡黄色到橙红色;酸味评分1～9分,非常酸到适口酸度;甜味评分1～9分,甜感弱到甜感适口;苦味评分1～9分,非常苦到基本无苦感;涩味评分1～9分,非常涩到涩感适口;新鲜度评分1～9分,不新鲜到极新鲜;总体可接受度评分1～9分,不可接受到非常可接受。感官评价的实施细则和操作标准参考QI等[17]的方法。
1.4 数据处理
采用Excel 2024、SPSS 27.0软件进行方差分析和相关性分析,Design-Expert 13.0对数据进行响应面分析,联川生物云平台绘制相关性热图。
2 结果与分析
2.1 发酵沙棘原浆的S.pombe筛选
实验所选菌株均能有效降低实验样品可滴定酸,提高样品pH值,且发酵第2天pH及总酸含量变化显著,说明所选用S.pombe能在低pH值下快速启动发酵。如图1所示,SP58027、SP16979、SP1620及SP1757发酵12 d降酸样品pH值分别较沙棘原浆升高了14.34%、9.44%、17.83%和22.03%,可滴定酸分别较沙棘原浆降低了18.89%、8.60%、50.19%、50.51%。发酵过程中,4个菌株发酵样品pH值和可滴定酸含量的变化存在差异,SP58027降酸样品的pH值从2.86升至3.27,可滴定酸含量从23.40 g/L降至14.36 g/L,降酸效果显著,但降酸速率显著低于SP1757;SP16979降酸样品的pH值从2.86升至3.13,可滴定酸含量从23.40 g/L降至18.98 g/L,降酸效果相对较弱,pH值上升幅度较小;SP1620降酸样品的pH值在发酵过程中持续上升,从初始的2.86升至3.37,可滴定酸从23.40 g/L降至11.66 g/L;SP1757降酸样品的pH值从2.86升至3.49,可滴定酸含量从23.40 g/L降至11.58 g/L。到第12天,SP1620及SP1757可滴定酸含量接近,但SP1757启动快、降酸速度快,至第6天,样品可滴定酸含量和pH值趋于稳定,表明SP1757的降酸发酵接近完成,进一步延长发酵时间不会显著提高降酸效果,还会增加生产成本,出现杂菌污染、产生不良风味物质等[10]。综合分析显示,SP1757发酵启动快、降酸速率快、降酸率高、发酵时间短,选择SP1757菌株进行后续实验。
A-可滴定酸含量;B-pH
图1 不同粟酒裂殖酵母菌株发酵过程中可滴定酸含量及pH变化
Fig.1 Changes in total acid content and pH during fermentation by different S.pombe strains
注:不同小写字母表示相应可滴定酸含量、pH存在显著差异(P<0.05)。
2.2 S.pombe发酵沙棘原浆工艺优化
2.2.1 单因素试验
随酵母添加量的增加,苹果酸降解率呈现先上升后下降的单峰型变化,S.pombe添加量为5%时,苹果酸降解率达到最大值53.39%(图2-A);苹果酸降解率随发酵时间的延长总体呈上升趋势,最终趋于稳定,当发酵时间为5 d时,苹果酸降解率趋于稳定,为65.21%(图2-B);发酵温度为27 ℃时,苹果酸降解率达到最高,为63.13%(图2-C)。
A-S.pombe添加量;B-发酵时间;C-发酵温度
图2 单因素试验结果
Fig.2 Results of single-factor experiments
注:不同小写字母表示相应发酵条件下苹果酸降解率存在显著差异(P<0.05)。
S.pombe添加量增加,菌株增殖速度提高,降解率显著升高,但过量添加会引发营养耗竭使酵母的增殖速度下降,导致降解率下降[18]。苹果酸降解率随发酵时间的延长升高,这可能是因为菌株需要适应环境并逐步进入对数生长期,菌体大量增殖,从而加速苹果酸的转化,但发酵时间过长时,菌株逐渐进入衰亡期,苹果酸降解率趋于稳定[19]。升高发酵温度能有效提高苹果酸降解率,但发酵温度过高会抑制微生物的生长和代谢活动,导致苹果酸降解率降低[20]。根据单因素试验,本实验选取S.pombe添加量5%、发酵时间5 d和发酵温度27 ℃为响应面试验的基础水平。
2.2.2 响应面试验
响应面试验设计及结果见表2。通过对回归模型的分析,得苹果酸降解率与发酵温度、发酵时间、S.pombe添加量之间的二次回归方程为:
表2 响应面试验设计及试验数据
Table 2 Results of single-factor experiments
