中国作为全球重要的家禽养殖及屠宰大国,2023年鸡肉年产量达到2 152万t,占我国肉类总产量的三分之一,由此每年将会产生1 500~2 000万t的鸡骨禽类加工副产物[1]。其中,鸡骨架作为去除鸡腿、鸡翅、鸡胸等主肉部位后的剩余产品,不仅含有丰富的肌肉组织、结缔组织和脂肪,更蕴含游离氨基酸、核苷酸、有机酸、糖类及多肽等多种生物活性物质[2]。肉品工业领域已充分认识到鸡骨架的潜在价值,并将其加工为鸡骨抽提物浓缩物、骨素、骨粉及肉味香精等高附加值产品,这些产品不仅丰富了食品市场的多样性,也提升了鸡骨架的经济价值,市场接受度持续提升[3]。
食品热压技术是肉品领域的常用加工方法,通过控制温度(80~250 ℃)与压力(0.1~10 MPa),对食品原料进行物理-化学协同改性的加工方法,相对于普通加热方式,鸡骨架在120 ℃(0.1 MPa)的热压条件下能够产生更多的蛋白质、硫酸软骨素、多肽、游离氨基酸及其他营养物质。这种热压加工技术不仅提高了鸡骨架的营养价值,还有助于释放其内在的风味物质[4-5]。滋味是指水溶性呈味物质作用于口腔味蕾受体引发的基础化学味觉,包含甜、咸、酸、苦、鲜五类基本感受,热压后的鸡骨架味道鲜美,其中的鲜味主要由鲜味氨基酸和核苷酸提供。谷氨酸、天冬氨酸是食品中主要的鲜味氨基酸;5′-腺苷酸(adenylic acid,AMP)、5′-肌苷酸(inosine monophosphate,IMP)和5′-鸟苷酸(guanylic acid,GMP)属于核苷酸,都对鲜味起重要作用,与游离氨基酸结合会使鲜味得到大幅增强[6],味道强度值(taste activity value,TAV)和味精当量浓度(equivalent umami concentration,EUC)是食品研究中用于判定单一物质对整个滋味的贡献作用和衡量鲜味强度的重要指标。TAV表示单一呈味物质的浓度与其味觉阈值的比值,用于判断该物质对整体风味的实际贡献,EUC通过量化鲜味物质(如谷氨酸、核苷酸等)的协同作用,将复杂体系中的鲜味强度转化为等效的谷氨酸钠(monosodium glutamate,MSG)浓度,便于直观比较不同食品的鲜味水平,目前已用于多种食品的味道研究[7]。
核磁共振氢谱(proton nuclear magnetic resonance spectroscopy,1H NMR)技术基于原子核在磁场中的自旋能级跃迁原理,解析物质的化学组成与分子结构。该技术无需色谱分离即可实现对复杂生物样本的全面化学表征,以前处理简便、样品无损的方式,高通量获取完整的小分子代谢物结构信息,已成为食品组学与代谢分析研究的有效工具[8]。姚静玉等[9]利用NMR测定出小龙虾的33种滋味物质,表明谷氨酸、精氨酸、组氨酸、丙氨酸、赖氨酸和甘氨酸以及琥珀酸、乳酸、AMP、IMP是小龙虾的主要鲜味活性滋味物质。此外,NMR技术也成功应用于中国武定鸡的肌肉代谢特征解析[10]、鸡肉代谢的影响研究[11]和鸭肉代谢物组成的表征[12]。
本研究聚焦于滋味物质分析方法,对热压加工后的鸡骨架滋味物质进行了定性定量分析,并结合TAV与EUC,科学论证热压加工后鸡骨架的滋味价值,为工业化生产中鸡骨架高值化利用提供理论依据,也为鸡骨架的相关产品开发奠定基础。
鸡骨架,广西南宁北湖农贸市场。
氘代水(99.9%,D2O)、甲醇、3-(三甲基硅基)丙磺酸钠盐[3-(trimethylsilyl)-1-propane sulfonic acid silane,DSS,97%质量分数],上海麦克林生化科技有限;乙二胺四乙酸(EDTA),北京索莱生物科技有限公司;0.45 μm水系过滤器和16 cm ×16 cm、30 mm透气封口膜,北京兰杰柯科技有限公司。
