胶原蛋白(collagen)是发现最早、含量最丰富的细胞外基质蛋白,广泛存在于人与动物体的皮肤、肌肉、骨骼及内脏中。对维护细胞、组织和器官的正常生理功能、修复损伤都有重要作用。胶原蛋白因其优异的理化性质、生物学功效性和生物相容性、可生物降解等特性,使其在食品、化妆品、营养保健等领域得到广泛应用[1-2]。目前已发现并鉴定出28种胶原蛋白[3]。ⅩⅦ型胶原蛋白(17型胶原蛋白,collagen ⅩⅦ),又名COL17,是一种跨膜蛋白,在维持表皮黏附所涉及的细胞内和细胞外结构元素之间的联系方面发挥着至关重要的作用。ⅩⅦ型胶原蛋白是位于表皮基底膜区的跨膜蛋白,对于维持皮肤中相关干细胞的稳态有重要作用[4]。重组胶原蛋白凭借其安全性、可控性和生产的灵活性,正逐渐成为天然胶原蛋白的有力替代品[5]。目前,重组胶原蛋白的表达体系主要包括:原核生物、酵母、植物、杆状病毒和哺乳动物细胞表达体系[6]。例如,XIE等[7]采用温度诱导型质粒pBV在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源表达了重组人源I型胶原蛋白,在7 L发酵罐中纯化的胶原蛋白含量达1.88 g/L。GAO等[8]在毕赤酵母(Pichia pastoris)中异源表达了重组XII型胶原蛋白,在5 L发酵罐中采用高密度发酵方式进行发酵生产,其最高表达量达4.89 g/L。STEIN等[9]在转基因烟草中实现了重组人源I型胶原蛋白的异源表达,其含量占总提取可溶性蛋白含量的2%左右。本研究中,构建了1株高效生产重组人源ⅩⅦ型胶原蛋白的重组E.coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4。通过系统发酵条件优化策略,显著提高了重组人源ⅩⅦ型胶原蛋白的高效胞外生产,这对重组人源胶原蛋白的工业化生产与应用具有指导意义。
1 材料与方法
1.1 菌株与质粒
E.coli BL21 ΔdacB为重组胶原蛋白表达宿主[10]。pRSFDuet-1为重组胶原蛋白表达质粒。人源胶原蛋白ⅩⅦ-1、ⅩⅦ-2、ⅩⅦ-3、ⅩⅦ-4、ⅩⅦ-5、ⅩⅦ-6、ⅩⅦ-7、ⅩⅦ-8、ⅩⅦ-9、ⅩⅦ-10的氨基酸序列如表1所示。
表1 人源胶原蛋白ⅩⅦ片段的氨基酸序列
Table 1 The amino acid sequences of human collagen ⅩⅦ fragments
名称氨基酸序列ⅩⅦ-1GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGGHQGPRGEQGLTGMPGIRGPPGPSGDPGK-PGLTGPQGP-QGLPGTPGRPGIKGEPGAPGKGPPGPPGPPGPKGDQGIPGPPGPPGPPGPRGPPGVS-GALATYAAENSDSFRSELISYLTSPDVRSGPPGQKGEMG-TPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQⅩⅦ-2GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGGHQGPRGEQGLTGMPGIRGPPGPSGDPGK-PGLTGPQGP-QGLPGTPGRPGIKGEPGAPGKGPPGPPGPPGPKGDQGPPGPRGHQGEQGPPGPPGPQGPKGDKGDPGVPGGPPGQKGEMGT-PGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQⅩⅦ-3GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGGHQGPRGEQGLTGMPGIRGPPGPSGDPGK-PGLTGPQGP-QGLPGTPGRPGIKGEPGAPGKFRGIVGPPGPPGPPGIPGGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGP-PGPRGHKGEKGDKGDQⅩⅦ-4GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGGEKGERGAAGEPGPHGPPGVPGSVGP-KGSSGSPGPQG-PPGPVGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGGPPGPPGPPGPKGDQGQGPPGPPGPQGPKGDKGD-PGVPGGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQⅩⅦ-5GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGGEKGERGAAGEPGPHGPPGVPGSVGP-KGSSGSPGPQGP-PGPVGLQGLRGGPPGPPGPPGPKGDQGPPGPRGGQGPPGPPGPQGPKGDKGD-PGVPGALGIPSGPSEGGSSSTGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPP-GHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQⅩⅦ-6GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMG-PAGPDGHG-PRGPPGPPGASGDGSLLSLIPGPPGPPGPPGPRGPPGVSGNSDSFRSELISYLTSPDVRSGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGP-PGHPGPPGPRGHK-GEKGDKGDQⅩⅦ-7GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGPGPPGPPGAMGPPGPPGAPGPAGPAGLPGGIVGPPG-PPGPPGIPGIPGPPGPPGPPGPRGPPGVSGSDSFRSELISYLTSPDVRSGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQⅩⅦ-8GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGAGPAGLPGQGPPGPPGPRGPPGPSIPGP-PGPRGPPGEGLP-GPPGPPGSFLSNSSGISIGLPGPPGPPGLPGTSYEELLSLLRGSEFRGIVGPPGPPGPPGIPGNVWSSISVEDGPPGQKGEMGT-PGPKGDRGPAGPPG-HPGPPGPRGHKGEKGDKGDQⅩⅦ-9GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEAGPPGSGEKGER-GAAGEPGPHGPP-GVTGPQGPQGLPGTPGRPGIKGEPGAPGSSMLTVPGPPGPPGAMGPPGPPGAPGPIPGPPGPPGPPGPRGPPGVS-GALATYAAENSDSFRSELISY-LTSPDVRSGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQⅩⅦ-10GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGGPRGEQGLTGMPGIRGPPGPSGDPGK-PGLTGPQGPQGLP-GTPGRPGIKGEPGAPGKPGPPGPPGAMGPPGPPGAPGPAGPAGLPGGPPGPPGPPGPKGDQGQGPPGPPGPQGPKGD-KGDPGVPGDRGPAGPPG-HPGPPG
注：下划线,567～621 aa;绿色,749～807 aa;蓝色,820～848 aa;红色,906～921 aa;紫色,1 213～1 261 aa;橙色,950～972 aa;浅蓝色,1 438～1 482 aa。
1.2 重组菌的构建
为了胶原蛋白在E.coli BL21 ΔdacB中重组表达时可以正确折叠,在胶原蛋白片段的N端融合表达前导肽,其氨基酸序列如下:ADEQEEKAKVRTELIQELAQGLGGIEKKNFPTLGDEDLDHTYMTKLLTYLQ-EREQAENSWRKRLLKGIQDHALDLVPRGSP,其中下划线的序列为蛋白酶酶切位点。该前导肽与胶原蛋白基因一起被合成后,采用酶切位点Nco I和Hind III分别连接至质粒pRSFDuet-1,构建获得重组质粒pRSFDuet-1-XVII-1、pRSFDuet-1-XVII-2、pRSFDuet-1-XVII-3、pRSFDuet-1-XVII-4、pRSFDuet-1-XVII-5、pRSFDuet-1-XVII-6、pRSFDuet-1-XVII-7、pRSFDuet-1-XVII-8、pRSFDuet-1-XVII-9、pRSFDuet-1-XVII-10。