近年来,随着消费者健康意识的增强,益生菌饮料市场需求持续增长[1],其中乳制品占据主流地位[2]。然而,针对乳糖不耐受及素食群体而言,开发植物基益生菌制品迫在眉睫[3]。研究表明,乳酸菌代谢对碳源具有高度选择性,而豆制品生产副产物——豆清液的年产量大,每公斤大豆约产生9 kg豆清液[4]。因其富含蔗糖、水苏糖及大豆异黄酮等营养成分,能有效支持益生菌生长以展现出独特的价值,是开发低成本高营养的植物基饮料理想的基质。基于此,欧红艳等[5]以豆清液为主要原料,通过单因素试验与响应面法相结合,以总酸、pH值、可溶性固形物和还原糖含量为关键评价指标,通过优化低聚果糖、麦芽汁、酒花及麦芽糖的添加配比,开发出一款抗氧化活性的豆清饮料。RATHER等[6]利用响应面法(response surface methodology,RSM)通过调整豆清液、菠萝、白糖三者比例得到一款富含大豆异黄酮的复合饮料。然而,单因素试验与RSM等传统的工艺优化方法通常存在耗时费力等局限性,未能充分考量消费者关注的感官风味与工艺之间相互协同作用,严重制约了豆清饮料的市场化。
BP神经网络作为一种数据驱动工具,在函数逼近、非线性函数拟合和在线预测工艺方面表现出色,成为广泛使用的神经网络模型之一[7]。龚敏慧等[8]基于蓝莓基质,优选3株高产胞外多糖乳酸菌,通过单因素试验与RSM筛选出发酵温度、初始pH、接种量及发酵时间四大关键参数,并采用人工神经网络(artificial neural network,ANN)和遗传算法(genetic algorithm,GA)求解,所得发酵工艺条件更为精准且感官风味品质更为优良。辛敏汉[9]以石榴为主要原料枸杞、葡萄为辅料,通过单因素试验、响应面试验和BP神经网络模型优化发酵工艺参数,优化下石榴酒呈现明亮的石榴红,组织均匀无杂质风味协调。由此可见,利用单因素试验、响应面试验和BP神经网络模型优化得出工艺能够改善发酵饮料工艺及品质,将其运用于豆清饮料可以有效预测豆清饮料工艺的问题。然而,目前关于乳酸菌发酵百香果豆清饮料工艺研究尚未清楚。
本研究以百香果汁和豆清液为原料,以活菌数、感官评分为指标,利用单因素筛选得到关键因素,采用响应面试验、ANN-GA建立神经网络模型,得到百香果豆清饮料最佳工艺。在最佳工艺基础上,监测发酵过程中感官风味形成规律,为豆清饮料发酵工艺的改进、风味品质的提升和豆清液多元化发展提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
豆清液,豆制品加工与安全控制湖南省重点实验室;百香果(品种为钦蜜9号),湖南绿叶水果有限公司;液态食品发酵剂(植物乳植杆菌、鼠李糖乳酪杆菌、干酪乳酪杆菌、肠膜明串珠菌肠膜亚种),其活菌数≥109,湖南君益福食品有限公司。
1.2 仪器与设备
Flavour Spec®风味分析仪[气相-离子迁移谱(gas chromatography-ion mobility spectrometry,GC-IMS)],德国G.A.S公司。
1.3 实验方法
1.3.1 百香果豆清饮料工艺流程
原料预处理→调配→杀菌→冷却→接种→发酵→百香果豆清饮料
1.3.2 样品制备
1)原料预处理:新鲜豆清液400目滤袋过滤;百香果取出果浆后过滤除去果籽,制得百香果汁。
2)调配:以豆清液为基准,加入百香果汁20%(体积分数),白砂糖调整可溶性固形物含量为13 °Brix,食用碳酸氢钠初始pH值为4.1。
3)杀菌:灌装至玻璃瓶中进行巴氏杀菌,待样品中心温度达85 ℃恒温计时10 min。
4)接种:冷却后样品放置无菌操作台,接种乳酸菌0.5%(体积分数)。
5)发酵:培养箱35 ℃发酵18 h。
1.3.3 单因素试验设计