AVANCEIII500MHz核磁共振仪,德国Bruker公司;JY98-IIN一体式超声波细胞粉碎机,宁波新芝生物科技股份有限公司;Alphal-4 LD Plus冷冻干燥机,德国Martin Christ公司;CenLee18R高速冷冻离心机,天美科学仪器有限公司;R-201D旋转蒸发器,上海一科仪器有限公司;DSX-280B高压灭菌锅,上海申安器械厂;GE001Min迷你漩涡混匀仪,武汉君诺德生物技术有限公司;MJ-LZ25Easy121搅拌机,广东美的电器制造有限公司。
1.3.1 样品制备
将鸡骨架清洗干净,除去鸡皮与鸡脖,使用粉碎机对鸡骨架进行粉碎以减少实验误差,粉碎时间为1 min。样品一式3份,皆取至同一批鸡骨架,接着将鸡骨架装入玻璃瓶,盖上透气封口膜于高压灭菌锅中蒸煮30 min,参考SHEN等[5]的方法并稍作修改,将高压灭菌锅的温度设置为120 ℃、压力设置为0.1 MPa。
1.3.2 1H NMR分析
代谢物提取与分析方法参考姚静玉等[9] 的方法,并稍作修改。取1.00 g备用样品,加入9 mL甲醇水(V甲醇∶V水=2∶1)溶液萃取,混匀后在装满碎冰的玻璃杯中不连续超声12 min(超声2 s间歇2 s,80 W),然后在5 ℃、9 500 r/min离心9 min,重复以上步骤提取2次。合并所得澄清液,在37 ℃下使用旋转蒸发仪真空除去甲醇,将所得旋蒸液移入5 mL离心管中进行冻干。然后将冻干粉溶解在200 μL浓度为14 mmol/L的EDTA缓冲液和400 μL D2 O中,涡旋3 min,在4 ℃、9 500 r/min离心10 min,取澄清液并转移至5 mm核磁管中进行NMR分析。使用NMR仪对样品进行测定得到1 H NMR谱图。1 H NMR测定条件:载波频率500 Hz,弛豫时间2.3 s,采集次数128次,扫描总时间12.08 s。同时通过预饱和抑制水峰信号。核磁共振光谱的处理和标峰使用MestReNova(12.0.0,Spain)软件完成。定性依据化合物的化学位移及多重峰进行判断。定量时先使用peak工具对内标物质进行积分,并把内标物质积分定为1,再对其他峰进行逐一积分。同时采用全局光谱去卷积法计算峰值,利用信号面积与样品中存在的质子数成正比的原理,即通过单个信号峰积分与内标信号积分比较计算代谢物的量[13]。鸡骨架的活性化合物的计算如公式(1)所示,具体化学位移、基团和多重性见表1。
表1 鸡骨架提取物中代谢产物的1 H NMR数据分析
Table 1 1 H NMR data analysis of metabolites in chicken skeleton extract
注:多重性:s.单峰;d.双峰;t.三重峰;q.四重峰;dd.双二重峰;dt.双三重峰;m.多重峰。右上角标∗的为选择的定量峰。
式中:m,物质的质量,g;I,特征峰积分面积;N,质子数;M,物质的摩尔质量,mol;i:待测物质;S:内标物质DSS。
1.3.3 TAV计算
TAV经常被用来量化单个滋味化合物对食品整体滋味的贡献程度,其贡献大小与TAV成正比。因此,TAV提供了一个相对客观的标准,用于评估食品中的味觉活性成分的重要性。鸡骨架的TAV为其在样品中测定的含量与其在水中或简单基质中测量的阈值之间的比率,计算如公式(2)所示:
当TAV >1时,认为该化合物对鸡骨架的滋味贡献率较大;当TAV <1时,则认为该化合物对鸡骨架的滋味贡献率较小。
1.3.4 EUC计算
当谷氨酸钠盐Glu(MSG)和IMP或GMP等核苷酸混合后,通常鲜味显著高于单一氨基酸或核苷酸,可增强数倍以上[21]。这种协同关系指标可用EUC表示,计算如公式(3)所示[9]:
式中:EUC,混合物的味精当量浓度值,g MSG/100 g;hi,鲜味氨基酸(Glu或Asp)含量,g/100 g;hj,每种鲜味5′-核苷酸(AMP、IMP、GMP)含量,g/100 g;ni,每个鲜味氨基酸与MSG相比的相对鲜味当量浓度(例如,Glu:1和Asp:0.077);nj,每个鲜味5′-核苷酸相对于IMP的相对鲜味当量浓度(例如IMP:1、GMP:2.3和AMP:0.18);1 218,协同作用常数。
利用SPSS 27.0软件对数据进行分析和处理。
如图1所示,化学位移截取为去除残留水及其溶剂的片段(ppm 0.8~ 4.5和ppm 5.1~ 8.8)。
图1 鸡骨架提取物中化合物的1 H NMR谱图
Fig.1 1 H NMR spectrum of chicken skeleton extract
a-0.8~4.5 ppm 1 H NMR谱图;b-5.1~8.8 ppm 1 H NMR谱图
1H NMR定性参考文献[9-12,14-17,19-20,22] 报道并与数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)进行比对。根据鸡骨架1 H NMR共鉴定出46种代谢物,主要包括22种游离氨基酸、8种有机酸、5种核苷酸及其衍生物、3种糖类及糖衍生物(α-葡萄糖、β-葡萄糖、肌醇),3种多肽(肌肽、鹅肌肽和谷胱甘肽),3种季铵盐类(甜菜碱、胆碱、O-磷酸胆碱),以及烟酰胺和肌酸。
游离氨基酸是肉制品中重要的呈味水溶性化合物,鸡骨架中含有丰富的游离氨基酸,是重要的味道贡献者。每种氨基酸都在不同程度上影响食物的味道,氨基酸的不同构成也是各种物质滋味差异的原因之一,当氨基酸与多肽、核苷酸、无机盐类等化合物共存时,它们之间的协同效应会显著提高食物的滋味强度[9]。根据DSS内标信号峰面积的已知浓度来分析计算出鸡骨架中22种游离氨基酸含量(表2)。鸡骨架中的总游离氨基酸含量为5.604 mg/g,其中含量较高的7种游离氨基酸分别是谷氨酸(0.744 mg/g)、组氨酸(0.569 mg/g)、苏氨酸(0.479 mg/g)、脯氨酸(0.394 mg/g)、蛋氨酸(0.317 mg/g)、牛磺酸(0.764 mg/g)和丙氨酸(0.747 mg/g),它们约占总游离氨基酸的70%。而呈苦味的色氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸在鸡骨架中含量较低,仅占鸡骨架游离氨基酸总量的4%。
表2 鸡骨架中游离氨基酸的含量、味道特征、味道阈值及TAV
Table 2 Free amino acid composition,taste characteristics,taste thresholds and TAV in chicken skeleton
注: +:味道愉悦;-:味道不好;nd.:未见报道或无法计算(下同);γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)。
由表2可知,其氨基酸组成与侯钰柯等[25]测得的结果基本一致。经热压处理的鸡骨架总游离氨基酸含量比酶解处理高出1.8 mg/g,鲜味氨基酸含量更是达到后者的2倍以上[26],这表明热压是一种高效便捷的鸡骨架加工方法。鸡骨架中氨基酸类呈味物质的含量及其呈味阈值共同决定了其风味强度。有些物质在生物组织中含量很低,但由于其阈值较低而对鸡骨架的滋味影响显著,如GABA的TAV为25.5它是鸡骨架中TAV最大的呈味物质,这与赵文华等[27]测得的结果一致。GABA是一种四碳非蛋白质氨基酸,在脊椎动物、植物和微生物中普遍存在,作为味蕾中的抑制性神经递质,由于其神经递质活性,可抑制鸡骨架中的的苦味[28],其在感知鲜味方面也具有一定的调节活性[29]。此外,Tau是一种微酸性的含硫氨基酸,可通过调节GABA能系统,减弱人们对苦味的感知[28],因此,虽然Tau对鸡骨架的味道没有重大贡献,但其和GABA协同可降低人们对鸡骨架样品苦味的味觉感知[11]。