分别转化感受态细胞E.coli BL21 ΔdacB,构建获得基因工程菌E.coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-XVII-1、E.coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-XVII-2、E.coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-XVII-3、E.coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-XVII-4、E.coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-XVII-5、E.coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-XVII-6、E.coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-XVII-7、E.coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-XVII-8、E.coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-XVII-9、E.coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-XVII-10。
1.3 培养基与培养方法
LB培养基(g/L):酵母提取物5、蛋白胨10、NaCl 10。TB培养基(g/L):酵母提取物24、蛋白胨12、甘油5、KH2PO4 2.32、K2HPO4 12.54。SOB(super optimal broth)培养基(g/L):酵母提取物 5、蛋白胨 20、NaCl 0.5、KCl 0.19、MgCl2 0.95。SOC(super optimal broth with catabolite repression)培养基(g/L):酵母提取物5、蛋白胨20、葡萄糖3.6、NaCl 0.5、KCl 0.19、MgCl2 0.95。SB(super broth)培养基(g/L):酵母提取物20、蛋白胨35、NaCl 5。M9培养基(g/L):葡萄糖4、MgSO4·7H2O 0.49、CaCl2·6H2O 0.022、Na2HPO4·7H2O 12.8、KH2PO4 3.0、NaCl 0.5、NH4Cl 1.0。对于固体培养基,每100 mL液体培养基中添加2 g琼脂,121 ℃灭菌15 min。
将重组E.coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4在LB固体培养基上划线,37 ℃培养12 h。挑取重组E.coli单菌落,接种于LB液体培养基(装液量为20 mL/150 mL三角瓶)中,37 ℃、200 r/min培养12 h作为种子液。将1 mL种子液加入发酵培养基(装液量50 mL/250 mL)中,于37 ℃、200 r/min条件下培养2 h,OD600值达到0.6。添加终浓度为1 mmol/L IPTG,于25 ℃、200 r/min条件下诱导培养24 h。
1.4 培养基与培养条件优化
优化不同培养基对重组人源胶原蛋白表达水平的影响时,分别采用6种培养基:LB培养基、SB培养基、M9培养基、TB培养基、SOC培养基和SOB培养基。分别研究了不同营养组分对重组人源胶原蛋白表达水平的影响,包括:碳源种类、氮源种类、无机盐种类。其中,碳源种类包括:甘油、麦芽糖、乳糖、糊精和蔗糖,其质量浓度为5 g/L。氮源种类包括:TB培养基中的复合氮源、酵母粉、牛肉膏、玉米浆粉、蛋白胨和(NH4)2SO4,其质量浓度为36 g/L。无机盐种类包括:NaCl、KCl、CaCl2、ZnSO4、CuSO4和MgSO4,其质量浓度为1 g/L。研究了IPTG浓度对重组人源胶原蛋白生产的影响,浓度分别为:0.1、0.2、0.5、1 mmol/L。研究了诱导温度对重组人源胶原蛋白生产的影响,分别包括:20、25、30、37 ℃。研究了不同浓度吐温-80添加对重组人源胶原蛋白生产的影响,浓度分别包括:1%、0.5%、0.1%和0%。
1.5 蛋白浓度测定
蛋白浓度的测定采用Bradford法[11],该方法又称考马斯亮蓝法,这是一种快速、简便的蛋白质定量方法。该方法利用染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质的结合,通过测定吸光度值来确定蛋白质浓度。其中,考马斯亮蓝G-250溶液的配制方法为:准确称取100 mg考马斯亮蓝G-250,溶于50 mL体积分数为95%的乙醇溶液中,与100 mL体积分数为85%的磷酸混合,加水定容至1 L。标准蛋白牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的质量浓度分别为:20、40、60、80、100 mg/L。将50 μL样品与250 μL考马斯亮蓝染液混合均匀,测定波长595 nm下吸光度值A595,制作标准曲线。采用与标准曲线检测相同的方法:将样品适当稀释后取50 μL发酵样品与250 μL考马斯亮蓝染液混合均匀,测定波长595 nm下吸光度值A595。