以活菌数及感官评分为评价指标,选择百香果汁添加量(10%、15%、20%、25%、30%,体积分数)、乳酸菌添加量(0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%,体积分数)、可溶性固形物含量(11、12、13、14、15 °Brix)、发酵时间(12、15、18、21、24 h)、发酵温度(31、33、35、37、39 ℃)、初始pH值(3.5、3.8、4.1、4.4、4.7)6个因素进行单因素试验。
1.3.4 响应面优化实验
在单因素基础上,以百香果汁添加量(A)、乳酸菌添加量(B)、发酵温度(C)、发酵时间(D)并用感官评分为响应值,Design Expert 13软件进行响应面优化,试验设计见表1。
表1 响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of the response surface test
1.3.5 人工神经网络建模
根据响应面试验设计原理,通过MATLAB R2024b获取BP神经网络训练模型所需要的训练、测试和验证数据。采用29组实验数据训练,百香果汁添加量(A)、乳酸菌接种量(B)、发酵温度(C)以及发酵时间(D)作为输入层,感官评分作为输出层。训练函数、学习函数、激活函数均为默认,建立人工神经网络。网络迭代次数为1 000,精度为0.000 001,学习率为0.01。隐藏神经元的数量通过反复实验而变化,直到网络在训练后表现最佳,得到BP神经网络模型。
1.3.6 感官评定
参考邹伟等[10]的方法,稍作修改。从邵阳学院食品与化学工程学院挑选12名在食品感官分析领域有着丰富经验并熟悉各种感官描述词汇的人员组成品评小组(6名男性和6名女性)。按百分制对样品色泽、气味、组织状态、口感和总体接受度进行评分,感官评分标准见表2。在正式感官评价之前对品评小组进行培训,使全部品评人员对感官评分的标准熟悉且达到一致。
表2 百香果豆清液发酵饮料感官品质评分标准
Table 2 Sensory quality scoring criteria for passion fruit bean clear liquid fermented drinks
1.3.7 GC-IMS评定
参考钟秋丽等[11]的方法,稍作修改:称取样品2 g,置于15 mL顶空瓶中,于50 ℃孵化15 min,孵化速度为500 r/min,进样温度80 ℃,进样体积500 μL。GC条件:色谱柱MXT-5(15 m ×0.53 mm,1.0 μm);柱温为60 ℃;载气为高纯氮气(纯度≥99.999%);载气流速:0～2 min,2 mL/min;2～25 min,2～100 mL/min;25～ 30 min,100 mL/min;IMS条件:漂移管长度530 mm;IMS温度45 ℃;流速为150 mL/min。C4～C9正酮类化合物为外标,以保留指数、漂移时间与软件内置IMS数据库进行比对定性。
1.4 数据处理与分析
每组实验重复3次以上,采用IBM SPSS Statistics 26、Origin 2025、SIMCA-P 14.1、Unscrambler X软件分别用于统计分析及绘图。利用Design Expert 13.0进行响应面分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
各因素对百香果豆清饮料活菌数及感官特性影响结果见图1。
图1 不同单因素对百香果豆清饮料的影响
Fig.1 Effect of different single factors on passion fruit and bean clear beverag
注:不同小写字母表示差异显著(P <0.05)(下同)。
a-百香果汁添加量;b-乳酸菌添加量;c-发酵温度;d-发酵时间;e-初始pH值;f-可溶性固形物
由图1-a可知,当百香果汁添加量小于20%,豆腥味偏重感官评分较低。百香果汁添加量为20%,感官评分91分,活菌数达到8.38 lg CFU/mL此时饮料色泽气味口感均较好。当百香果汁添加量大于20%,果汁感浓烈破坏酸甜平衡,故活菌数、感官评分均呈下降趋势[12]。因此,最佳的百香果添加量为20%。
