豆酱是微生物利用大豆和面粉为原料发酵而成的一种半流动状态的调味品[1]。其与酱油、豆豉以及腐乳被称为我国四大传统发酵豆制品[2]。大豆富含多种营养物质及天然活性物质,如蛋白质、矿物质、异黄酮、皂苷等[3]。在豆酱的发酵过程中,大部分营养物质的生物利用率会因为微生物的代谢作用而提高[4]。除此之外,微生物的代谢作用还会使豆酱中产生新的活性成分[5],从而使豆酱具有降血压、抗炎和抗癌等多种独特的生理功能[6]。然而,目前发酵调味品中的食盐含量普遍较高。长期过量摄入食盐会导致血压升高进而引发其他心血管疾病,高盐饮食还会增加胃癌、哮喘等多种疾病的发病率[7]。世界卫生组织(World Health Organization,WHO)提供的数据显示,中国人均每日食盐摄入量约10.5 g,远超WHO推荐食盐摄入量[8]。《中国居民膳食指南(2022)》也指出,我国成年人每日食盐摄入量不应超过6 g[9]。因此,从国民健康角度考虑,有必要降低传统豆类发酵食品中的盐含量。然而目前对发酵调味品减盐发酵的相关基础研究依然薄弱,研究盐质量浓度对发酵调味品发酵过程的影响具有十分重要的意义。
传统发酵调味品中的食盐除了为产品提供咸味外,还具有抑制有害微生物、促进发酵体系耐盐与嗜盐微生物生长和控制发酵进程等多种十分重要的作用[10]。因此,不加干预的降低发酵过程中的盐含量可能会为发酵带来不利影响。在低盐环境下,产品更容易腐败变质,这是因为盐质量浓度降低导致发酵体系水分活度升高以及渗透压降低,从而为腐败菌和致病菌提供了更加有利的生长条件[11]。SONG等[12]研究发现腐生葡萄球菌和大肠杆菌在盐含量为8.0 g/100 g的低盐酱油中被检出,而在盐含量高于8.0 g/100 g的样品中则未检出。CHUN等[13]对不同盐质量浓度发酵下的韩国大酱进行研究,发现在低盐质量浓度下大酱中的腐败微生物丰度更高,pH快速下降从而导致豆酱酸度过高。有研究指出,一些优势菌在低盐发酵环境下大量繁殖,抑制了其他与风味产生相关的微生物的生长,从而导致发酵食品风味减弱[14]。在豆瓣酱的发酵过程中,盐度的降低虽然有利于挥发性风味化合物的积累,但同时也导致部分关键挥发性风味化合物的缺失和令人不快的风味化合物的产生[15]。相关研究还发现,随着发酵盐质量浓度的降低,豆酱和酱油的发酵体系内会积累更多的氨基酸态氮和总酸[16-17]。除此之外,较多报道指出发酵豆制品中盐含量的降低会导致生物胺等有害物质的产生和积累[18-19]。
本研究考察了减盐发酵对黄豆酱品质与风味的影响,对不同盐质量浓度发酵下黄豆酱的理化指标、细菌数量、生物胺含量及风味物质含量等进行研究分析,以期通过基础研究结果为黄豆酱及其他传统发酵调味品的减盐发酵相关研究提供一定的理论参考。
1.1.1 培养基
MRS培养基(g/L):尿素2,牛肉膏2.5,酵母膏2,柠檬酸三铵2,葡萄糖2,吐温80 1,乙酸钠5,磷酸氢二钾2,硫酸镁0.2,硫酸锰0.05,固体培养基另加琼脂15。
LB培养基(g/L):胰蛋白胨10,酵母粉5,氯化钠10,固体培养基另加琼脂15。
MSA培养基(g/L):胰蛋白胨10,牛肉膏1,甘露醇10,氯化钠75,酚红0.025,琼脂15。
1.1.2 试剂
氨基酸标样、邻苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPA)、有机酸标样、生物胺标样,美国Agilent公司;其他常规试剂,国药集团化学试剂有限公司。
LHP-300恒温恒湿培养箱,常州首创仪器设备公司;1260 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪,美国Agilent公司;HDPN-88恒温培养箱,上海跃进医疗器械厂;XPR2U电子天平、S20-K便携式pH计,瑞士Mettler-Toledo公司;LS-B50L高压蒸汽灭菌锅,上海医用核子仪器厂;GCMS-QP2020 NX气相色谱质谱联用仪,日本岛津公司;TSX40086FA超低温冰箱,美国Thermo Fisher公司;5810R台式高速离心机,德国Eppendorf公司;SW-CJ-1FD-Ⅱ超净工作台,苏州安泰空气技术有限公司。
1.3.1 黄豆酱发酵工艺
