茶是全球最受欢迎的饮料之一,根据茶叶的加工工艺和发酵程度,可分为黑茶、红茶、乌龙茶、黄茶、白茶和绿茶,其中红茶属于全发酵茶[1]。香气是评价茶叶品质的关键因素之一[2]。目前已从茶中鉴定出800多种挥发物[2],主要包括醇、醛、酮、酸、酯、萜烯等[3]。这些挥发性物质的组成和含量高低,赋予茶不同香型,如:甜香、花香和果香等[3]。
顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(headspace solid-phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)可对食品中的挥发性有机物进行定性和定量检测,是一种集萃取与分离检测于一体的分析方法,已广泛应用于食品分析领域[4]。LUO等[5]利用该技术研究了3个等级的山东抹茶,检测出199种挥发性成分。赵志强等[6]分析4个等级的双井绿茶研究,鉴定出70种香气物质。研究表明,不同产地、不同加工方式等均会影响茶叶的香气品质[7-8]。
宁红茶产自江西省九江市修水县,简称“宁红”[9],具有外形紧结,苗锋修长,色泽乌润,汤色红亮,甜香高长,滋味甜醇等品质特点[10]。目前,针对修水宁红茶挥发性物质的研究主要集中于品种和等级[11-12],而不同产区对修水宁红茶挥发性物质的影响尚未见报道。本研究选取修水县3个最大产区的宁红茶样品,采用HS-SPME-GC-MS对其香气组分进行检测,并利用主成分分析(principal component analysis,PCA) 与偏最小二乘判别分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)对数据进行化学计量学分析,探讨不同产区修水宁红茶的香气组成特征及产区对宁红茶香气组分的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
茶样信息:供试茶样取材于江西省修水县3个主要宁红茶产区:漫江乡(代号MJ,位于114°25′38.28″E,28°49′08.76″N)、黄坳乡(代号HA,位于114°44′06.72″E,28°58′59.88″N)、大椿乡(代号DC,位于114°15′13.68″E,29°07′32.88″N),采摘单芽和一芽一叶初展(单芽占50%以上)的茶叶,所有样品均经萎凋、揉捻、发酵及干燥等传统宁红茶加工工艺生产制成。
试剂:C7-C40正构烷烃,Sigma-Aldrich公司;超纯水(Elix Essential系统),德国Merck Millipore公司;正己烷(色谱级),德国Merck公司;标准品己酸己酯(≥98%)、邻苯二甲酸二丁酯(>98.5%)、茶螺烷(≥90%),上海麦克林生化科技股份有限公司;癸酸乙酯、氯化钠、标准品苯甲醇(≥99.5%)、芳樟醇(98%)、苯乙醇(95%)、1-壬醇(96%)、α-萜品 醇(>95.0%)、橙花醇(97%)、香叶醇(≥99.0%)、雪松醇(>98.0%)、植醇(>90.0%)、己酸乙酯(>99%)、乙酸苄酯(≥99.7%)、水杨酸甲酯(≥99.5%)、壬酸乙酯(>95.0%)、甲酸香叶酯(85%)、乙酸香叶酯(95%)、丁酸香叶酯(95%)、苯甲酸己酯(≥98.0%)、邻苯二甲酸二异丁酯(99%)、月桂酸乙酯(99%)、肉豆蔻酸甲酯(>98.0%)、香叶基丙酮(97%)、肉豆蔻酸乙酯(≥98.0%)、棕榈酸甲酯(99%)、棕榈酸乙酯(≥99%)、亚油酸乙酯(≥97.0%)、正己醛(≥99.0%)、2-乙酰基吡咯(99%)、糠醛(≥99.5%)、苯甲醛(>99.0%)、苯乙醛(95%)、正壬醛(96%)、癸醛(97%)、α-紫罗酮(>90.0%)、β-紫罗酮(97%),上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
Thermo TSQ8000Evo气相色谱-质谱联用仪,配TriPlus RSH三合一自动进样器、TG-5MS气相色谱柱(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm),美国Thermo Fisher公司;固相微萃取头50/30 μm DVB/CAR/PDMS,美国Supelco公司。