His、Glu、Ala和Met的TAV分别为2.8、2.5、1.2、1.1,说明它们是鸡骨架的重要滋味贡献物质,这与侯钰柯等[25]测得结果一致。鸡骨架中的氨基酸含量基本低于鸡胸肉的氨基酸含量[11,30]。其中Glu比鸡胸肉(0.9 mg/g)低0.16 mg/g[11],Glu是一种典型的鲜味氨基酸,不仅是影响肉味的主要活性成分之一[28],也对聊城熏鸡、藤桥熏鸡[31]和茶花鸡[27]的滋味具有重大贡献。His仅为鸡胸肉(6 mg/g)的10%[11],其是鸡骨架滋味中的主要苦味物质,但它的苦味可以被盐和糖等成分抑制[28]。Ala和Met也是鸡骨架的重要滋味贡献者,Ala呈甜味,是鸡骨架中游离氨基酸中唯一对滋味具有重大贡献的甜味氨基酸,它的含量跟鸡胸肉(0.73 mg/g)的含量基本一致[11]。Met是一种含硫的特殊氨基酸,具有甜味和苦味的特征,其含量比鸡胸肉的(0.132 mg/g)高0.18 mg/g[30],其TAV大于1,是鸡骨架的重要滋味贡献者。Met可以通过转硫化途径转化为半胱氨酸(Cys),其是食品风味的增强剂,对肉味有重要贡献的呋喃硫醇也可由Cys生成[30]。
综上所述,GABA、His、Glu、Ala和Met 5种氨基酸是鸡骨架的主要滋味贡献者。其他的游离氨基酸由于含量低于相应的呈味阈值,因此对鸡骨架的滋味没有直接影响,但鸡骨架的鲜美风味并非源自单一氨基酸的作用,其核心机制在于鲜味、甜味与苦味氨基酸等多类游离氨基酸的协同平衡。
由表3可知,鸡骨架中含量最高的呈味核苷酸是IMP,其含量为0.609 mg/g;然后是GMP和AMP,分别为0.037 mg/g和0.049 mg/g;而CMP含量最低,仅为0.012 mg/g。IMP、GMP和AMP对应的TAV分别为2.4、0.3、0.1,由此可得出以下结论:IMP是鸡骨架中重要的鲜味物质,而AMP和GMP对鸡骨架的鲜味没有重大贡献。
表3 鸡骨架中核苷酸的含量、味道特征、味道阈值及TAV
Table 3 Contents,taste attributes,detection thresholds,and TAV of nucleotides in chicken skeleton
IMP不仅是鸡骨架中鲜味物质的主要贡献者,同时作为高效的鲜味增强剂,其鲜味强度显著高于普通味精[33]。鸡骨架的IMP含量比鸡胸肉(0.837 mg/g)的含量低0.23 mg/g,但比鸡腿肉(0.446 mg/g)的含量高0.16 mg/g[30],IMP是屠宰后腺苷-5′-三磷酸(adenosine 5′-triphosphate,ATP) 的降解产物之一。在中国土鸡中,如绿阳黑骨土鸡、武鼎鸡及盐津丝丝羽鸡的胸肌组织中均检测出高含量的IMP[14],Ala和Ser能够有效触发人类T1R1受体的活性,当与IMP共同作用时,二者会呈现协同增强效应,进而显著增强整体鲜味强度[21];鸡骨架的 GMP比鸡胸肉(0.168 mg/g)和鸡腿肉(0.173 mg/g)低0.1 mg[30]。GMP和IMP组合而成的食品鲜味剂广泛在工业中使用;AMP在鸡骨架中的含量和在鸡胸肉(0.045 mg/g)和鸡腿肉(0.033 mg/g)的含量基本相似[30],值得注意的是,AMP在样品中呈现的风味特性与浓度直接相关:当AMP质量浓度小于100 mg/100 mL,AMP仅能赋予甜味感知而无法产生鲜味特征。相反如果AMP高于此质量浓度,就会赋予鲜味特征[23],它也是一种有效的苦味抑制剂;CMP是Glu味觉的负向调节剂或抑制剂,使谷氨酸检测阈值升高,对谷氨酸味道起抑制作用,可能是源于口腔中T1R1/T1R3谷氨酸受体的正负变构调节机制[34]。这些呈味核苷酸不仅自身具有鲜味,还能与MSG、游离氨基酸及无机盐离子等产生协同效应,显著增强体系中的鲜味强度[21]。肌苷又名次黄嘌呤核苷,呈苦味,在鸡骨架中的含量为0.564 mg/g,但由于其阈值较高,TAV仅为0.3,所以对鸡骨架的滋味贡献较弱。