将大豆进行清洗除杂,按照豆水比1∶3(g∶mL)浸泡8~10 h,沥干水分,121 ℃下蒸料15 min。将蒸熟冷却后的大豆与面粉混匀[m(大豆)∶m(面粉)=7∶3],以原料质量分数0.04%接种曲精(米曲霉沪酿3.042)。拌匀后将原料平铺放入制曲仓,在湿度95%、30 ℃下制曲44 h得到成曲。将成曲与不同浓度的盐水按照质量比1 ∶1混匀装罐,放入30 ℃培养箱进行发酵。发酵前5 d每天搅拌一次,之后每5 d搅拌一次,在发酵第0、5、10、15、20、25、30、35、40天进行取样。
1.3.2 理化指标测定
pH值的测定:取5 g酱醅加20 mL去离子水混匀后使用pH计直接测定。
氨基酸态氮含量的测定:依照GB 5009.235—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》。
总酸含量的测定:依照GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定(含第1号修改单)》。
1.3.3 细菌数量测定
将酱醅用生理盐水梯度稀释后涂布平板进行活菌计数。非乳酸菌细菌的计数选用添加了纳他霉素的LB平板,涂布后在30 ℃培养箱培养24 h计数;乳酸菌的计数选用添加了山梨酸的MRS平板,涂布后在30 ℃培养箱培养48 h计数[20]。葡萄球菌的计数选用MSA平板,涂布后在37 ℃培养箱中培养24~48 h计数[21];肠球菌的计数依照SN/T 1933.1—2007《食品和水中肠球菌检验方法 第1部分:平板计数法和最近似值测定法》;大肠菌群计数依照国标GB 4789.3—2025《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》。
1.3.4 生物胺含量测定
生物胺含量测定采用高效液相色谱法,具体步骤参照文献并稍作改动[22]。称取5.0 g研磨均匀的黄豆酱样品于50 mL离心管中,加入20 mL 50 g/L三氯乙酸溶液,混匀,振荡提取60 min,8 000 r/min离心10 min取上清液,滤纸过滤后收集滤液。精确吸取滤液2 mL于15 mL离心管中,加入3 mL正己烷,振荡2 min,静置分层,8 000 r/min离心10 min弃有机层。精确吸取1 mL生物胺标准系列溶液和上述样品预处理液,按顺序加入0.1 mL内标标准使用溶液(1,7-二氨基庚烷)、0.2 mL 2 mol/L的NaOH溶液、0.3 mL饱和NaHCO3 缓冲液、1.5 mL丹磺酰氯衍生剂,随后置于45 ℃水浴锅暗处理50 min,中间颠倒混匀3次,水浴结束后加入0.1 mL氨水终止反应。于暗处静置30 min后用乙腈定容至5 mL,8 000 r/min离心10 min,取上清液用0.22 μm滤膜过滤备用。色谱条件:流动相A为乙腈,流动相B为超纯水,色谱柱为C18柱,柱温30 ℃,流速0.8 mL/min,进样量为10 μL,紫外检测波长为254 nm。
1.3.5 非挥发性风味物质含量测定
游离氨基酸含量测定采用高效液相色谱法,具体步骤参照文献并稍作改动[23]。称取1 g研磨均匀的黄豆酱样品,加入50 g/L三氯乙酸溶液溶解并定容至25 mL,振荡混匀后使用双层滤纸过滤,取1 mL澄清滤液于1.5 mL离心管中,12 000 r/min离心10 min,取上清液经0.22 μm水系滤膜过滤,样品采用OPA进行柱前衍生。液相系统:Agillent 1260;检测器:UV 338 nm;色谱柱:ODS HYPERSIL(250 mm ×4.6 mm,2.5 μm);柱温:40 ℃;进样体积:10 μL;洗脱速度:1 mL/min;洗脱时间:40 min;流动相A(1 L):无水乙酸钠5 g,四氢呋喃5 mL,三乙胺200 μL,pH 7.2;流动相B(1 L):无水乙酸钠5 g,超纯水200 mL,甲醇400 mL,乙腈400 mL,pH 7.2。