由图1-b可知,当乳酸菌添加量小于0.5%,底物营养物质无法完全被利用;乳酸菌添加量为0.5%时,活菌数和感官评分达到最高,分别为8.40 lg CFU/mL和88分,此时营养物质与乳酸菌能充分参与发酵;然而,当乳酸菌添加量大于0.5%,由于营养物质有限,导致乳酸菌发酵不全[13],从而导致活菌数和感官评分均呈下降趋势。因此,最佳的乳酸菌添加量为0.5%。
由图1-c可知,发酵温度31～35 ℃时,活菌数及感官评分均呈上升趋势,发酵温度35 ℃时活菌数和感官评价达到最高,分别为8.45 lg CFU/mL和89分;当发酵温度为35～39 ℃时,高温环境导致部分乳酸菌失去生长活性[14],进而导致活菌数和感官评分均呈下降趋势。因此,最佳的发酵温度为35 ℃。
由图1-d可知,在18 h活菌数达到8.43 lg CFU/mL,感官评分91分,发酵时间12～18 h此时乳酸菌处于增长阶段,故活菌数和感官评分随发酵时间延长而增加;当发酵时间为18～ 24 h时,因乳酸菌进入平台期营养物质接近代谢饱和[13],故呈活菌数、感官评分缓慢下降趋势。因此,最佳的发酵时间为18 h。
由图1-e可知,初始pH值低于4.1时,乳酸菌生长环境偏酸,不适宜微生物生长代谢[15];当初始pH值为4.1时活菌数和感官评分达到最高,分别为8.48 lg CFU/mL和88.6分;当pH值大于4.1时,感官评分和活菌数呈下降趋势。因此,最佳的初始pH值为4.1。
由图1-f可知,可溶性固形物13 °Brix,活菌数达到8.45 lg CFU/mL,感官评分达到90分,此时碳源含量处在乳酸菌生长合适范围内;可溶性固形物低于13 °Brix碳源不足,乳酸菌生长缓慢,高于13 °Brix碳源过量会使得微生物细胞的渗透压发生改变,从降低微生物的出生率及感官评分[16]。因此,最佳的可溶性固形物为13 °Brix。
2.2 响应面优化结果
在单因素试验的基础上以感官评分为指标,采用Design-Expert13软件进行试验设计,确定饮料的最佳工艺,试验设计及结果见表3。
表3 响应面试验设计及结果
Table 3 Response surface test design and results
对表3试验数据进行二次多项回归拟合获得感官评分对百香果添加量(A)、乳酸菌添加量(B)、发酵温度(C)、发酵时间(D)的多元回归方程为:Y=89.75-3.75A +1.67B +1.75C +1.00D-0.5AB-0.5AC-0.75AD-1.75BC +1.25BD +1CD-7.71A2-7.83B2-6.46C2-8.08D2,该模型方差分析结果见表4。
表4 回归模型方差分析
Table 4 Analysis of variance for the regression model
注:“∗∗”表示差异极显著(P<0.01)“∗”表示差异显著(P<0.05)。
由表4可知,该回归模型P <0.01,极显著,失拟项P=0.436 9 >0.05,不显著,说明方程能准确反映感官评分与各因素之间的关系。回归模型相关系数R2=0.985 7,
=0.970 2,拟合程度良好。4因素影响程度依次为百香果添加量(A) >发酵温度(C) >乳酸菌添加量(B) >发酵时间(D)。4个因素对感官评分(Y)的影响曲线图见图2。
图2 各因素交互作用对百香果豆清饮料综合评分影响的响应面图
Fig.2 Response surface plots of the effect of interaction of factors on the composite score of passion fruit and bean clear drink
a-百香果添加量与乳酸菌添加量交互;b-百香果添加量与发酵温度交互;c-百香果添加量与发酵时间交互;d-乳酸菌添加量与发酵温度交互;e-乳酸菌添加量与发酵时间交互;f-发酵时间与发酵温度交互