5′-核苷酸与鲜味游离氨基酸(如Glu或Asp)的协同效应对肉制品风味具有显著增强作用,其强度可通过EUC量化表征,该指标现已成为食品鲜味研究中的常用分析工具[9,23]
如表4所示,计算得出鸡骨架的EUC值为6.65 g/100 g,根据结果,可以说明100 g湿重鸡骨架的等效鲜味浓度跟6.65 g MSG相当,该数据表明鸡骨架具有显著的鲜味优势,MSG的阈值为0.03 g/100 mL[9],因此鸡骨架的味精当量TAV高达222,这就是鸡骨架滋味如此鲜美的原因。但与鸡肉相比,其鲜味有一定差异,其低于卓资山熏鸡(13 g MSG/100 g)[31],但比道口烧鸡(2 g MSG/100 g),德州扒鸡(4 g MSG/100 g)高[35]。
表4 鸡骨架中各个鲜味氨基酸和呈味核苷酸的数值
Table 4 Umami amino acids and flavor nucleotides in chicken skeleton
有机酸也是鸡骨架中的重要呈味物质之一,如琥珀酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸及富马酸等,它们主要呈现酸味,对鸡骨架的呈味特征有一定的影响。
由表5可以看出,鸡骨架有机酸中含量最高的是乳酸,为5.42 mg/g,TAV为4.3,这与WANG等[36]的研究结果一致,其次是苹果酸和柠檬酸,含量分别为1.465 mg/g、0.774 mg/g,TAV分别为2.9、1.6,因此乳酸、苹果酸和柠檬酸对鸡骨架滋味具有重要贡献。
表5 鸡骨架中有机酸的含量、味道特征、呈味阈值及TAV
Table 5 Organic acid composition,flavor characteristics,flavor thresholds and TAV in chicken skeleton
表6 鸡骨架中多肽及其他化合物的含量、味道特征、呈味阈值及TAV
Table 6 Peptide and other compound composition,flavor characteristics,flavor thresholds and TAV in chicken skeleton
乳酸是一种由宰后肌肉糖酵解后形成的有机酸[14],滋味清爽宜人。乳酸TAV高达4.3,不仅是鸡骨架中的主要有机酸,还是滋味的主要贡献者,在发酵食品和水产品滋味中也具有重大贡献[9]。苹果酸和柠檬酸也是鸡骨架滋味的重大贡献者,由于其阈值较低,所以TAV均大于1,在鸡骨架中含量较低也显著影响滋味。柠檬酸是三羧酸循环的第一个产物,由乙酰辅酶A和草酰乙酸缩合而成,在乳酸菌存在的情况下,柠檬酸可以通过三羧酸循环被部分还原成琥珀酸和生成苹果酸。特别注意的是,琥珀酸的TAV为0.9,虽然对鸡骨架的滋味没有乳酸那么强烈,但琥珀酸不仅能与鲜味氨基酸产生协同效应,更可通过与钠离子螯合形成琥珀酸钠,该化合物与谷氨酸钠具有相似的呈味特性。琥珀酸二钠是我国目前批准使用的唯一有机酸类鲜味剂,其与食盐、谷氨酸钠或柠檬酸等有机酸合用时,可使鲜味增强[6],其他有机酸(富马酸、乙酸和甲酸等)的TAV均小于1,因此对鸡骨架的滋味贡献较小。
多肽、甜菜碱、葡萄糖和一些其他化合物也是鸡骨架滋味的重要组成部分,其中谷胱甘肽的含量高达18.799 mg/g,TAV为75.2,是鸡骨架的重要滋味贡献者。此外,呈甜味的肌醇TAV大于1,也是鸡骨架甜味的主要贡献者,如葡萄糖、甜菜碱和胆碱等由于其含量小于阈值,故对鸡骨架的滋味影响较小。