有机酸含量测定采用高效液相色谱法,具体步骤参照文献并稍作改动[20]。称取2 g研磨均匀的黄豆酱样品,加入30 mL超纯水稀释,振荡混匀后使用双层滤纸过滤,取1 mL澄清滤液于1.5 mL离心管中,12 000 r/min离心10 min,取上清液过0.22 μm水系滤膜,滤液用于检测。液相系统:岛津20A;检测器:UV 210 nm;色谱柱:Aminex-HPX-87H(300 mm ×7.8 mm,9 μm);柱温:40 ℃;进样体积:10 μL;洗脱速度:0.5 mL/min;洗脱时间:30 min;流动相:5 mmol/L稀硫酸。
1.3.6 挥发性风味物质测定
挥发性风味物质采用固相微萃取气质联用技术(solid phase microextraction,SPME-GC-MS)进行测定,具体步骤参照文献并稍作改动[24]。称取5 g研磨均匀的黄豆酱样品,使用ddH2O进行稀释,添加2-辛醇作为内标。萃取条件:先将样品在50 ℃下水浴30 min,用萃取头吸附30 min,随后将萃取头插入气相色谱进样口,在240 ℃下解吸15 min。气相色谱条件:色谱柱TG-WAMS(60 mm ×0.25 mm,0.25 μm),载气为高纯He,不分流进样,进样温度250 ℃;梯度升温程序为:45 ℃保持1 min,以3 ℃每分钟升至130 ℃,以6 ℃每分钟升至200 ℃,以8 ℃每分钟升至230 ℃,随后保持恒温10 min。质谱条件:EI电离源,离子源温度220 ℃,离子源能量70 eV,界面温度250 ℃,电子扫描范围为全扫描。通过NIST标准谱库对风味物质进行检索,以内标2-辛醇的峰面积对化合物进行定量分析。
使用Excel 2021和Origin 2021进行数据处理和作图,使用IBM SPSS Statistics 26进行显著性统计分析,所有实验均包含3个平行样。
不同盐质量浓度下黄豆酱发酵过程中理化指标的变化如图1所示。不同盐质量浓度发酵下黄豆酱的pH值均在前10 d时下降较快,随后趋于稳定,且盐质量浓度越低,其pH值也越低。总酸的变化趋势与pH值相反,盐质量浓度为80 g/L和100 g/L时黄豆酱的总酸明显高于盐质量浓度为120 g/L和140 g/L时,其中盐质量浓度为80 g/L时黄豆酱的总酸最高,达到了3.0 g/100 g,相较于盐质量浓度为120 g/L和140 g/L时增加了80% 以上。不同盐质量浓度下发酵体系内pH值和总酸的差异表明,随着盐质量浓度的降低,发酵体系内会产生更多的酸。低盐质量浓度下黄豆酱发酵体系内更多的酸的产生可能是盐质量浓度的降低对产酸微生物的抑制作用减弱所导致[25]。氨基酸态氮是衡量黄豆酱质量的重要指标,如图1-b所示,不同盐质量浓度下黄豆酱在发酵终点时氨基酸态氮含量分别达到了1.10、1.16、0.99、1.00 g/100 g。氨基酸态氮是微生物水解原料中的蛋白质产生,而盐质量浓度降低后,对蛋白酶活性的抑制作用减弱,因此随着盐质量浓度降低氨基酸态氮含量反而会更高[26]。
图1 盐质量浓度对黄豆酱pH、氨基酸态氮及总酸的影响
Fig.1 Effect of salt concentration on pH,amino acid nitrogen,and total acid content in soybean paste
a-pH;b-氨基酸态氮含量;c-总酸
如图2所示为不同盐质量浓度下黄豆酱发酵过程中细菌数量的变化规律。盐质量浓度为80 g/L和100 g/L时黄豆酱中非乳酸菌细菌在发酵前5 d出现明显增长,其数量达到了109 CFU/g以上,高于盐质量浓度为120 g/L和140 g/L时2个数量级。随后其数量开始下降并逐渐趋于稳定,发酵20 d以后,不同盐质量浓度下的非乳酸菌细菌数量无明显差异,最终稳定在107 CFU/g左右。不同盐质量浓度下黄豆酱中乳酸菌数量的变化趋势在发酵前期与非乳酸菌细菌相似,但随着发酵时间的延长,乳酸菌数量并没有趋于稳定,整体上仍表现出下降的趋势。结果表明,盐质量浓度减少后,在发酵前期黄豆酱中细菌数量明显增加,盐质量浓度对非乳酸菌细菌数量和乳酸菌数量的影响均主要表现在发酵前期。低盐质量浓度下,由于渗透压的降低,可能会导致部分腐败菌大量繁殖。SONG等[12]研究指出在减盐大酱中肠球菌和葡萄球菌是主要的腐败微生物,其大量繁殖会使发酵体系pH迅速下降,此外其存在潜在的致病风险且与生物胺的产生相关。本研究对不同盐质量浓度下黄豆酱发酵过程中的肠球菌、葡萄球菌及大肠菌群的数量进行了检测,结果如表1所示,随着盐质量浓度的降低,在发酵前期这些细菌的数量明显增加,这可能会导致发酵体系pH快速下降且其代谢产物中的有害物质大量积累,最终导致黄豆酱品质下降甚至发酵失败。