1.3 实验方法
1.3.1 样品处理
茶叶样品,经粉碎,过40目筛,精确称取1.5 g茶粉,置入20 mL顶空瓶内,加入4.5 mL氯化钠溶液(质量浓度0.3 g/mL),同时加入癸酸乙酯内标100 μL (质量浓度4 μg/mL),立即加盖密封。
1.3.2 SPME条件
孵化温度60 ℃,平衡时间30 min;萃取温度60 ℃,萃取时间60 min;老化温度270 ℃;解析温度250 ℃,解析时间5 min。
1.3.3 GC-MS检测条件
GC-MS检测条件参考本实验室之前的实验方法[13]。
GC条件:载气氦气(纯度≥99.999%),流速1.0 mL/min,进样口温度250 ℃,不分流进样,程序升温:初始40 ℃(保持2 min),5 ℃/min速率,升至85 ℃(保持2 min),2 ℃/min,110 ℃(保持2 min),4 ℃/min,220 ℃(保持2 min),5 ℃/min,终温250 ℃(保持10 min)。
MS条件:电子轰击电离(electron impact,EI)源温度300 ℃,传输线温度280 ℃,电子能量70 eV,质谱扫描范围:m/z 33～550 amu。
1.3.4 感官审评方法
参照国家标准GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》和GB/T 14487—2017《茶叶感官审评术语》对茶样进行感官审评,由专业审评人员对样品进行100分制评分,加权计算审评总分(总分=外形×25% +汤色×10%+香气×25%+滋味×30%+叶底×10%)。
1.3.5 香气组分定性方法
香气组分鉴定在NIST 20数据库进行匹配,通过谱库正反匹配、保留指数以及标准品进行定性,使用正构烷烃计算挥发性化合物的保留指数,并与数据库中的保留指数进行对比,保留指数计算如公式(1)所示[14]:
式中:RI(x),未知化合物X 的保留指数;z,未知化合物X 的碳数;RT(x),未知化合物X 的保留时间;RT(z),未知化合物X 流出前正构烷烃的保留时间;RT(z+1),未知化合物X 流出后正构烷烃的保留时间。
1.3.6 香气组分定量方法
采用内标法,对每种化合物进行定量计算。如公式(2)所示:
式中:Wi,挥发性化合物含量;Si,挥发性化合物峰面积;M,内标癸酸乙酯含量;S,内标癸酸乙酯峰面积。
1.3.7 茶叶气味活性值(odor activity value,OAV)计算
OAV定义为香气化合物的含量与该化合物的阈值之比。OAV计算如公式(3)所示[15]:
式中:Ci,挥发性化合物的含量,μg/kg;OTi,挥发性成分水中的香气阈值,μg/kg。
1.4 数据分析
每组实验样品平行实验3次。利用SIMCA 14.1软件对香气组分进行PCA、PLS-DA并计算预测变量重要性投影(variable importance in projection,VIP);利用IBM SPSS Statistics 23进行单因素方差分析检验并运用邓肯多重比较(Duncan multiple comparisons)以检验样品组间显著性(P <0.05);利用Tbtools(版本2.056,https://github.com/CJ-Chen/TBtools)软件制作热图。
2 结果与分析
2.1 不同产区宁红茶感官品质分析
根据感官审评结果(图1、表1),来自3个产区的宁红茶样品平均总评分均超过90分,表明其等级相当,整体品质较佳。它们均具备条索紧结、汤色红亮、香气甜香、滋味醇和等品质特征。然而,不同产区的宁红茶在外形、汤色、香气和叶底方面呈现出显著差异。MJ组汤色偏红;HA组的香气带有较明显的高火味,这些因素导致MJ组和HA组的整体评分略低于DC组。相比之下,DC组的平均总评分最高,其条索更为紧结匀整,金毫多,叶底呈红色,匀亮,香气表现突出,具有典型的甜香和花香。不同产区的宁红茶在滋味方面则无显著性差异,3组样品滋味表现相近,得分也较为接近,均呈现出醇和、略带涩味的口感特征。
图1 不同产区的宁红茶感官审评
Fig.1 Sensory evaluation of Ning black tea in different growing regions
表1 不同产区的宁红茶感官审评结果