Y=68.01+0.687 5A+5.09B+1.75C+1.59AB+2.89AC+0.917 5BC-8.44A2-6.43B2-7.90C2。由表3可知,模型的 P<0.01,表明该模型具有统计学意义;而失拟项P值为0.792 9>0.05,差异不显著,则说明试验中的该回归方程误差较小;R2=0.996 0,说明该模型的拟合度较好,可有效预测不同发酵条件下苹果酸降解率的变化情况,进而验证工艺的准确性。由F值的大小可知,各因素对于苹果酸降解率的影响大小次序依次为:S.pombe添加量>发酵时间>发酵温度,且S.pombe添加量、发酵时间影响极显著。由表3和图3可知,发酵温度与发酵时间、发酵温度与S.pombe添加量、S.pombe添加量与发酵时间交互作用明显,对苹果酸降解率的影响极显著(P<0.01)。
A-发酵温度和S.pombe添加量交互图;B-发酵温度和发酵时间交互图;C-S.pombe添加量和发酵时间交互图
图3 各因素交互作用的响应面图
Fig.3 Response surface plots of the interaction effects of various factors
表3 回归模型方差分析及显著性检验方差分析
Table 3 Analysis of variance (ANOVA) and significance test for the regression model
注:*表示差异显著(P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01)。
分析确定降解苹果酸的最佳工艺条件为:发酵温度27.25 ℃、发酵时间5.10 d、S.pombe添加量6.18%,此时苹果酸降解率为68.81%。为方便实际操作,将发酵条件调整为 27 ℃、发酵时间5 d、酵母添加量6%。按此工艺进行验证,3组平行验证的结果分别为(68.90±0.18)%,相对标准偏差为0.21%。表明该模型优化得到的工艺条件可靠,具有可行性。
2.3 S.pombe发酵对沙棘原浆品质的影响
2.3.1 S.pombe发酵对理化指标及活性成分的影响
SP1757发酵显著降低了糖和酸的含量(表4),还原糖、可滴定酸、苹果酸和可溶性固形物含量分别较沙棘原浆降低75.32%、49.55%、68.90%和24.98%,通过发酵实现糖分自然降解,符合减糖低糖消费趋势[21]。S.pombe在生物降酸时会生成乙醇,降酸样品乙醇含量为(1.82±0.07)%(体积分数),属于“低醇饮料”,不仅有助于柔和沙棘的苦味[22],提升饮品的适口性,还能作为酯类香气的代谢前体物质[23],提升饮品的风味。在颜色特征方面,降酸样品L* 值降低,表明发酵降低样品亮度;a* 值低于沙棘原浆13.32%,呈现出更多的橙黄色色调;b* 值较沙棘原浆提高21.09%,呈现出更多的黄色色调;hab 降低了约 1.13%,变化较小,主色调基本保持稳定;
值较沙棘原浆降低8.53%,颜色饱和度显著下降;ΔE 值为14.40,颜色变化明显,降酸发酵一定程度上降低了亮度和红色调,样品更倾向于橘黄色。
表4 降酸发酵前后理化指标及活性成分的变化
Table 4 Changes in physicochemical indicators and active components before and after acid-reducing fermentation
注:不同小写字母表示相应理化指标及活性成分存在显著差异(P<0.05)。
指标沙棘原浆降酸样品指标沙棘原浆降酸样品可溶性固形物/°Brix12.53±0.12a9.40±0.26bpH2.86±0.03b3.35±0.02a还原糖/(g/L)34.03±1.12a8.40±0.2bL∗54.25±0.98a46.44±0.62b可滴定酸/(g/L)23.33±0.58a11.77±0.49ba∗29.57±0.54a25.63±0.22b乙醇/%vol0b1.82±0.07ab∗53.68±0.37b64.99±0.86a总酚/(mg/L)2 667.33±27.23a2 411.00±42.76bC∗ab78.42±0.21a71.73±1.1b总黄酮/(mg/L)494.01±1.09a 456.36±9.91a ΔE0b14.40a总类胡萝卜素/(mg/L)1.97±0.1b2.46±0.05ahab65.71±1.39a64.97±0.38a 苹果酸/(g/L)12.08±0.05a3.76±0.03b