表1 不同盐质量浓度下黄豆酱发酵过程中腐败菌及大肠菌群数量
Table 1 The number of spoilage bacteria and coliform bacteria during the fermentation process of soybean paste with different salt concentrations
注:表中同一列相同发酵时间下不同小写字母标记的数值表示差异显著(P <0.05),ND表示未检出。
图2 盐质量浓度对黄豆酱中细菌数量的影响
Fig.2 Effect of salt concentration on the number of bacteria in soybean paste
a-非乳酸菌细菌数;b-乳酸菌数
为了探究减盐发酵是否会导致黄豆酱出现潜在的食品安全风险,本研究对不同盐质量浓度下黄豆酱中生物胺含量进行了检测。如图3所示,随着盐质量浓度的降低,黄豆酱中生物胺含量不断上升,其中盐质量浓度为80 g/L时黄豆酱中生物胺总量达到了165.09 mg/kg,分别比100 g/L、120 g/L和140 g/L盐质量浓度下增加了4.5%、13.97%和19.65%。所有发酵组中含量最高的生物胺均为腐胺,除此之外均未检测到色胺和亚精胺。腐胺的毒性很小,但是会抑制组胺和酪胺的代谢,而组胺和酪胺则是生物胺中毒性最大的[27]。结果显示,随着盐质量浓度的降低,黄豆酱中组胺和酪胺的含量随之升高,80 g/L和100 g/L盐质量浓度下组胺和酪胺的含量接近,其中组胺含量分别比120 g/L和140 g/L盐质量浓度下增加了38.22%、43.80% 和27.60%、32.76%,酪胺含量分别增加了71.56%、119.39% 和49.76%、91.52%。发酵食品中生物胺多是由微生物的氨基酸脱羧酶对氨基酸进行脱羧作用而形成,盐质量浓度降低会减弱对产胺菌的氨基酸脱羧酶的活性抑制,从而导致生物胺含量增加[28]。因此应关注黄豆酱减盐发酵后生物胺含量增加带来的食品安全风险。
图3 盐质量浓度对黄豆酱中生物胺含量的影响
Fig.3 Effect of salt concentration on the content of biogenic amines in soybean paste
注:图中不同小写字母标记表示不同盐质量浓度下同一种生物胺的含量差异显著(P <0.05)。
游离氨基酸和有机酸是黄豆酱中重要的非挥发性风味物质,本研究测得其在不同盐质量浓度黄豆酱中的含量如图4所示。由图4-a可知,盐质量浓度为120 g/L和140 g/L时黄豆酱中游离氨基酸总量基本无差异,而随着盐质量浓度的进一步降低,黄豆酱中游离氨基酸总量有所下降。其中盐质量浓度为80 g/L时黄豆酱中游离氨基酸总量为57.05 g/L,相较于120 g/L和140 g/L盐质量浓度下分别下降了15.33%和15.98%。盐质量浓度降低后发酵体系内游离氨基酸含量的减少一方面可能与微生物利用有关,另一方面也可能是参与合成蛋白质、肽类等其他含氮化合物或通过脱羧作用生成生物胺有关。除此之外,不同盐质量浓度下黄豆酱中含量较高的几种氨基酸均为谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸和赖氨酸。其中谷氨酸和天冬氨酸是重要的鲜味氨基酸,随着盐质量浓度的降低这2种氨基酸的总量也有所下降。与120 g/L和140 g/L盐质量浓度下不同的是,80 g/L和100 g/L盐质量浓度下黄豆酱中精氨酸含量极低,这可能是由于与精氨酸代谢相关的酶的活性在不同盐质量浓度下有较大差异所导致。游离氨基酸对豆酱的滋味和营养价值有着重要贡献,同时其还是某些风味物质合成的前体物[29]。盐质量浓度降低后,游离氨基酸总量下降,尤其是呈鲜味的谷氨酸和天冬氨酸含量下降,这将会导致豆酱的整体风味减弱且营养价值下降。