贺兰山东麓产区因其独特的地理位置和气候环境,非常适宜优质酿酒葡萄的生产,产区葡萄酒在国内外也久负盛名[1-3]。马瑟兰是近年来贺兰山东麓产区广泛推广的新兴品种,因其抗逆性强、果香浓郁且成酒风格优雅的特点[4-6],在产区内的种植规模不断扩大,已成为特色品种之一。然而,贺兰山东麓地域广阔,不同子产区的光热条件、土壤理化性质存在显著差异[7-8],这些微气候与土壤异质性可能通过影响葡萄光合作用效率、水分利用策略及次生代谢途径,导致马瑟兰果实糖酸组成、酚类物质积累等关键品质指标呈现空间分异,进而塑造葡萄酒的典型风格特征,最终影响葡萄酒产品的市场竞争力[9]。
研究表明,不同子产区酿酒葡萄果实品质呈现显著地域特征。如青铜峡子产区因砾石土壤的强排水性及较高积温,果实可溶性固形物含量可达24.5%,较永宁子产区高1.8%,同时苹果酸降解速率加快,形成高糖低酸的代谢特征[10]。花色苷合成则表现出更复杂的区域响应,已有研究表明红寺堡子产区因紫外线辐射强度较银川高15%,其马瑟兰葡萄果实中锦葵色素-3-O-葡萄糖苷含量显著高于其他子产区[11]。酿酒葡萄的风味物质构成受栽培模式、地域气候等因素的影响也有较大差异。目前,针对贺兰山东麓产区不同子产区马瑟兰葡萄果实品质的系统研究较少,本研究以贺兰山东麓典型子产区的马瑟兰葡萄为对象,测定不同子产区果实的基本理化指标(可溶性固形物、pH等),采用超高效液相色谱串联三重四极杆质谱联用技术(ultra-performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole tandem mass spectrometer,UPLC-QqQ-MS/MS)、顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用技术(solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,SPME-GC-MS)[12-13]分析葡萄果实中有机酸、花色苷和挥发性风味物质组成和含量,明确不同子产区马瑟兰葡萄果实品质的差异性,以期为该品种的区域化栽培优化、特色葡萄酒产品开发及产区科学规划提供一定理论依据[14]。
1.1.1 材料
马瑟兰葡萄样品:于葡萄果实生长至最佳采收期时,在各采样点采用‘S’取样法选取生长较一致的葡萄植株,每株葡萄的上、中、下部分别采集成熟、无病害的果实,共采集30穗果实、采样地点分别位于宁夏贺兰山东麓产区的银川、贺兰、永宁、青铜峡4个子产区,每个产区各采集4个样品,共采集16个样品,具体见表1。
表1 样品采集信息表
Table 1 Sample collection information table
1.1.2 试剂
甲醇、乙醇、乙酸乙酯均为色谱纯,美国默克公司;甲酸,质谱纯,美国Fisher公司;莽草酸、奎宁酸、琥珀酸、丙二酸、富马酸、丙酮酸、乳酸、草酸、柠檬酸、抗坏血酸、苹果酸、酒石酸等12种有机酸标准品,纯度均>90%,广州佳途科技股份有限公司;矮牵牛色素、飞燕草色素、芍药素、天竺葵素、锦葵色素、矢车菊素、矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草色素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矮牵牛素-3,5-O-双葡萄糖苷、飞燕草素-3,5-O-双葡萄糖苷、芍药素-3,5-O-双葡萄糖苷、天竺葵素-3,5-O-双葡萄糖苷、锦葵色素-双葡萄糖苷、矢车菊素-3,5-O-双葡萄糖苷等18种花色苷标准品,纯度均大于95%,上海源叶生物有限公司;4-甲基-1戊醇,上海阿拉丁有限公司;氯化钠,国药集团化学试剂有限公司。
TSQ-ALTIS超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪(配备电喷雾离子源),美国Thermo公司;Milli-Q/Gradient超纯水系统,美国Millipore公司;ATAGO PAL-1便携式糖度计,日本爱拓公司;AL204电子天平,梅特勒-托利多有限公司;pH计,上海仪电科学仪器股份有限公司;R215旋转蒸发仪,瑞士步琦有限公司;涡旋混匀器,美国艾卡公司;GCMS-TQ8050 NX三重四极杆气相色谱质谱联用仪,日本岛津公司;DVB/CAR/PDMS三合一SPME萃取头,美国色谱科公司。
1.3.1 常规理化指标检测
随机选取100粒果实称量,计算百粒重,随后将葡萄果实破碎,使用100目纱布过滤并收集果汁,采用便携式糖度计测定可溶性固形物含量,采用斐林试剂滴定法测定还原糖含量(以葡萄糖计),采用NaOH滴定法测定用总酸含量(以酒石酸计);用pH计测定葡萄果实pH值。