2.3 GA-BP神经网络优化分析
利用MATLAB R2024b软件中的BP神经网络工具箱进行神经网络模型的构建,最终确定神经网络的结构为:输入层为百香果添加量、乳酸菌接种量、发酵温度、发酵时间4个神经元,隐含层有6个神经元,输出层为综合感官评分1个神经元。首先用响应面试验数据进行训练,执行迭代拟合操作。如图3、图4所示,BP神经网络预测模型训练稳定且收敛迅速,百香果豆清饮料的感官评分在迭代6次时,神经网络预测模型达到最佳性能。在此条件下,训练集均方误差为0.042 849,训练、验证和测试数据的R 值分别为0.997 49、0.940 16、0.893 41,总体R 值为0.947 51,表明拟合良好。通过遗传算法求解该模型的最优值,得到最佳发酵工艺条件为百香果添加量18.72%、乳酸菌添加量0.52%、发酵温度35.27 ℃和发酵时间18.27 h,测得饮料的感官评分为90.48分。将工艺调整为百香果添加量20%、乳酸菌添加量0.5%、发酵温度35 ℃和发酵时间18 h。在此条件下进行3次验证实验,实际饮料感官评分为89.98分,预测值与实验值具有很高的相关度,表明模型拟合度较好,与预测值相比基本一致,可见BP神经网络的模型合理、准确性高。因此,采用RSM-ANN优化发酵百香果豆清饮料提高感官评分的工艺条件准确可靠,表明利用BP神经网络模型与响应面相结合能很好地预测工艺条件。
图3 GA-BP神经网络均方误差变化曲线和拟合结果
Fig.3 MSE variation curve and fitting results of GA-BP neural network
a-均方误差变化曲线;b-GA-BP神经网络拟合
图4 百香果豆清饮料发酵过程GC-IMS二维图和差异谱图
Fig.4 GC-IMS two-dimensional and GC-IMS difference spectra of the fermentation process of passion fruit bean clear drink
a-GC-IMS二维图谱;b-GC-IMS差异谱图
图5 百香果豆清饮料发酵过程挥发性物质的指纹图谱
Fig.5 Fingerprints of volatiles during fermentation of passion fruit bean clear drink
2.4 基于GC-IMS解析不同发酵阶段对百香果豆清饮料香气特征的影响
2.4.1 不同发酵阶段对百香果豆清饮料整体香气轮廓的影响
通过GC-IMS对最佳发酵工艺下乳酸菌发酵百香果豆清饮料的挥发性风味成分进行了深入分析,可明确百香果豆清饮料在发酵过程中整体香气轮廓的变化规律。结果如图4-a所示,横轴为离子迁移时间,纵轴为气相色谱保留时间。每个点代表一种挥发性化合物,颜色的深浅表示物质的含量[17],发酵后样品中的信号峰更加丰富。图4-b通过Reporter插件进一步显示了发酵5个时间点的挥发性差异。以0 h对照组,当发酵过程样品的含量高于对照组0 h时,分析物以红色显示,而当样品中的分析物含量低于对照组时,分析物显示为蓝色。百香果豆清饮料随着发酵时间延长,挥发性代谢物增加,集中在保留时间195～250 s,漂移时间6.0～9.0 ms、保留时间380～420 s,漂移时间6.5～12 ms及保留时间680～750 s,漂移时间10～12.5 ms。随着时间推移也有部分挥发性物质逐渐减少,主要集中在保留时间195～100 s,漂移时间6.0～8.0 ms、保留时间250～270 s,漂移时间6.0～8.5 ms的区域及最后680～750 s,漂移时间7.5～12.0 ms。由此可见,随着发酵时间的延长,百香果豆清饮料的挥发性化合物含量逐渐增加,表明乳酸菌发酵可显著促进百香果豆清饮料挥发性化合物的形成。
2.4.2 不同发酵阶段对百香果豆清饮料挥发性化合物的影响
