全球人口老龄化的趋势日益加重,2015—2030年间,全球60岁及以上人口预计从9.01亿增加到14亿,增幅56%[1]。因此,老年人的膳食营养和健康成为全球关注热点。老年人身体机能减退如牙齿脱落和消化道疾病等,消化吸收能力下降,加重营养不良状况的发生。此外,由于老年人吞咽肌肉无力,柔韧性下降,低黏度的食品流速较快,容易造成呛咳,造成窒息和吸入性肺炎。因此,设计和开发易吞咽且营养丰富的流质食品具有重要意义。
增加蛋白质的摄入有利于增强老年人免疫力,促进肌肉合成,预防肌少症和骨质疏松。但是,目前流质食品主要是多糖基亲水胶体,忽略了蛋白质含量的问题[2]。因此,亟待开发高蛋白流质食品(蛋白含量高于10%)。乳清分离蛋白(whey protein isolate,WPI)具有较高的营养价值,可作为营养粉、奶粉、饮料等产品的功能性成分。热诱导变性不仅能增加黏度,还具有杀菌作用,能够提高食用和贮藏过程的安全性和便捷性。但是高蛋白溶液热处理后易形成硬质凝胶,不适合吞咽障碍人群食用。
多糖在调节凝胶性能、改善凝胶稳定性和增强功能活性等方面具有重要作用。XIONG等[3]研究发现羧甲基纤维素能够抑制卵清蛋白凝胶的形成,调节卵清蛋白的凝胶强度。葛钰鸿等[4]研究发现可溶性大豆多糖与大豆分离蛋白发生糖基化反应,导致蛋白凝胶网络结构疏松多孔,凝胶强度下降。果胶是一种植物酸性多糖,具有乳化、增稠和多种生理功能。果胶来源不同,功能特性不同[5]。然而,不同来源果胶的加入对于WPI凝胶的流变学性质和吞咽特性影响的研究鲜见报道。
目前应用最广泛的商品果胶是柑橘果胶(citrus pectin,CP)、苹果果胶(apple pectin,AP)和甜菜果胶(sugar beet pectin,SP)。因此,本文比较分析了3种果胶的结构特征,进一步以果胶和WPI为原料制备复合物,研究了不同来源果胶对高蛋白热诱导复合物(15%)的流变学性质和吞咽特性的影响,并分析了WPI -果胶复合物的微观结构和蛋白质二级结构,以期为不同来源果胶在开发高蛋白老年食品中的应用提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
WPI(蛋白含量占80%),上海源叶生物科技有限公司;苹果果胶(93854)、柑橘果胶(P9135)、葡聚糖标准品、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(色谱纯),Sigma-Aldrich公司;甜菜果胶,德国Herbstreith&Fox KG公司;盐酸、硝酸钠、咔唑、酚酞、NaOH、浓硫酸,均为分析纯,北京化工厂。
1.2 仪器与设备
Sigma 3-18K冷冻离心机,德国Sigma公司;BSA3202S-CW电子天平,赛多利斯科学仪器北京有限公司;HB digital油浴锅,德国IKA公司;AR1500ex流变分析仪,美国TA Instruments公司;Zetasizer Nano ZS90纳米粒度及zeta电位分析仪,英国马尔文仪器公司;Nicolet iS20傅里叶变换红外光谱仪,美国赛默飞仪器公司;Olympus FV1200激光共聚焦扫描显微镜,日本奥林巴斯公司;JJ-1电动搅拌器,金坛市鑫鑫实验仪器厂;UV-1800紫外分光光度计,日本Shimazu有限公司;高Agilent LC1200效液相色谱仪,美国安捷伦科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 果胶的结构表征