1.6 SDS-PAGE分析
将诱导后的发酵液离心后收集菌体,加入适量蛋白上样缓冲液,沸水浴10 min后离心取上清液上样。用移液器吸取样品加入蛋白凝胶孔后,电泳仪设置电压为80 V,待样品通过分离胶与浓缩胶交界面后,调整电压为120 V,样品距离凝胶底部1 cm处时停止电泳。研究中,取发酵16 h时样品进行SDS-PAGE实验验证。
1.7 利用基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)鉴定重组人源胶原蛋白
MALDI-TOF MS是一种用于检测和鉴定多肽、蛋白质、多糖、核苷酸、糖蛋白、高聚物以及多种合成聚合物的分子质量的设备。根据到达检测器的飞行时间不同而被检测,即通过离子的质量电荷之比(m/z)与离子的飞行时间成正比来分析离子,并测得样品分子的分子质量。对重组ⅩⅦ型人源胶原蛋白单一条带进行MALDI-TOF/TOF检测,分析其氨基酸组成[12]。
2 结果与讨论
2.1 重组人源胶原蛋白XVII的设计及高效表达
研究中基于人源胶原蛋白ⅩⅦ的序列及结构信息分别设计了10种人源胶原蛋白ⅩⅦ片段,包括:ⅩⅦ-1、ⅩⅦ-2、ⅩⅦ-3、ⅩⅦ-4、ⅩⅦ-5、ⅩⅦ-6、ⅩⅦ-7、ⅩⅦ-8、ⅩⅦ-9、ⅩⅦ-10。如表1所示,10种设计的人源胶原蛋白ⅩⅦ片段之间存在一些重叠交叉的氨基酸序列,其中,所有片段均含有人源胶原蛋白ⅩⅦ的567～621氨基酸序列。通过对人源胶原蛋白ⅩⅦ的不同氨基酸片段进行系统组装,基于E.coli异源表达,筛选可以高效异源表达的人源胶原蛋白ⅩⅦ片段。采用酶切位点,将人源胶原蛋白基因ⅩⅦ-1至ⅩⅦ-10分别连接至质粒pRSFDuet-1,将重组质粒分别转化工程菌株E.coli BL21ΔdacB[10],分别构建10株可表达重组人源胶原蛋白ⅩⅦ的基因工程菌E.coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-1、E.coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-2、E.coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-3、E.coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4、E.coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-5、E.coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-6、E.coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-7、E.coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-8、E.coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-9、E.coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-10。如图1-a所示,重组人源胶原蛋白ⅩⅦ-4的表达水平最高,显著高于其他9个重组人源胶原蛋白ⅩⅦ的表达水平。同时,针对重组人源胶原蛋白ⅩⅦ-4的目的条带采用MALDI-TOF MS进行鉴定,结果显示该目的条带即为人源胶原蛋白ⅩⅦ-4(图1-b)。本研究中从10个不同人源胶原蛋白片段ⅩⅦ-1、ⅩⅦ-2、ⅩⅦ-3、ⅩⅦ-4、ⅩⅦ-5、ⅩⅦ-6、ⅩⅦ-7、ⅩⅦ-8、ⅩⅦ-9、ⅩⅦ-10中表达后筛选获得重组人源胶原蛋白基因片段ⅩⅦ-4,其具有高效表达水平。该重组人源胶原蛋白基因片段ⅩⅦ-4,由于其特定的序列组成,促使其可以在E.coli中高效表达。重组人源胶原蛋白片段ⅩⅦ-4的氨基酸组成为:567～621 aa、651～700 aa、906～921 aa、950～972 aa、1 438～1 482 aa。但其他基因片段由于其自身序列组成等原因,其蛋白表达水平较低,没有后期产业化的实际意义。目前,关于人源胶原蛋白ⅩⅦ的异源表达的论文报道较少,主要集中在其他类型(如Ⅰ型、Ⅲ型等)。滕飞等[13]通过在N端融合了小分子泛素样修饰蛋白SUMO的方式实现了重组I型人源化胶原蛋白片段hCOL1A1在E.coli BL21(DE3)中可溶性异源胞内表达。李瑛琦等[14]基于人Ⅲ型胶原蛋白α1链,以(Gly-X-Y)为最小研究单元,设计了类人胶原蛋白基因,在E.coli中实现了可溶性表达。
M-标准分子质量蛋白(Marker)。
a-重组人源胶原蛋白ⅩⅦ的表达;b-重组人源胶原蛋白
ⅩⅦ-4的MALDI-TOF MS鉴定
图1 重组人源胶原蛋白ⅩⅦ-4的表达及MALDI-TOF MS鉴定