1.3.2 有机酸检测
称取2.00 g葡萄样品于50 mL离心管中,加入20.0 mL水,1 500 r/min涡旋提取1 min,4 000 r/min离心5 min,过0.45 μm水相滤膜,采用液相色谱-质谱联用仪检测。
液相色谱条件:迪马Spursil C18 150 mm×2.1 mm×3 μm色谱柱;柱温:30 ℃;流速:0.4 mL/min;流动相A:V(甲酸)∶V(水)=0.1∶100,流动相B:乙腈;梯度洗脱程序:0~14 min,95%~70% A;14~15 min,70% A;15~16 min,70%~90% A;16~18 min,90% A;18~19 min,90%~95%A;19~20 min,95% A;进样体积:2.0 μL。
质谱条件:离子源类型:电喷雾电离源(electrospray ionization,ESI);扫描模式:负离子模式,选择反应离子监测(select reactive ion monitoring,SRM),喷雾电压2 500 V;鞘气35 Arb;辅气10 Arb;离子传输管温度:300 ℃;雾化温度:350 ℃;使用根据标准品优化的自建质谱库离子信息进行定性,外标法定量。
1.3.3 花色苷检测
参考唐柯等[15]方法修改,准确称取0.05 g葡萄皮冻干粉,加入10 mL 2%甲酸甲醇溶液[V(甲酸)∶V(甲醇)=2∶98]超声提取10 min,涡旋振荡20 min,随后4 000 r/min离心15 min,收集上清液至250 mL圆底烧瓶。按上述步骤重复提取3次,合并上清液并旋蒸至干(120 r/min、25 ℃)。流动相A:V(甲酸)∶V(水)=0.1∶100,流动相B:V(甲酸)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=0.1∶50∶50,用溶剂[V(A相)∶V(B相)=9∶1]定容至10 mL,用0.22 μm滤膜过滤后测定。
液相色谱条件:安捷伦Poroshell 120 EC-C18(150 mm ×4.6 mm ×2.7 μm)色谱柱;柱温:40 ℃;流速:0.3 mL/min;流动相A:V(甲酸)∶V(水)=0.1∶100,流动相B:V(甲酸)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=0.1∶50∶50;梯度洗脱程序:0~17 min,10%~50% B;17~18 min,50%~10% B;18~20 min,10% B。进样体积:2.0 μL。
质谱条件:离子源类型:ESI离子源;扫描模式:正离子模式,SRM,喷雾电压4 000 V;鞘气35 Arb;辅气10 Arb;离子传输管温度:300 ℃;雾化温度:350 ℃;使用根据标准品优化的自建质谱库离子信息进行定性,外标法定量。
1.3.4 挥发性风味物质检测
参考YI等[16]方法修改,准确称取5.0 g葡萄样品,加入1.5 g氯化钠,添加40 μL的内标物4-甲基-1-戊醇(4-methyl-1-pentanol,4M1P,394.1 μg/L),混匀到20 mL样品瓶中密封后使用气相色谱质谱联用仪检测。
HS-SPME条件:固相微萃取头250 ℃老化1 h,以250 r/min 40 ℃恒温顶空吸附30 min后,将萃取头插入GC-MS进样口,250 ℃解析8 min。
GC-MS分析色谱条件:DB-WAX毛细管柱(60 m ×0.25 mm ×0.25 μm)。升温程序为:40 ℃保持5 min,以3 ℃/min升至120 ℃,再以8 ℃/min升至230 ℃,保持10 min;载气(He)流速0.8 mL/min,不分流。轰击离子源;电子能量70 eV;传输线温度275 ℃;离子源温度230 ℃;激活电压1.5 V;灯丝流量0.25 mA;质量扫描范围m/z 40~500。
本试验中各样品均重复3次,使用SPSS 26.0软件对全部数据进行方差分析,使用Origin 2021、Excel、Tbtools软件绘图,使用Simca 14.1进行正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)多元统计分析,香气物质通过NIST 2020谱库检索定性,以4M1P为内标物进行半定量分析。