参考冯爽等[5]的方法测定果胶的酯化度、半乳糖醛酸含量、分子质量和单糖组成。酯化度采用滴定法测定。半乳糖醛酸含量采用咔唑-硫酸法测定。分子质量采用高效液相-凝胶渗透色谱法测定,使用示差折光检测器(refractive index detector,RID)和OHpak SB-804HQ柱。采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone,PMP)柱前衍生化结合高效液相色谱法测定果胶中的单糖组成。
1.3.2 复合物的制备
参考FAN等[2]的方法,称取30 g WPI于烧杯中,加入100 mL去离子水,在25 ℃,500 r/min下磁力搅拌2 h,得到300 g/L的WPI溶液,置于4 ℃水合过夜。3种果胶分别称取3 g于烧杯中,加入100 mL去离子水,在80 ℃的水浴中磁力搅拌2 h,得到30 g/L的果胶溶液,置于4 ℃水合过夜。
取300 g/L的WPI溶液分别与去离子水或30 g/L的果胶溶液等体积混合,加入1 mol/L的盐酸调节pH值到4.5,然后500 r/min搅拌10 min。然后95 ℃加热20 min,加热完成后迅速冰浴20 min,然后置于4 ℃过夜备用,制备样品分别标记为WPI(未添加果胶)、WPI+柑橘果胶(WPI+CP)、WPI+苹果果胶(WPI+AP)、WPI+甜菜果胶(WPI+SP)。
1.3.3 粒径分布和zeta电位的测定
将样品稀释400倍后置于纳米粒度及zeta电位分析仪的聚苯乙烯样品池中测量,激光波长为633 nm。每个数据点的采集时间为6 s,每个样本采集10个数据点。检查每个样本的自相关曲线,以确保没有严重的聚集。散射光的检测角度为90°,温度25 ℃,超声振荡3 min,测试3次取平均值。
1.3.4 激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)分析
参考JIN等[6]的方法,将样品摇匀后取0.5 mL于离心管中,向样品管内加入罗丹明B染色液(终浓度为100 μg/mL),37 ℃避光染色30 min。染色完成后,取10 μL样品溶液滴于载玻片上盖上盖玻片,放于激光共聚焦显微镜上100倍拍摄。
1.3.5 傅里叶变换红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)分析
参考ZHANG等[7]的方法并略有改动,取适量干燥的溴化钾粉末与冻干后样品均匀混合,充分研磨,用压片机压成透明薄片。使用FTIR光谱仪测定红外光谱,分辨率4 cm-1,扫描次数为32次,波数范围为4 000～600 cm-1。参考GANTUMUR等[8]的方法,使用PeakFit软件v4.12分析了从酰胺I带(1 700～1 600 cm-1)得出的二级结构(α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲)的相对含量。
1.3.6 流变特性分析
1.3.6.1 静态流变学测试
参考丁玲等[9]的方法并稍作修改。静态流变学分析采用稳态模式,平板40 mm,温度25 ℃,平板间隙值设置为2 mm,频率1 Hz,剪切速率变化范围为0.1～100 s-1,变量扫描为对数模式。用幂律方程对流变曲线进行拟合,如公式(1)所示:
τ=Kγn
(1)
式中:τ,剪切应力,Pa;K,黏度系数,Pa·sn;γ为剪切速率,s-1;n流动特性指数。
1.3.6.2 动态流变学测试
参考ZHANG等[10]的方法。动态流变学分析采用40 mm平板,间隙值为2 mm,首先进行应变扫描以获得样品的线性黏弹性区域。然后根据线性范围确定应力为1.0%,在 25 ℃ 下进行从1～30 Hz 的动态频率扫描;在1 Hz和90 ℃下进行1 200 s的动态时间扫描;在1 Hz的频率下从90～30 ℃的动态温度扫描。