Fig.1 Expression of recombinant human collagen ⅩⅦ-4 and MALDI-TOF MS analysis
注:对照为E.coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1,红色表示测定后的匹配肽。
2.2 培养基优化提高重组人源胶原蛋白ⅩⅦ的表达水平
培养基成分是影响工程菌生长和蛋白表达外源蛋白的重要因素,能够影响蛋白酶的活性、分泌和表达水平,选择一个合适的发酵培养基十分重要。不同的培养基具有不同的特性,例如:LB培养基为E. coli常规培养基,可用于重组蛋白表达;M9培养基为基本培养基,常用于重组蛋白表达;SB培养基比LB培养基更丰富,适用于蛋白质的表达和菌体高密度培养等;与LB和SB培养基相比较,TB培养基能支持更高的菌体密度,适用于重组蛋白表达;与LB培养基相比较,SOC培养基和SOB培养基含有额外的镁离子和葡萄糖,可以促进细胞的快速增值。本研究中,根据系统研究了上述6种不同培养基对E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4中重组人源蛋白表达的影响。如图2所示,在16 h时,LB培养基、SB培养基、M9培养基、TB培养基、SOC培养基和SOB培养基对应的总蛋白质量浓度分别为(0.22±0.04)、(0.37±0.02)、(0.10±0.02)、(0.61±0.04)、(0.34±0.05)、(0.30±0.09)g/L。其中,在16 h时,采用TB培养基时,E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4的总蛋白浓度最高,为采用M9培养基时总蛋白浓度的6.10倍。同时,在16 h时,采用TB培养基时,E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4的胞外蛋白质量浓度为(0.10±0.01)g/L,均高于其他5种培养基。在16 h时,LB培养基、SB培养基、M9培养基、TB培养基、SOC培养基和SOB培养基对应的菌浓OD600值分别为(1.57±0.1)、(2.34±0.22)、(1.98±0.05)、(2.97±0.16)、(2.20±0.29)、(2.12±0.07)。结果表明:与其他5种培养基相比较,采用TB培养基时,更有利于E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4的生长。由于M9培养基中仅含无机盐和葡萄糖,缺乏氨基酸、维生素等必需有机成分,导致E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4生长速率显著低于营养丰富的其他培养基。根据E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4的生长情况和重组人源胶原蛋白的表达量,选择TB培养基作为发酵初始培养基。LOZANO TEROL等[15]研究了E. coli BL21 wt在M9培养基和复合TB7培养基(含有蛋白胨)上重组蛋白表达和细胞生长的情况,研究结果发现,TB7培养基可显著促进细胞的生长和重组蛋白的合成。
图2 培养基优化提高重组人源胶原蛋白ⅩⅦ-4表达
Fig.2 Improving recombinant human collagen ⅩⅦ-4 expression through media optimization
2.3 不同碳源对重组人源胶原蛋白ⅩⅦ表达的影响
在筛选获得的TB培养基的基础上,研究不同营养组分对重组大肠杆菌生长及重组人源胶原蛋白表达量的影响。不同营养组分包括:碳源种类、氮源种类、无机盐种类。碳源是用于构成微生物细胞和代谢产物中碳素来源的营养物质,它既能构成菌体细胞和代谢产物,又能为微生物提供生命活动中所需的能量。由于微生物生理特性不同,利用碳源的种类可能存在一定差异[16]。本研究中,根据E. coli的生长需求研究了5种不同碳源对E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4中重组人源蛋白表达的影响,包括:甘油、麦芽糖、乳糖、糊精和蔗糖。如图3所示,在16 h时,甘油、麦芽糖、乳糖、糊精和蔗糖对应的总蛋白质量浓度分别为(0.61±0.04)、(0.58±0.16)、(0.51±0.04)、(0.53±0.04)、(0.42±0.02)g/L。其中,以甘油为唯一碳源时重组E. coli总蛋白质量浓度最高。其中,采用甘油作为唯一碳源时为采用蔗糖作为唯一碳源时总蛋白浓度的1.44倍。同时,在16 h时,采用甘油作为唯一碳源时,E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4的胞外蛋白质量浓度为(0.10±0.01)g/L,均高于其他4种培养基。