对贺兰、青铜峡、银川和永宁产区马瑟兰葡萄果实的百粒重以及还原糖、可溶性固形物、总酸含量和pH值进行检测分析,结果见表2。贺兰产区葡萄果实的百粒重最大(95.7 g),显著高于银川(89.6 g)和永宁(91.4 g)产区。青铜峡产区(93.5 g)与贺兰、银川、永宁均无显著差异;永宁产区的葡萄果实中还原糖含量最高(176.94 g/kg),显著高于银川产区(150.01 g/kg),其余产区则无显著差异;贺兰产区的可溶性固形物含量最高(26.79 °Brix),显著高于青铜峡(23.54 °Brix)和银川(23.21 °Brix)产区,而永宁产区(25.33 °Brix)与贺兰、青铜峡、银川均无显著差异;总酸与酿酒葡萄的品种特性、成熟度、种植环境密切相关[17],分析结果显示银川产区的总酸含量达3.82 g/kg,显著高于永宁产区。贺兰(3.48 g/kg)和青铜峡(3.50 g/kg)的总酸含量介于两者之间,与银川和永宁均无显著差异;果实pH值在4个产区间无显著差异,贺兰山东麓产区总体呈现酸度较低的特点,这也与WEI等[18]的研究结果一致。
表2 不同子产区马瑟兰葡萄果实基本理化指标(n=4)
Table 2 Basic physicochemical parameters of Marselan grape berries among different sub-producing areas (n=4)
注:表中同一列不同小写字母表示产区间差异显著(P <0.05)(下同)。
总体而言,在贺兰山东麓产区相似的风土环境下,各子产区的马瑟兰葡萄在百粒重、还原糖、可溶性固形物和总酸含量等关键理化指标上呈现显著差异。贺兰(大果粒、高固形物)和永宁(高糖、低酸)在特定指标上表现更优,银川产区的葡萄因酸度较高,可能更适于酿造需要较高酸度的特定风格葡萄酒。
酿酒葡萄有机酸的组成和含量能够显著影响葡萄酒的风味、颜色、香气和稳定性[19],同时在平衡甜味、抑制杂菌、影响风味复杂度以及赋予陈年潜力等方面具有重要作用[20]。在不同子产区的马瑟兰葡萄果实中共检测到7种有机酸,如表3所示,苹果酸和酒石酸是酿酒葡萄的主要有机酸成分[21],也是葡萄酒酸味和涩味的主要呈味物质,主要来自于葡萄果肉。酒石酸、苹果酸含量分别为8.17~9.52、2.68~3.09 g/kg,二者含量之和占有机酸总量分别的93.8%以上;柠檬酸和丙酮酸含量次之,含量分别为0.48~0.53、0.10~0.18 g/kg;奎宁酸、莽草酸和琥珀酸含量均低于0.1 g/kg。琥珀酸、莽草酸、柠檬酸和苹果酸在产区间无显著差异;丙酮酸含量在银川产区达到最高值,显著高于青铜峡产区;奎宁酸含量在贺兰和永宁产区无显著差异,但均显著高于青铜峡产区;酒石酸含量在贺兰、银川和永宁产区间无显著差异,但均高于青铜峡产区。整体而言,有机酸含量在产区间差异较小。
表3 不同子产区马瑟兰葡萄果实有机酸种类及含量(n=4) 单位:g/kg
Table 3 Types and contents of organic acids in Marselan grape berries among different sub-producing areas (n=4)
聚类热图分析结果见图1,7种有机酸主要被分为两类,琥珀酸、丙酮酸、苹果酸为一类,莽草酸、酒石酸、奎宁酸和柠檬酸为一类。各子产区有机酸构成方面,可分为两类,贺兰和永宁产区被聚为一类,青铜峡和银川产区被聚为一类。
图1 不同子产区马瑟兰葡萄果实有机酸聚类热图
Fig.1 Clustered heatmap of organic acid composition in Marselan grape berries from different sub-producing areas
花色苷主要存在于葡萄皮中,与酿酒葡萄和葡萄酒的色泽密切相关,其含量主要受葡萄的遗传特性、环境因素和栽培条件影响[22-23]。如表4所示,贺兰山东麓产区马瑟兰葡萄果实中共检出13种花色苷类物质,锦葵色素-3-O-葡萄糖苷的含量最高,为88.25~ 120.24 mg/kg,是酿酒葡萄的主体花色苷[24]。其次是矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷和飞燕草素-3-O-葡萄糖苷,含量为10~23 mg/kg,芍药素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和锦葵色素的含量为1~10 mg/kg,其他花色苷含量均低于1 mg/kg。
表4 不同子产区马瑟兰葡萄果实花色苷种类及含量(n=4)
Table 4 Types and contents of anthocyanins in Marselan grape berries from different sub-producing areas (n=4)