1.3.7 国际吞咽障碍饮食标准(international dysphagia diet standardisation initiative, IDDSI)
根据IDDSI,通过餐叉滴落实验和餐勺倾斜实验评价样品的IDDSI等级水平。餐叉滴落测试:取适量样品置于餐叉上,观察其在静置状态下的低落情况。勺子倾斜测试:将样品置于餐勺中,慢慢地向侧面倾斜,观察样品在勺子平稳倾斜放置时的状态以及勺子滑落后样品的外形。将样品的变形性能和行为与IDDSI 描述进行比较,以评估IDDSI等级水平[2]。
1.4 数据处理
每个实验重复3次,结果以“平均值±标准差”表示。采用Origin 2021作图,用SPSS 20.0软件对数据进行单因素方差分析(ANOVA),P<0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 果胶的结构表征
不同来源果胶的酯化度、半乳糖醛酸含量、分子质量和单糖组成如表1所示。在酯化度方面,苹果果胶的酯化度最高,为78.29%,而柑橘果胶的酯化度最低,为65.32%。柑橘果胶的半乳糖醛酸含量最高,为85.53%(质量分数),而苹果果胶的半乳糖醛酸含量最低,为60.88%(质量分数)。苹果果胶的分子质量最大,为3.12×105 Da,分别是柑橘果胶(1.64×105 Da)和甜菜果胶(1.04×105 Da)的1.9倍和3.0倍。3种果胶的单糖组成也有较大差异,柑橘果胶的半乳糖醛酸含量较高,RG-I区域的比例(Rha/GalA)较低,说明柑橘果胶的线性化程度较高,支链含量较低;而苹果果胶和甜菜果胶的半乳糖醛酸含量低,RG-I区域的比例明显较高,且RG-I区域的中性糖侧链含量(Ara+Gal)/Rha较高,说明苹果果胶和甜菜果胶的分支化程度较高。3种果胶中,苹果果胶具有最大的分子质量和较高的分支化程度,这种结构特征具有较强的空间位阻,会阻碍其与蛋白分子的结合[11]。
表1 不同来源果胶的结构表征
Table 1 Structural information of pectins from different sources
注:甜菜果胶的数据来自Bindereif et al.(2021)[12]。表中“—”代表该单糖未检出。单糖组成以摩尔百分比呈现。
2.2 粒径分布
粒径是反映胶体均匀性和稳定性的重要指标。如图1-a所示,纯WPI样品的粒径最大,添加果胶后粒径明显降低,其中添加了柑橘果胶的复合物粒径最小,其次为甜菜果胶和苹果果胶。这可能是由于纯WPI样品体系的pH值为4.5,接近等电点,分子间静电斥力较弱,促使蛋白颗粒相互靠近聚集,粒径较大。而果胶多糖带负电,添加果胶可以有效抑制蛋白分子间的聚集现象,因此粒径较小[13]。3种果胶中,WPI-柑橘果胶复合物的粒径最小,而添加苹果果胶的复合物粒径最大。这可能与果胶的结构性质有关。由表1可知,苹果果胶的分子质量较大且分支化程度较高,其与蛋白结合的空间位阻较大,因此形成的复合物粒径较大。
a-粒径分布;b-zeta电位
图1 不同来源果胶对WPI-果胶复合物的粒径分布和zeta电位的影响
Fig.1 Effects of pectin from different sources on particle size distribution and zeta potential of WPI/pectin complexes
注:不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。
2.3 zeta电位