为进一步明确不同发酵阶段对对百香果豆清饮料挥发性化合物的影响,分析了各发酵时间点饮料样品中挥发性化合物含量。结果如表5所示,通过GCIMS共鉴定出53种挥发性化合物,醇类(10)、酯类(18)、萜烯类(5)、烷烃类(3)、酮类(9)、酸类(2)、醛类(3)、醚类(1)、吡嗪类(1)和腈类(1)。随着发酵时间延长,各类物质的相对比例有所差异但未有新增,均以酯类成分为主,其主要是由于乳酸菌代谢特性接种量阈值及基质互作限制的影响[18]。此外,乳酸菌发酵显著改变了百香果豆清饮料中风味化合物的含量和组成,发酵过程中酯类、萜烯类、醚类、腈类化合物呈下降趋势,醇类、烷烃类、酮类、酸类、吡嗪类化合物呈上升趋势。值得注意的是,前18 h风味化合物的变化趋势较为平缓,波动幅度均不超过7.8%。然而在发酵24 h后下降组化合物类别含量骤降(酯类6.2%、萜烯类10.9%、醚类31.7%、腈类45.8%),上升组则骤升(醇类15.0%、烷烃类23.78%、酮类52.2%、酸类43.10%、吡嗪类94.8%)。
表5 百香果豆清饮料发酵过程VOCs的相对含量
Table 5 Relative content of VOCs during fermentation of passion fruit bean clear beverage
注:不同字母表示同类化合物不同发酵时间差异显著(P <0.05)。
2.4.3 不同发酵阶段对百香果豆清饮料特征风味指纹图谱的影响
为了可视化区分不同发酵阶段对百香果豆清饮料特征风味的影响,将53种挥发性化合物划分为A、B、C、D、E 5个区域的指纹图谱。A区中,挥发性化合物含量差异相对不大,表明随着发酵推移这些化合物贡献的香气特征较为稳定,其中己酸乙酯和乙酸乙酯可赋予饮料果香味和甜香味。B区中,随着发酵时间推移,2-丁醇、异丁酸异丙酯、1-乙酰氧基-2-丙酮、1,2-二甲氧基乙烷的含量逐渐增强,这些香气化合物具有微甜酒果味的风味特征,表明乳酸菌发酵使百香果饮料往微甜酒果味方向发展。C区中,挥发性化合物在18 h中含量升高,以酯类化合物为主。值得注意的是,发酵18 h产生的香气化合物以可赋予饮料令人愉悦的香气为主,除乙醇(酒精味)、1-丁醇(酒香)、月桂烯(草木香)、莰烯(木质香)、3-甲基丁醛(麦芽香)外,其余酯类物质呈花果香,赋予饮料浓郁香气。D区中,随着时间延长,挥发性化合物的含量逐渐降低,其中具有不良风味特征的二甲基二硫醚、1-丙硫醇、硫氰酸甲酯、异硫氰酸异丙酯、2-甲基-1-丙醇、(E)-3-戊烯腈和十一烷化合物的含量逐渐降低,表明了豆清液中的不良风味特征被逐渐抑制。其原因可能是乳酸菌通过糖酵解和氨基酸代谢,抑制硫代谢关键酶活性,从而减少不良挥发性风味物质的积累[18]。E区中,挥发性化合物集中在24 h含量升至最高。然而,具有愉悦特征香气甲酸乙酯(甜润果香)、甲基吡嗪(花生香)、藏花醛(药草香)和环戊酮(樟脑清凉感)含量的增加,且具有酸败刺激等不良风味的化合物如丁酸、丙酸、2-丙硫醇、环己烷、5-甲基-3-庚酮等含量也增加,表明过度发酵将引发饮料风味品质劣变[18]。总体来看,A区是该饮料主体香气区域;B区随发酵后香气逐渐凸显;C区为香味聚集地,保留发酵过程中果香气。D区是香气不断减少;E区产生不良风味特征差异区域。
2.5 百香果豆清饮料发酵过程整体香气品质的关键标志化合物
为了进一步观察百香果豆清饮料发酵过程之间的挥发性差异,采用正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis,OPLS-DA)对不同发酵时间段香气活性化合物进行分析。OPLS-DA是一种多变量统计分析方法,特别适用于分类和特征选择,可以有效解释观测值并进行相应变量的预测[19]。如图6-a所示,5个样本组之间的分离程度明显。样本点之间的距离通常表示它们在变量空间中的相似度。距离越近,样本越相似,距离越远,样本之间的差异越大。 