对4个产区中13种花色苷类物质进行差异性分析,结果显示,矢车菊色素、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、锦葵色素-3,5-O-双葡萄糖苷在4个产区间无显著差异,矮牵牛色素、矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷在贺兰和永宁产区间无显著差异,但显著高于银川产区;银川产区的锦葵色素、飞燕草色素显著低于其他产区;青铜峡产区的芍药色素显著高于其他产区;飞燕草素-3-O-葡萄糖苷在贺兰和青铜峡产区间无显著差异,但均与银川和永宁产区间具有显著差异,且分别在永宁和银川达到最高值和最低值;贺兰和永宁产区的锦葵色素-3-O-葡萄糖苷显著高于青铜峡和银川产区;贺兰产区的芍药素-3-O-葡萄糖苷显著低于其他产区;贺兰产区的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷显著低于青铜峡和银川产区;银川产区的飞燕草素-3,5-O-双葡萄糖苷显著低于贺兰和永宁产区。除银川产区外,整体含量呈锦葵色素-3-O-葡萄糖苷>飞燕草素-3-O-葡萄糖苷>矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷>芍药素-3-O-葡萄糖苷>矢车菊素-3-O-葡萄糖苷>天竺葵素-3-O-葡萄糖苷的趋势。飞燕草素-3,5-O-双葡萄糖苷、锦葵色素-3,5-O-双葡萄糖苷是马瑟兰葡萄果实中检出的2种双葡萄糖苷类花色苷,但总体含量较低,产区间差异也较小。
聚类热图分析结果见图2,13种花色苷主要被分为两类,芍药色素、芍药素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊色素、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为一类,其余花色苷为一类。根据各子产区花色苷含量,贺兰、永宁产区被聚为一类,青铜峡和银川产区被聚为一类,这与有机酸的聚类分析结果一致。
图2 不同子产区马瑟兰葡萄果实花色苷聚类热图
Fig.2 Clustering heatmap of anthocyanins in Marselan grape berries from different sub-producing areas
2.4.1 挥发性香气物质种类和含量分析
挥发性香气物质是酿酒葡萄品质的重要指标,也是决定最终葡萄酒产品风味的重要因素[16]。如图3及电子版增强出版附表1 (https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.043744)所示,贺兰山东麓4个子产区马瑟兰葡萄果实中共鉴定出95种香气物质,其中醇类物质33种、酯类36种、酸类7种、醛类5种、酮类7种、萜烯类3种、烷烃类4种。贺兰、青铜峡、银川、永宁各产区马瑟兰葡萄中风味物质分别为49、54、58、58种,各子产区马瑟兰葡萄中挥发性风味物质以醇类为主,数量为18~23种,乙酸酯其次,数量为9~10种,其他类别风味物质数量有较大差异,主要体现在乙基酯方面,检出数量为:银川(9种) >永宁(7种) >青铜峡(5种) >贺兰(2种),其中癸酸乙酯、己酸乙酯是4个子产区马瑟兰葡萄的共有乙基酯类风味物质。各产区的共有挥发性风味物质有27种,如图4所示,在挥发性风味物质含量方面,现有样本中银川产区马瑟兰葡萄挥发性香气物质总含量最高(47 386.15 μg/L),以贺兰产区最低(6 870.21 μg/L),两者相差达6.90倍,4个产区的香气物质检出量差异显著。其中醇类(26 953.61 μg/L)、乙基酯类(710.42 μg/L)、乙酸酯类(15 163.83 μg/L)和酸类(2 871.40 μg/L)物质均以银川产区最高,且均与其他产区有显著差异;贺兰产区醇类、酮类、脂类物质均显著低于其他3个产区。具体来看,银川产区马瑟兰葡萄果实醇类化合物中苯乙醇、异戊醇检出量显著高于其他3个产区,苯乙醇含量达8 840.56 μg/L,赋予了葡萄果实清新的玫瑰花香[14],异戊醇含量为8 619.95 μg/L,但其风味特征为杂醇气味和辛辣味,对果实风味有负面影响[25]。
图3 不同子产区马瑟兰葡萄果实挥发性风味物质数量
Fig.3 The number of volatile flavor compounds in in Marselan grape berries among different sub-producing areas
a-挥发性风味物质数量及种类;b-共有挥发性风味物质Upset图