zeta电位是衡量胶体分散稳定性的重要指标。其绝对值越大,体系越稳定,颗粒分散性也越好;而该值越小,越不稳定,越容易发生絮凝或聚集。由图1-b可以看出,纯WPI样品的zeta电位为-27.27 mV,添加了柑橘果胶和甜菜果胶的复合物zeta电位绝对值显著增加(P<0.05),分别为-33.17 mV和-33.00 mV,苹果果胶与纯WPI样品的电位没有显著差异(P>0.05)。果胶为酸性多糖,携带负电荷。由表1可知柑橘果胶和甜菜果胶的酯化度小于苹果果胶,游离羧基较多,带有更多的负电荷,因此柑橘果胶和甜菜果胶制备的复合物zeta电位的绝对值更大。添加了柑橘果胶和甜菜果胶的WPI复合物zeta电位的绝对值较高,颗粒之间静电排斥作用较大,减弱了蛋白分子间的聚集,提高了复合物体系的稳定性。
2.4 CLSM分析
利用CLSM观察不同果胶制备的WPI复合物的微观结构(图2),红色为WPI。WPI样品的微观结构不均匀,聚集体较多且体积较大(图2-a)。添加果胶后,聚集体明显减少,分散均一性显著增加。该结果说明果胶的添加能够阻止蛋白分子间的聚集,提高胶体体系的稳定性[14]。添加柑橘果胶的WPI复合物的聚集体最小,微观结构最均匀(图2-b),其次为甜菜果胶(图2-d),苹果果胶的微观结构中聚集体较多(图2-c)。这个现象与果胶结构性质密切相关。柑橘果胶具有较低的分子质量和较少的中性糖侧链,有助于其与蛋白质分子结合,抑制蛋白质聚集,而苹果果胶的分子质量较大,且含有较多的阿拉伯聚糖和半乳聚糖等侧链,其与蛋白结合的空间位阻更大,因此其复合物颗粒较大。甜菜果胶的乙酰基含量高,疏水性较强,这种结构影响果胶与蛋白质的结合,从而降低了蛋白质网络的均匀性。
a-WPI;b-WPI+CP;c-WPI+AP;d-WPI+SP
图2 果胶-WPI复合物的CLSM图
Fig.2 CLSM images of WPI/pectin complexes
2.5 FTIR分析
FTIR图谱用于表征果胶和蛋白质分子间互作和蛋白质的二级结构。如图3-a所示,在3 270 cm-1附近的条带(3 400～3 200 cm-1)表征N—H和O—H伸缩振动,2 962 cm-1表征疏水C—H伸缩振动。1 627 cm-1处的条带(1 700～1 600 cm-1)为蛋白的酰胺I带,表征C
O伸缩整振动。氢键主要在这些区域形成,氢键的形成能够均衡电子云的密度,降低伸缩振动频率。添加果胶后,这些区域的振动频率降低,说明分子间氢键作用增强,即蛋白和果胶分子之间存在氢键作用,这也是果胶和乳清分离蛋白形成稳定结构的原因[15]。酰胺Ⅱ带通常出现在1 600 ～1 500 cm-1的波数范围,添加果胶后,酰胺Ⅱ带由1 513 cm-1处分别移至1 518、1 517、1 514 cm-1处,说明WPI中的氨基酸残基可能与果胶中的羧基发生了静电相互作用[16]。柑橘果胶的酰胺Ⅱ带偏移最大,说明其与WPI的静电相互作用最强,因此柑橘果胶-WPI复合物的粒径最小。
a-FTIR;b-二级结构组成
图3 不同来源果胶对果胶-WPI复合物FTIR和二级结构组成的影响
Fig.3 Effects of pectin from different sources on the FTIR and secondary structure composition of pectin-WPI complex
图4 不同来源果胶-WPI复合物的表观黏度曲线
Fig.4 Effects of pectin from different sources on the apparent viscosity of WPI/pectin complexes