R2X=0.812 >0.5、Q2=0.708 >0.5,说明模型具有较好的拟合准确性和预测能力。此外,通过图6-b可知,R2=0.789,Q2=-1.49,|Q2 | >0.5,且Q2 的回归线与Y轴的相交点均位于负半轴,说明该模型不存在过拟合现象,置换验证是可靠和有效的可进一步用于探索百香果豆清饮料发酵过程中的风味差异。通过变量投影重要度(variable importance in projection,VIP)分析来衡量OPLS-DA模型中各挥发性物质中的贡献。VIP >1,代表该挥发性物质为标志性风味物质。VIP值越大,代表该物质对整体风味的贡献越大。由图6-c可知,乙酸戊酯、β-蒎烯、环戊酮、甲酸异丁酯、β-月桂烯、乙醇、丁酸、丁酸乙酯、2-丁氧基乙醇、柠檬烯、已酸乙酯、5-丙基二氢-2(3H)-呋喃酮、甲酸丁酯、1-丁醇、2-丁醇、甲基吡嗪和3-丁烯-1-醇甲酯共筛选出VIP >1的17种化合物,主要为酯类物质和醇类物质。因此,这17种化合物可以作为区分百香果豆清饮料不同发酵期间整体香气轮廓的关键标志化合物。值得注意的是,醇类是通过乳糖代谢,酮体还原、氨基酸代谢和脂肪酸降解形成[20];酯类主要通过有机酸和酒精的酯化作用产生,对果味形成有很大的贡献[21],因而在发酵饮料酯类与醇类备受关注。
图6 百香果豆清饮料发酵过程挥发性风味物质的元统计分析
Fig.6 Meta-statistical analysis of volatile flavor substances during fermentation of passion fruit bean clear beverage
a-OPLS-DA得分图;b-置换检验图;c-VIP值
2.6 百香果豆清饮料发酵过程中感官特性的变化
从色泽、气味、口感、组织状态、总体接受度5个方面对不同发酵时间点的饮料进行感官评分,结果如图7所示,随着发酵时间推移,各组感官评分先增后减,口感和总体接受度增幅最为明显。发酵18 h感官评分达致顶峰,色泽呈暗橙色,组织状态更稳定,口感酸甜可口,果香浓郁这与上文挥发性风味物质结果相吻合,进一步表明发酵可显著增强饮料感官品质。这一结果与WANG等[22]的利用乳酸菌发酵猕猴桃饮料的结论一致,乳酸菌发酵可以保持饮料的颜色,改善其口感提高消费者的接受度。
图7 百香果豆清饮料发酵过程感官评定的雷达图
Fig.7 Radar chart for sensory evaluation of fermentation process of passion fruit and bean clear beverage
3 结论
本研究通过百香果添加量、乳酸菌添加量、发酵温度、发酵时间、初始pH、可溶性固形物6个单因素试验,以活菌数、感官评分为评价指标,选取百香果添加量、乳酸菌添加量、发酵温度、发酵时间为因素设置了水平,进行Box-Behnken响应面试验设计、ANN对获得的数据进行建模,通过GA求解该模型的最佳工艺,并在此基础上利用GC-IMS和感官特性探索饮料发酵期间的感官风味变化。实验结果表明,最佳发酵工艺为百香果添加量20%、乳酸菌添加量0.5%、发酵温度35 ℃、发酵时间18 h、可溶性固形物13 °Brix,初始pH值为4.1。通过GC-IMS分析共鉴定出53种化合物,醇类(10)、酯类(18)、萜烯类(5)、烷烃类(3)、酮类(9)、酸类(2)、醛类(3)、醚类(1)、吡嗪类(1)和腈类(1)。OPLS-DA分析筛选出乙酸戊酯、β-蒎烯、环戊酮、甲酸异丁酯、β-月桂烯、乙醇、丁酸、丁酸乙酯、2-丁氧基乙醇、柠檬烯、已酸乙酯、5-丙基二氢-2(3H)-呋喃酮、甲酸丁酯、1-丁醇、2-丁醇、甲基吡嗪和3-丁烯-1-醇甲酯17种化合物作为影响发酵过程风味特征的关键标志化合物。该研究为豆清液饮料风味与工艺提供理论依据,实现豆清液高值化资源的深度开发开辟有效途径。
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