图4 不同子产区马瑟兰葡萄果实各类风味物质含量
Fig.4 Content of flavor compounds in Marselan grape berries among different sub-producing areas
2.4.2 共有挥发性香气物质聚类分析
如图5所示,各产区共有挥发性香气物质聚类热图分析结果反映了各产区醇类、其他酯类、醛类、酸类、酮类、乙基酯类、乙酸酯类风味物质的分布特征及产区间差异。聚类结果表明,四产区被分为2组,银川与永宁产区为一组,青铜峡与贺兰产区为一组。银川产区马瑟兰葡萄中苯乙醇、乙酸异戊酯、正己醇等关键物质含量显著高于其他产区,可能主导其果香与酯类风味的独特性,尽管永宁产区多数风味物质如乙酸苯乙酯、3-羟基-2-丁酮的含量中等,但其与酯类分布模式与银川产区相似,故最终被聚为一类;青铜峡产区马瑟兰葡萄异戊醇、乙酸异戊酯含量较高,但整体数值低于银川和永宁,但乙酸乙酯含量远超其他产区。贺兰产区多数风味物质含量均为最低,但苯乙醇、正己醇、乙酸己酯含量与青铜峡产区接近,因而形成另一聚类。此外,各产区2-壬酮、苯甲醇等物质的差异较小,且正己醇含量均较高,赋予了马瑟兰葡萄青草香气[26]。
图5 不同子产区马瑟兰葡萄果实挥发性风味物质聚类热图
Fig.5 Clustering heatmap of common flavor compounds in Marselan grape from different sub-producing areas
2.4.3 共有挥发性香气物质OPLS-DA
采用OPLS-DA对不同子产区马瑟兰葡萄果实27种共有挥发性风味物质进行分析。结果如图6-a所示,不同子产区马瑟兰葡萄中挥发性成分的聚类距离较小,表明样品重复序列的稳定性较好。不同产区均能实现有效分离,其中贺兰、青铜峡产区样品均集中在第四象限,且彼此相对接近,说明贺兰产区马瑟兰葡萄的挥发性风味物质构成与青铜峡产区存在一定的相似性,可能受采样地微地形或栽培管理模式差异的影响[27]。图6-b显示了200次拟合计算的结果,经过200次的模型置换检验验证模型的拟合,模苷含量,可能更适宜酿造果香浓郁、色泽深厚的葡萄酒;贺兰产区的高可溶性固形物与银川产区的高总酸特征,为调控葡萄酒的糖酸平衡提供了原料基础。有型的R2值为0.995,Q2 值为0.992,表明拟合效果良好。此外,VIP值可以直观地反映挥发性组分之间的微分变量[28],不同挥发性组分的VIP值的计算结果如图6-c所示。VIP >1的挥发性风味物质分别为丙酸异戊酯、2-壬酮、乙酸戊酯、(Z)-2-己烯-1-醇和2-壬基醇,这些成分含量的差异可作为不同子产区马瑟兰葡萄的重要区分因素。
图6 不同子产区马瑟兰葡萄果实共有挥发性风味物质OPLS-DA
Fig.6 OPLS-DA of common flavor compounds in grape fruits of Marselan grape among different sub-producing areas
a-OPLS-DA得分图;b-200次置换试验检验结果;c-不同挥发性组分的变量投影重要性(variable importance in projection,VIP)值
贺兰山东麓不同子产区的风土差异显著影响了马瑟兰葡萄的果实品质,永宁产区因高还原糖和花色机酸组成中,酒石酸和苹果酸是马瑟兰葡萄的核心有机酸,青铜峡产区果实酒石酸、丙酮酸及奎宁酸含量显著低于其他子产区,因此酿造时需用特定工艺调整。锦葵色素-3-O-葡萄糖苷作为主体花色苷,其在贺兰、永宁子产区含量显著高于银川产区,银川产区多数花色苷含量相对偏低,后续酿造工艺中可通过原料调配或混合发酵等手段优化花色苷组成。挥发性风味物质的构成与产地密切相关,银川产区马瑟兰葡萄风味复杂度和浓郁度显著高于其他产区,较高含量的苯乙醇与酯类物质赋予其独特的玫瑰花香与果香,但异戊醇的高含量可能对风味产生负面影响。OPLS-DA结果表明,各子产区马瑟兰葡萄的共有挥发性风味物质具有明显差异,这些差异可能与采样地微气候、葡萄园土壤、栽培管理方式等因素有关。研究结果为贺兰山东麓马瑟兰葡萄的区域化种植规划、差异化酿酒工艺及产区品牌建设提供了科学依据,有助于提升葡萄酒的市场竞争力与风格辨识度。
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Analysis of fruit quality differences in Marselan grapes among sub-producing areas of eastern foot of Helan Mountain