酰胺Ⅰ带通常用来分析蛋白质的二级结构。采用傅里叶自去卷积和计算二阶导数方法,对1 700～1 600 cm-1区域进行分峰拟合处理。二级结构的含量为相应范围的峰面积与酰胺Ⅰ带总面积的比值。1 640～1 600 cm-1对应β-折叠,1 650～1 640 cm-1为无规则卷曲,1 660～1 650 cm-1为α-螺旋,1 700～1 660 cm-1为β-转角。图3-b为纯WPI样品和添加果胶的WPI复合物的二级结构,在所有的二级结构中,β-折叠含量最高。WPI样品的β-折叠、无规则卷曲、α-螺旋和β-转角的相对含量分别为43%、11%、19%和27%。添加果胶后,β-折叠和α-螺旋含量增加,β-转角和无规则卷曲含量降低,说明果胶加入后乳清分离蛋白的变性程度降低[17]。XIA等[18]研究发现,热处理过程中复合物有序网络的建立和β-折叠的形成密切相关。因此,添加果胶后β-折叠含量增加,胶体网络结构更加有序。
2.6 流变学性质
2.6.1 静态流变学性质
由图5可以看出,随着剪切速率的增加,样品的表观黏度逐渐降低,表现出典型的剪切稀化行为。这可能是由于在剪切作用下分子间的缠结和网络结构被破坏[9]。添加果胶后样品的表观黏度显著降低,其中甜菜果胶-WPI复合物的表观黏度最低,其次为柑橘果胶和苹果果胶。果胶加入后与蛋白质分子结合,抑制了热诱导的蛋白凝胶的形成,因此表观黏度显著降低。有研究表明果胶溶液的表观黏度与其分子质量成正比[19],分子质量较大的果胶由于其更大的分子尺寸和更多的分子间作用力,可能会在水溶液中形成更复杂的网络结构,从而提高了表观黏度[20]。相反,分子质量较小的果胶形成的网络结构可能较为松散,导致较低的表观黏度。由上文可知,3种果胶中苹果果胶的分子质量最大,其次是柑橘果胶,甜菜果胶的分子质量最小,因此3种果胶中苹果果胶-WPI复合物的表观黏度最大,甜菜果胶-WPI复合物最小。剪切稀化的特性有利于吞咽困难人群的饮食,降低误吸的风险。采用幂律模型拟合流变特性参数(表2)。所有样品的流变特性指数均小于1,说明均属于剪切变稀的假塑性流体,有利于吞咽[10]。WPI样品的黏度系数最高,添加果胶后黏度系数降低,甜菜果胶的黏度系数最低。
a-储能模量;b-损耗模量;c-tanδ
图5 果胶-WPI复合物的频率扫描曲线
Fig.5 Frequency scanning curves of WPI/pectin complexes
a-G′;b-G″;c-tanδ
图6 果胶-WPI复合物的温度扫描曲线
Fig.6 Temperature scanning curves of WPI/pectin complexes
a-G′;b-G″
图7 果胶-WPI复合物的时间扫描曲线
Fig.7 Time scanning curves of WPI/pectin complexes
表2 果胶-WPI复合物的流变学参数
Table 2 Power law equations of WPI/pectin complexes
注:同行不同的小写上标字母表示具有显著差异(P<0.05)。
果胶种类黏度系数/(Pa·sn)流变特性指数R2WPI76.77±12.74a0.85±0.05a0.914 9WPI+CP19.57±2.76bc0.15±0.01b0.981 8WPI+AP25.10±0.31b0.08±0.02c0.924 0WPI+SP8.02±0.66c0.15±0.03b0.984 0
2.6.2 动态流变学性质
动态流变学性质是评价吞咽障碍食品的重要指标。储能模量和损耗模量分别反映样品的弹性和黏性性质。图6为储能模量(G′)和损耗模量(G″)随角频率变化的情况。随着角频率的增加,储能模量和损耗模量均呈现出上升趋势,说明弹性和黏性性质均具有频率依赖性。纯WPI样品的G′大于G″,说明WPI样品主要表现为固体的弹性特征。添加了果胶的复合物储能模量显著下降,说明其弹性特性显著降低。对于损耗模量,添加柑橘和甜菜果胶的WPI复合物的损耗模量显著降低,说明这2种果胶的添加降低了复合物的黏性性质。而添加苹果果胶的复合物在低频率下低于纯WPI样品,随着频率的增加其损耗模量高于纯WPI样品,说明添加苹果果胶能够提高较高频率下的黏性。一般来说,果胶分子质量越大,黏弹性越高[21]。3种果胶中苹果果胶的分子质量最大,因此其制备的WPI-果胶复合物的黏弹性更高。tanδ为G″和G′的比值,tanδ>1表示稀溶液,而0.1