在16 h时,甘油、麦芽糖、乳糖、糊精和蔗糖对应的菌浓OD600值分别为(4.59±0.30)、(5.13±0.20)、(3.97±0.17)、(4.98±0.35)、(4.06±0.19)。结果表明:与其他4种培养基相比较,采用甘油作为唯一碳源时,更有利于E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4的生长。重组E. coli在以麦芽糖为唯一碳源的发酵培养基中生长最快,在24 h时OD600值最高,为(5.47±0.17),表明该条件下细胞增殖活跃,但是蛋白浓度和SDS-PAGE显示其生产重组人源胶原蛋白的量少。这表明以麦芽糖为唯一碳源时,重组E. coli中代谢资源主要用于细胞生长,而非蛋白合成。甘油是一种非磷酸烯醇式丙酮酸转移酶系统的碳源,是生物柴油合成的副产物,被广泛应用[17]。甘油能供给细胞的生长和蛋白质的合成,重组人源胶原蛋白的合成更倾向于甘油作为碳源。糊精作为唯一碳源时生长速度快,但总蛋白浓度和重组人源胶原蛋白产量较低。乳糖和蔗糖作为发酵培养基唯一碳源时细胞生长和蛋白合成方面未达到较高水平,细胞生长速度较慢,表明这些碳源在重组E. coli中的利用效率有限。LOZANO TEROL等[15]研究了不同碳源补加对E. coli BL21 wt中重组蛋白表达水平的影响,结果发现:甘油作为碳源补加可以增强重组蛋白的合成,这与本研究的结果一致,进一步验证了甘油在重组蛋白高效表达方面的应用。
图3 不同碳源对重组人源胶原蛋白ⅩⅦ-4表达的影响
Fig.3 Effects of different carbon sources on recombinant human collagen ⅩⅦ-4 expression
2.4 不同氮源对重组人源胶原蛋白ⅩⅦ表达的影响
氮源主要用于菌体细胞物质(氨基酸、蛋白质和核酸等)和含氮代谢物的合成。培养基中使用的氮源可以分为两大类:有机氮源和无机氮源。其中,E.coli可以利用多种氮源进行生长,但优先消耗无机铵盐[18]。本研究中,根据E.coli的生长需求研究了6种不同氮源对E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4中重组人源蛋白表达的影响,包括:TB培养基中的复合氮源、酵母粉、牛肉膏、玉米浆粉、蛋白胨和硫酸铵。如图4所示,在16 h时,TB培养基中的复合氮源、酵母粉、牛肉膏、玉米浆粉、蛋白胨和硫酸铵对应的总蛋白质量浓度分别为(0.61±0.04)、(0.26±0.03)、(0.21±0.01)、(0.22±0.02)、(0.20±0.03)、(0.10±0.00)g/L。其中,在16 h时,采用TB培养基中的复合氮源时,E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4的总蛋白浓度最高,为采用硫酸铵作为唯一氮源时总蛋白浓度的6.10倍。同时,在16 h时,采用TB培养基中的复合氮源时,E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4的胞外蛋白质量浓度为(0.10±0.01 g/L,均高于其他5种。在16 h时,TB培养基中的复合氮源、酵母粉、牛肉膏、玉米浆粉、蛋白胨和硫酸铵对应的菌浓OD600值分别为(4.59±0.30)、(2.13±0.27)、(2.68±0.11)、(2.02±0.03)、(2.22±0.31)、(1.23±0.10)。结果表明:与其他5种氮源种类相比较,采用TB培养基中的复合氮源时,更有利于E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4的生长。复合氮源下,E. coli生长最快,24 h时OD600值最高,且胞内、胞外蛋白量积累最多;酵母粉、牛肉膏、玉米浆粉作为氮源时,生长情况良好,蛋白量也有一定积累;蛋白胨组后期蛋白量较为突出;而硫酸铵作为唯一氮源时,E. coli生长缓慢,OD600值与蛋白量均最低。整体表明,有机氮源(如复合氮源、酵母粉等)更利于E. coli生长及蛋白合成,无机氮源硫酸铵的作用较弱。
图4 不同氮源对重组人源胶原蛋白ⅩⅦ-4表达的影响
Fig.4 Effects of different nitrogen sources on recombinant human collagen ⅩⅦ-4 expression
2.5 不同无机盐对重组人源胶原蛋白ⅩⅦ表达的影响