Table 1 Sensory evaluation results of Ning black tea in different growing regions
注:不同小写字母表示组间存在显著性差异(P <0.05)(下同)。
2.2 不同产区宁红茶中香气组分鉴定
如图2所示,样品经GC-MS检测,得到各样品的离子流图。3个产区的茶样离子流图出峰基本一致,但是峰面积有很大区别。各样品中含量最多的香气组分均为香叶醇,在保留时间约为34 min时间段,HA组与其余2组的出峰结果差异显著。通过谱库检索和人工筛选,共鉴定出99种香气组分,并采用内标法计算其绝对含量(电子版增强出版附表1,https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.0,43860,下同)。这些香气组分包括21种醇类、14种醛类、9种酮类、27种酯类、18种萜烯类、2种烷烃类和1种酸类,不同产区宁红茶共有香气组分82种,由图3可知,这些香气组分主要为醇类和酯类,与岳翠男等[16]研究结果一致。不同产区的宁红茶样品在香气组分的种类和含量上表现出明显差异。MJ组共鉴定出87种香气组分,其中醛类含量较其他组高。HA组共鉴定出94种香气组分,特有的香气组分有二氢芳樟醇、肉豆蔻酸甲酯、反式-β-罗勒烯、3,5-杜松-二烯。此外,该组样品的醇类、酮类、酯类和萜烯类含量均高于其余2组,总香气组分含量也显著高于其余2组。DC组共鉴定出94种香气组分,特有的香气组分有苯甲酸己酯。
图2 不同产区宁红茶香气组分离子流图比较
Fig.2 Comparison of ion chromatograms of aroma components of Ning black tea in different growing regions
图3 不同产区宁红茶中香气组分类别的比较
Fig.3 Comparison of aroma components in Ning black tea from different growing regions
2.3 不同产区宁红茶香气组分差异性分析
为了直观展现不同产区宁红茶中差异性香气组分的分布特征,使用TBtools软件进行结果分析。如图4所示,99种差异挥发性化合物在3组不同产区宁红茶样品中的相对丰度热图及其聚类分析结果中,红色/橙色表示化合物高于平均值,颜色越深代表含量越高;蓝色表示化合物含量低于平均值,颜色越深则含量越低。为增强可视化效果,这些化合物根据其化学结构类型被分类为醇类、酯类、酮类、醛类、萜烯类和其他类(包含酸类、烷烃类及其他物质),并通过右侧分面小热图分别显示各类别化合物的分布模式。从图中可以看出,醇类、醛类、酮类、酯类和萜烯类在不同产区呈现不同的富集趋势。3组宁红茶香气组分通过聚类分析可知,HA组为一类,DC组和MJ组为一类,说明DC组各成分含量的变化与MJ组相近,并且这种趋势同样表现在醇类、酮类、酯类和萜烯类当中,醛类聚类中则MJ组为一类,DC组与HA组表现相近为一类。
图4 不同海拔宁红茶香气组分热图
Fig.4 Heat map of aroma components in Ning black tea from different growing regions
PCA通过向量空间的正交变换来降低原始数据的维数,能够从复杂数据集中有效提取相关信息[17],PLS-DA则可用于预测未知样本的分组情况[18]。在PCA模型(图5-A)中,共提取2个主成分,其中主成分1(PC1)和主成分2(PC2)分别贡献67.5%和22.1%的解释率,累计贡献率达89.6%,能够较好地表征数据的主要变化趋势。MJ组和DC组均分布于X轴的正半轴,而HA均分布于X轴的负半轴,表明组内样本重复性良好,且不同产区的宁红茶样品在主成分空间中具有明显的区分趋势。PLS-DA(图5-B)进一步验证了样品间的区分度,结果显示模型具有良好的重复性。为确保PLS-DA模型的稳健性,采用置换检验进行200次交叉验证(图5-C),结果显示回归线段Q2与Y轴交于负半轴,表明模型未出现过拟合,验证结果可靠。理论上,模型参数R2 和Q2 值一般要求大于0.5,当R2 和Q2 接近1时,模型质量越优,而大于0.4亦可接受[19]。本次分析当中,自变量拟合指数(R2X)为0.956,因变量拟合指数(R2Y)为0.99,模型预测指数(Q2)为0.985,这些数值均远高于理论要求,表明该模型拟合效果良好,能够准确用于本次试验茶样的差异性分析。