温度扫描能够反映凝胶形成过程中的动态黏弹性变化。如图7所示,温度越低,G′和G″越高,说明黏弹性增强。这可能是由于非共价相互作用如离子键和氢键等随温度降低而增强或者蛋白质聚合物的解离减弱,导致复合凝胶的黏弹性增强[22]。纯WPI凝胶的G′始终大于G″,说明WPI在整个温度扫描范围内均表现为固体的弹性特征。添加果胶后,G′和G″降低,说明果胶破坏了WPI分子间的相互作用和网络结构,这与频率扫描结果一致。苹果果胶的G′和G″高于柑橘果胶和甜菜果胶,说明添加了苹果果胶的WPI复合物黏弹性更高[23-24]。如图7所示,所有样品的tanδ均在0.1～1,说明其为弱凝胶,具有一定的弹性特征,适合吞咽困难人群食用。
图8为G′和G″随时间变化的情况。在整个时间扫描范围内,纯WPI凝胶和添加了果胶的WPI复合物样品的G′均大于G″,说明这些样品主要表现为弹性特征。
a-餐叉滴落测试;b-勺子倾斜前期;c-勺子倾斜中期; d-勺子倾斜后期
图8 果胶-WPI复合物的IDDSI测试
Fig.8 IDDSI test of WPI/pectin complexes
而纯WPI样品和苹果果胶-WPI凝胶的G′和G″值在时间扫描期间基本保持稳定,表明这些复合物的网络结构较为稳定。而添加了甜菜果胶和柑橘果胶的WPI复合物的G′和G″在测试时间内缓慢增加,这可能与其凝胶网络在长时间内进一步增强有关。
2.7 IDDSI测试
根据IDDSI框架对WPI样品进行等级评价[25]。由餐叉低落测试可以看出,纯WPI样品、添加苹果果胶和甜菜果胶的复合物均在叉子上方堆积,而添加了柑橘果胶的复合物在叉子下方悬垂,但未低落。在餐勺倾斜测试中,WPI可以在勺子上成团块堆积,在倾斜时缓慢滑落,滑落后勺子上有较大食团残留,而添加果胶后的WPI复合物可以从勺子上轻易流下,苹果果胶复合凝胶最易流动,流下后,柑橘果胶和甜菜果胶的WPI复合物在勺子上形成均匀细腻的薄层,而添加了苹果果胶的复合物形成的涂层较粗糙。IDDSI评价结果为,纯WPI样品为4级,添加果胶的复合物为3级。以上结果说明纯WPI样品在吞咽时,容易在咽喉部形成食物残留,由于食团颗粒较大且分散,容易进入气管造成误吸。而添加果胶的WPI复合物质地细腻,无较大食团,因此适合吞咽障碍的人群食用,添加了柑橘果胶和甜菜果胶的WPI复合物最易于吞咽。
3 结论
本文研究了3种来源果胶对乳清分离蛋白热诱导复合物理化和结构性质的影响,结果表明,3种果胶的加入能够抑制蛋白分子间的聚集,降低粒径,提高复合物的稳定性。添加柑橘果胶形成的复合物粒径最小,zeta电位绝对值最大。添加果胶可以增强分子间的氢键,和蛋白质发生静电相互作用,抑制蛋白分子间的聚集。流变学分析表明,添加果胶能够降低WPI胶体的表观黏度和黏弹性,其中苹果果胶-WPI复合物相比于另外2种果胶黏度和黏弹性最大。IDDSI测试表明,纯WPI样品属于IDDSI框架中的4级(糊状)吞咽食品,从勺子上滑落后有较大团块残留,而添加果胶的复合物为3级,滑落后在勺子上形成均匀细腻薄层,更适合吞咽障碍人群食用。综上所述,不同来源的果胶可以用于制备高蛋白流质产品以满足吞咽障碍人群的食用,为老年食品的开发奠定基础。
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