无机盐在生物细胞内一般含量很低,但是作用非常大。本研究中,根据E.coli的生长需求研究了3种不同无机盐对E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4中重组人源蛋白表达的影响,包括:氯化钠、氯化钾和氯化钙。如图5所示,在16 h时,不添加无机盐、氯化钠、氯化钾和氯化钙对应的总蛋白质量浓度分别为(0.61±0.04)、(0.37±0.06)、(0.47±0.04)、(0.34±0.03)g/L。其中,在16 h时,不添加无机盐时,E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4的总蛋白质量浓度最高,分别为添加氯化钠、氯化钾和氯化钙时总蛋白浓度的1.65、1.30、1.79倍。同时,在16 h时,不添加无机盐、氯化钠、氯化钾和氯化钙时,E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4的胞外蛋白浓度分别为(0.10±0.01)、(0.15±0.02)、(0.15±0.02)、(0.15±0.01)g/L。在16 h时,不添加无机盐、氯化钠、氯化钾和氯化钙对应的菌浓OD600分别为(4.59±0.30)、(3.92±0.29)、(3.50±0.57)、(4.04±0.14)。结果表明:与额外添加无机盐相比较,不添加无机盐更有利于E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4的生长。氯化钠、氯化钙和氯化钾的添加使胞外蛋白浓度增加,但是生长情况较不额外添加无机盐时差。额外添加无机盐后,细胞生长受到抑制,蛋白浓度降低。3种无机盐均无法提高重组人源胶原蛋白的产量。
图5 不同无机盐对重组人源胶原蛋白ⅩⅦ-4表达的影响
Fig.5 Effects of different inorganic salts on recombinant human collagen ⅩⅦ-4 expression
金属离子在调节代谢途径和某些酶以及信号分子的活性中起着关键作用。本研究中,根据E.coli的生长需求研究了3种不同金属离子对E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4中重组人源蛋白表达的影响,包括:硫酸锌、硫酸铜、硫酸镁。如图6所示,在16 h时,不添加金属离子、硫酸锌、硫酸铜、硫酸镁对应的总蛋白质量浓度分别为(0.61±0.04)、(0.25±0.03)、(0.17±0.03)、(0.69±0.04)g/L。其中,在16 h时,添加硫酸镁时,E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4的总蛋白质量浓度最高,分别为不添加金属离子、添加硫酸锌、添加硫酸镁时总蛋白质量浓度的1.13、2.76和4.06倍。同时,在16 h时,不添加金属离子、添加硫酸锌、添加硫酸铜和添加硫酸镁时,E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4的胞外蛋白质量浓度分别为(0.10±0.01)、(0.06±0.01)、(0.11±0.01)和(0.16±0.01)g/L。在16 h时,不添加金属离子、添加硫酸锌、添加硫酸铜和添加硫酸镁对应的菌浓OD600值分别为(4.59±0.30)、(4.53±0.20)、(2.06±0.17)、(4.03±0.15)。结果表明:与额外添加金属离子相比较,不添加金属离子更有利于E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4的生长,但添加硫酸镁时更有利于重组人源蛋白表达。添加硫酸锌后,细胞生长速度与不添加金属离子时相近,但重组人源胶原蛋白的质量浓度显著降低。添加硫酸亚铁、硫酸铁、硫酸锰和硫酸铜时,细胞生长缓慢,且蛋白质量浓度较低,均不适合用于重组人源胶原蛋白的表达。添加硫酸镁对细胞生长有一定抑制作用,但重组人源胶原蛋白质量浓度与不添加金属离子时相近。同时,QIN等[19]研究发现,添加Zn2+或Mg2+也不利于重组纤维二糖差向异构酶在E. coli中的高效表达,进一步说明这2种金属离子对于重组E. coli生产重组蛋白具有一定的抑制作用。
图6 不同金属离子对重组人源胶原蛋白ⅩⅦ-4表达的影响
Fig.6 Effects of different metal ions on recombinant human collagen ⅩⅦ-4 expression
2.6 不同诱导剂浓度对重组人源胶原蛋白ⅩⅦ表达的影响