谷胱甘肽、鹅肌肽和肌肽均属于多肽类物质,多肽在鸡骨架中的含量约为鸡胸肉的70%、是鸡腿中多肽含量的2倍[10],多肽是由氨基酸通过肽键连接而成的线性链状化合物,其中谷胱甘肽属于三肽,是半胱氨酸的—NH2 和谷氨酸未与α 碳原子相连的—COOH脱去一分子H2O形成酰胺键(肽键),—COOH与甘氨酸的—NH2以同样的方式脱水缩合,再由肽键将三种氨基酸连接起来[39],是存在于大多数动物组织中的三肽。由于其在鸡骨架中含量高而阈值低,因此对鸡骨架滋味具有显著贡献。在谷胱甘肽对食品风味的相关研究中发现,其不仅具有微弱的鲜甜味,也对食品风味具有增味特性,可提升谷氨酸钠的味道以及对无机盐具有一定的增味作用,同时对苦味也有一定抑制作用,并能够增强味觉的浓厚感。鹅肌肽和肌肽在鸡骨架中含量很高,分别为6.262 mg/g、3.053mg/g,但由于其阈值较高,故TAV小于1,所以对鸡骨架的滋味贡献较小。但在一些研究中发现,β-丙氨酸二肽(肌肽、鹅肌肽)是鸡肉汤中厚实酸感和白肉质特征的关键贡献者。尽管这些肽本身仅呈现微弱酸味和涩味,但在与谷氨酸及特定阳离子共存时,即使在低于其阈值的浓度下,也能协同诱发典型的厚实感和白色肉质特征[37]。
肌醇天然存在于玉米、坚果和豆类,当给鸡喂食玉米和大豆时,其肌肉和血清中均能检测到肌醇[14],在鸡骨架中的含量为3.610 mg/g,呈甜味,其TAV达到1.1,对鸡骨架的甜味具有显著贡献。
鸡骨架中葡萄糖的检测含量为0.22 mg/g,远低于其在水溶液中的呈味阈值(8.60 mg/g),故TAV低至0.027。尽管葡萄糖本身具有令人愉悦的甜味特性,但因其在鸡骨架中的低含量,不足以对整体滋味产生显著贡献。烟酰胺作为吡啶类化合物之一,在家禽肉中浓度较高,其参与细胞能量代谢并维持有效DNA修复。因其具有皮肤癌化学预防潜力且使用简便[12]。胆碱代谢的终产物包括甜菜碱和磷酸胆碱,含胆碱化合物是细胞膜代谢的关键组分。肉的嫩度受肌酸和甜菜碱的影响[10],肌酸在肌肉能量代谢中起重要,肌肉中肌酸含量的增加可能会延迟死后乳酸的形成并延缓pH值的下降,从而能提高持水能力[11],但其在鸡骨架中的TAV均小于1,因此对鸡骨架的滋味贡献较小。
基于1H NMR技术,鸡骨架中鉴定出46种代谢物。总游离氨基酸为5.604 mg/g,其中谷氨酸(0.744 mg/g)、组氨酸(0.569 mg/g)、牛磺酸(0.764 mg/g)等7种游离氨基酸占总游离氨基酸70%,而苦味氨基酸(色氨酸、亮氨酸和酪氨酸等)仅占4%。呈味核苷酸以IMP为核心(0.609 mg/g,TAV=2.4),显著贡献鲜味,而GMP(TAV=0.3)、AMP(TAV=0.1)作用微弱。有机酸中乳酸(5.4 mg/g,TAV=4.3)、苹果酸(1.5 mg/g,TAV=2.9)和柠檬酸(0.8 mg/g,TAV=1.6)协同主导酸味。谷胱甘肽(18.8 mg/g,TAV=75.2)为最强滋味增强剂。肌醇(TAV >1)提供甜味支撑。葡萄糖、甜菜碱和胆碱等因TAV小于1,对滋味的贡献可忽略。鸡骨架的EUC为6.65 g MSG/100 g,其TAV高达222。鲜味主要源自IMP、Glu和Asp等物质的协同作用,共同赋予鸡骨架鲜美的滋味。
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Using proton nuclear magnetic resonance spectroscopy to detect the taste active substances in chicken skeleton