图5 不同产区宁红茶香气组分多元统计分析
Fig.5 Multivariate statistical analysis of aroma components of Ning black tea in different growing regions
a-PCA;b-PLS-DA;c-模型交叉验证结果;d-VIP得分图
基于该模型,对不同产区宁红茶差异性标志物进行了VIP筛选(图5-D),共筛选出22种VIP值大于1的香气组分,这些组分对模型有显著贡献[20-21],包括香叶醇、水杨酸甲酯、芳樟醇、苯乙醇、(E)-3-己烯-1-醇、(E)-柠檬醛、苯乙醛、(Z)-茉莉酮、(E)-呋喃芳樟醇氧化物、(Z)-柠檬醛、苯甲醛、δ-杜松烯、茶吡咯、正己醛、二氢芳樟醇、(Z)-3-己烯己酸酯、棕榈酸乙酯、(E,E)-2,4-庚二烯醛、香叶酸甲酯、苯甲醇、(Z)-芳樟醇氧化物、乙酸香叶酯。这些香气组分是不同产区宁红茶香气特征的关键贡献因子。
2.4 不同产区宁红茶理论关键香气组分分析
在PCA和PLS-DA的基础上,对差异性生化成分进行进一步筛选,最终确定6种关键挥发性物质[22](表2),包括(E)-3-己烯-1-醇、(E)-呋喃芳樟醇氧化物、δ-杜松烯、正己醛、(Z)-3-己烯己酸酯、苯甲醇。当OAV >1时,认为其香气组分对茶的香气有重要贡献[23]。因此理论上,这些成分是不同产区宁红茶的关键呈香物质,其主要香气类型包括花香、清香、木香、果香、甜香,这与感官审评的结果高度一致。通过进一步比较这6种香气组分在各组中的含量,发现MJ组的正己醛和(E)-3-己烯-1-醇含量显著偏高,这两种物质均具有清香特征,可能是减少涩味、提升茶汤顺滑度的关键因素;HA组的(Z)-3-己烯己酸酯、(E)-呋喃芳樟醇氧化物和δ-杜松烯含量显著偏高,这些成分主要呈现木香和果香,可能是感官审评中高火味和焦香的来源;DC组的苯甲醇含量最高,而苯甲醇具有显著的花香特性[24],因此可以推断由于DC组产区茶叶中苯甲醇相对含量较高,从而增强其茶叶的花香特征,提高了宁红茶的整体品质,进而在感官审评中获得更高的香气评分。根据以上结果,在进一步的实验研究中可以通过系统设计重组缺失实验对各产区宁红茶的关键香气物质进行确证,为宁红茶产品香气组分品质调控提供理论基础。
表2 不同产区宁红茶香气组分关键差异物质OAV和香气类型
Table 2 Key differential substances OAV and aroma types of aroma components in Ninghong tea from different growing regions
注:∗所有气味阈值均来自水中的检测阈值,部分阈值单位经过适当的换算。VIP >1、P <0.05以及OAV >1;#香气类型来自:https://www.flavornet.org/flavornet.html。—代表无数据。
3 结论
本研究结合HS-SPME-GC-MS分析与感官审评,探讨了不同产区修水宁红茶的香气组分特征及感官品质差异。结果表明,不同产区的宁红茶在香气组分种类、含量及感官特性上存在显著差异。感官审评显示:MJ组以甜香、花香和薯香为主,汤色偏红,叶底较碎;HA组具有甜香,并伴随高火味、焦香,叶质较硬;DC组表现出甜香、花香和薯香,具有更高的感官评分,外形紧结匀整,汤色红亮,品质最佳。香气组分分析表明,3组茶样中共有香气组分82种,但不同产区关键挥发性物质含量差异明显。MJ组正己醛、(E)-3-己烯-1-醇含量显著高于其他组,这些物质赋予茶叶清香特征;HA组(Z)-3-己烯己酸酯、(E)-呋喃芳樟醇氧化物、δ-杜松烯含量显著高于其他组,这些物质呈现木香和果香;DC组苯甲醇含量最高,赋予其显著的花香特征。
本文研究结果揭示了产区对修水宁红茶香气成分的显著影响,但具体的形成机制尚不明确,未来可以通过扩大样本数量,探讨产区生境因素差异等途径,进一步开展研究,以完善修水宁红茶的香气系统形成机理,为其品质调控提供重要参考。
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