由图4-b可知,80 g/L和100 g/L盐质量浓度下乳酸、乙酸和酒石酸含量更高,而120 g/L和140 g/L盐质量浓度下柠檬酸和琥珀酸含量更高。其中乳酸和琥珀酸含量差异较大,80 g/L、100 g/L盐质量浓度下乳酸含量较高,分别达到了5.52、3.88 g/L;120 g/L和140 g/L盐质量浓度下乳酸含量极低,但琥珀酸含量分别为80 g/L和100 g/L盐质量浓度下的1.77倍、2.04倍、3.30倍和3.80倍。乳酸和琥珀酸是黄豆酱中比较重要的呈味有机酸。乳酸独特的酸味能够增加黄豆酱的口感层次,但乳酸含量过高也会使黄豆酱口感过于酸涩。琥珀酸具有提高鲜味的作用,同时还具有一定的防腐功能[30]。因此有机酸含量的变化表明,盐质量浓度的降低可能会使得黄豆酱酸味过于明显而鲜味有所减弱。
图4 盐质量浓度对黄豆酱中非挥发性风味物质含量的影响
Fig.4 Effect of salt concentration on the content of non-volatile flavor compounds in soybean paste
注:∗表示差异显著(P<0.05),∗∗表示差异极显著(P<0.01)(下同)。
a-游离氨基酸含量;b-有机酸含量
黄豆酱的整体风味与其挥发性风味物质的种类和含量密切相关。如图5-a所示,当盐质量浓度为80 g/L和100 g/L时黄豆酱中挥发性风味物质总量更高,其中当盐质量浓度为80 g/L时挥发性风味物质总量最高,达到了15 032.96 μg/kg。在黄豆酱发酵过程中挥发性风味物质的产生大都依靠微生物的代谢,盐质量浓度降低使得发酵体系内微生物数量增加从而产生的挥发性风味物质更多。对不同种类的风味物质进行比较,结果表明,与120 g/L和140 g/L盐质量浓度下相比,80 g/L和100 g/L盐质量浓度下产生的酸类、醛类及其他包括烷烃及杂环类风味物质更多,而醇类、酮类和酚类物质更少,其中酸类物质增加了0.31~2.90倍,醇类物质减少了0.54~ 1.17倍。结合相关文献报道,对豆酱中共有的且含量较高的部分常见挥发性风味物质进行比较[31]。本研究发现盐质量浓度降低后,1-辛烯-3-醇(蘑菇和蔬菜香气)、苯乙醇(风信子、栀子花和玫瑰香气)、异戊酸乙酯(甜的果香)、苯乙醛(风信子香气)、3-辛酮(蔬菜香气)及4-乙烯基愈创木酚(烟熏味和丁香味)的含量明显降低,而苯乙酸乙酯(花香、果香和可可香)和苯甲醛(苦杏仁味)的含量有所升高。除此之外,当盐质量浓度为80 g/L和100 g/L时苯酚(特殊的臭味)的含量增加了0.55~2.66倍,乙酸(刺激性气味)的含量增加了0.68~4.25倍。虽然盐质量浓度降低后挥发性风味物质总量有所增加,但可以发现其中大部分常见的风味化合物含量降低,且部分具有不良气味的风味物质含量增加。
图5 盐质量浓度对黄豆酱中挥发性风味物质含量的影响
Fig.5 Effect of salt concentration on the content of volatile flavor compounds in soybean paste
a-黄豆酱中挥发性风味物质含量;b-主要挥发性风味物质比较
在发酵调味品的发酵过程中,食盐的添加量会对其品质及风味产生影响。研究盐质量浓度对发酵调味品发酵过程的影响有助于了解减盐发酵引发的问题与挑战,推进发酵调味品的减盐生产。本研究考察了不同盐质量浓度发酵对黄豆酱的影响,基于理化指标、细菌数量、生物胺含量及风味物质含量等多个方面的研究结果,证实了减盐发酵使得黄豆酱品质与风味下降,食品安全风险增加。具体表现为:黄豆酱发酵体系pH更低,总酸更高,在发酵前期细菌数量尤其是腐败菌(肠球菌和葡萄球菌)和大肠菌群数量明显增加,生物胺含量增加,酸类物质含量增加而醇类物质含量降低,且1-辛烯-3-醇等主要挥发性风味物质含量减少。该研究结果对研究环境因素影响黄豆酱发酵进程及其风味与品质等具有参考意义,也为今后黄豆酱及其他发酵调味品的减盐生产提供了一定的理论基础。
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Effect of salt-reduced fermentation on quality and flavor of soybean paste