降酸样品总酚与总黄酮分别比沙棘原浆降低9.60%和7.62%,沙棘的苦涩味主要源于黄酮醇糖苷类物质(如异鼠李素-3-O-新橙皮苷)和部分多酚化合物(如鞣花酸、没食子酸等),总酚与总黄酮含量的适度降低可改善沙棘样品的苦涩感[24-25]。发酵期间,随着沙棘中的苹果酸被降解,环境的酸碱度发生变化,导致微生物破坏多酚(类黄酮)与果胶、纤维素、蛋白质等大分子之间的结合,从而释放被结合的酚类化合物,这可能导致了多酚化合物的减少[26]。S.pombe发酵显著提高了类胡萝卜素的含量,这可能是微生物在发酵过程中苹果酸的减少提高了pH值,为类胡萝卜素的积累提供了有利条件,从而导致总类胡萝卜素含量上升[26],类胡萝卜素(如β-胡萝卜素、叶黄素等)是沙棘中的主要色素成分,其含量的提高有助于提升样品的色泽,使降酸样品呈现更多的橘黄色。综上,S.pombe发酵在沙棘原浆的降酸、减糖、提高颜色稳定性、改善口感等方面具有显著改善效果。
2.3.2 S.pombe发酵对感官评分的影响
感官评价降酸样品和沙棘原浆的酸味、甜味、苦味、涩味、颜色、新鲜度及总体接受度(图4),结果显示,发酵处理对沙棘样品的感官特性影响明显。降酸样品的酸味评分明显上升,这可能是由于发酵过程中苹果酸的降解,缓解了其尖锐的酸味,使其酸感更适口。此外,涩味及苦味评分均有所上升,而新鲜度评分则未发生显著变化,表明发酵过程有效改善了沙棘样品酸、涩和苦的口感,同时保持了其新鲜度,这种风味的变化与发酵过程中糖类、有机酸及酚类物质的减少密切相关。降酸样品的总体接受度较高,表明经过发酵处理的沙棘样品在风味和品质上更符合消费者的偏好。
图4 发酵前后感官评分变化
Fig.4 Changes in sensory scores before and after fermentation
注:得分越高,适口性越好。
2.3.3 沙棘原浆品质指标与感官评价相关性分析
Pearson相关性分析(图5)表明,苹果酸、还原糖、可滴定酸、可溶性固形物与总酚、总黄酮之间存在显著正相关,总酚、总黄酮、还原糖、可滴定酸、可溶性固形物、酒精度、总类胡萝卜素影响沙棘样品的颜色,其中总酚、总黄酮、还原糖、可滴定酸和可溶性固形物与亮度(L*)、红绿色值(a*)和饱和度
显著正相关(P<0.05),酒精度、总类胡萝卜素与黄蓝色值(b*)、ΔE显著正相关(P<0.05);果汁中的可溶性固形物、还原糖和可滴定酸含量的变化会直接影响光吸收特性,进而改变颜色参数[27];总类胡萝卜素的增加通过改变光反射特性、影响色素分子的分布和浓度以及与蛋白质和其他分子的相互作用,显著影响了颜色参数[28]。
图5 感官特性与品质指标之间的Pearson相关性分析和Mantel检验
Fig.5 Pearson correlation analysis and Mantel test between sensory characteristics and quality indicators
结合感官评价结果与Mantel检验分析显示,感官评价指标颜色与L*、a*、b*、ΔE、总酚、总黄酮、还原糖、可滴定酸之间存在显著正相关性(Mantel’s r≥0.5,P<0.05),这与之前的研究结果一致;甜味与可溶性固形物、还原糖、可滴定酸显著正相关(Mantel’s r≥0.5,P<0.05),可溶性固形物和还原糖是决定甜味的主要因素,而可滴定酸则通过影响酸甜平衡来调节甜味的感知[29];总酚、总黄酮与酸味和苦味显著正相关(Mantel’s r≥0.5,P<0.05),总酚和总黄酮的含量变化影响酸味和苦味的强度,S.pombe发酵降低了总酚和总黄酮的含量,对缓和沙棘苦感和酸感具有积极作用[30]。总体接受度与甜酸平衡(还原糖、可滴定酸)和颜色指标(L*、a*)显著相关(Mantel’s r≥0.5,P<0.05);说明食品的感官品质和外观特征对消费者的整体接受度具有重要影响。综上所述,S.pombe发酵沙棘原浆的品质指标与感官特征中的甜味、酸味、苦味等存在显著统计学相关性,接种S.pombe发酵对沙棘原浆的感官品质有重要影响。
3 结论
S.pombe SP1757菌株发酵启动快、降酸量和降酸速率最高,是一种具有沙棘原浆产业应用潜力的菌株。菌株添加量6%、27 ℃发酵时间5 d,沙棘原浆苹果酸降解率达到68.90%。相较沙棘原浆,发酵样品可溶性固形物、还原糖、苹果酸和可滴定酸的含量显著下降,表明S.pombe发酵对沙棘原浆具有良好的降酸降糖效果;发酵样品的总酚和总黄酮含量降低,类胡萝卜素的含量提高,减少了沙棘样品的苦涩感,改善了沙棘样品的颜色。同时感官评价沙棘样品的酸、涩、苦感明显降低,总体接受度明显提高,说明发酵有效提升了沙棘饮品的感官品质。该菌株及工艺的产业化应用有助于开发低糖、适口性好、颜色佳的饮品。
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