IPTG是β-半乳糖苷酶底物的类似物,具有极强的诱导性。在IPTG诱导下,诱导物可与阻遏蛋白形成复合物,使阻遏蛋白构象发生改变,从而不能与目的基因结合,进而使目的基因高效表达。IPTG的浓度对于E. coli高效表达重组蛋白具有重要意义,适当的IPTG浓度能够有效增加重组蛋白在E.coli中的表达水平[19-20]。由于IPTG对菌体具有一定的毒性,超过浓度可能导致细胞死亡。本研究中,根据E.coli的生长需求研究了4种不同IPTG浓度对E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4中重组人源蛋白表达的影响,包括:0.1、0.2、0.5、1 mmol/L。如图7所示,在16 h时,1、0.5、0.2、0.1 mmol/L对应的总蛋白质量浓度分别为(0.48±0.07)、(0.45±0.02)、(0.44±0.02)、(0.51±0.11)g/L。其中,在16 h时,添加1 mmol/L IPTG时,E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4的总蛋白浓度最高,分别为添加0.1、0.2、0.5 mmol/L IPTG时总蛋白浓度的1.07、1.09、0.94倍。同时,在16 h时,添加0.1、0.2、0.5和1 mmol/L IPTG时,E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4的胞外蛋白质量浓度分别为(0.11±0.01)、(0.13±0.01)、(0.14±0.01)和(0.20±0.08)g/L。在16 h时,添加0.1、0.2、0.5和1 mmol/L IPTG对应的菌浓OD600值分别为(3.84±0.09)、(3.40±0.22)、(3.70±0.27)和(4.11±0.30)。综合不同阶段生长情况来看,1 mmol/L IPTG条件下,菌体生物量、总蛋白及胞外蛋白表达水平均整体最优。不同重组蛋白的表达对IPTG的浓度要求存在较大差异。ZHANG等[20]研究了不同IPTG添加浓度对重组E. coli全细胞(表达重组酶)催化生产乳糖二岩藻四糖的影响,最终确定50 μmol/L IPTG时乳糖二岩藻四糖的产量最高。
图7 不同IPTG浓度对重组人源胶原蛋白ⅩⅦ-4表达的影响
Fig.7 Effects of different IPTG concentrations on recombinant human collagen ⅩⅦ-4 expression
2.7 不同诱导温度对重组人源胶原蛋白ⅩⅦ表达的影响
温度是影响工程菌生长、质粒稳定性和重组产物形成的重要因素。E. coli的最适生长温度为37 ℃,在较高温度下,细胞的生长速率较高,发酵过程中容易积累代谢副产物,同时会抑制细胞的生长和目的产物的表达[21]。本研究中,根据E.coli的生长需求研究了4种不同诱导温度(20、25、30、37 ℃)对E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4中重组人源蛋白表达的影响。如图8所示,在16 h时,20、25、30、37 ℃对应的总蛋白质量浓度分别为(0.48±0.07)、(0.52±0.03)、(0.34±0.11)、(0.28±0.01)g/L。其中,在16 h时,25 ℃条件下,E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4的总蛋白质量浓度最高,分别为20、30、37 ℃时总蛋白浓度的1.08、1.53、1.86倍。同时,在16 h时,20、25、30、37 ℃条件下,E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4的胞外蛋白质量浓度分别为(0.11±0.01)、(0.12±0.01)、(0.12±0.05)和(0.14±0.01)g/L。在16 h时,20、25、30、37 ℃条件下对应的菌浓OD600值分别为(3.84±0.09)、(4.82±0.26)、(3.52±0.10)和(3.07±0.45)。结果表明:诱导温度为25 ℃时更有利于E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4的生长。同样的,王晓静等[22]研究发现,随着诱导温度的升高,重组E. coli的催化生产莱鲍迪苷M的转化率逐渐降低,也说明了诱导温度偏高不利于重组蛋白的高效表达,进一步降低了莱鲍迪苷M的产量(诱导温度为16 ℃时最高)。
图8 不同诱导温度对重组人源胶原蛋白ⅩⅦ-4表达的影响
Fig.8 Effects of different induction temperatures on recombinant human collagen ⅩⅦ-4 expression
2.8 不同吐温-80浓度对重组人源胶原蛋白ⅩⅦ胞外分泌的影响
吐温-80的添加能增加重组E. coli细胞的通透性同时不引起细胞裂解,能够提高重组人源胶原蛋白的胞外生产[23]。本研究中,根据E.coli的生长需求研究了4种不同吐温-80添加量对E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4中重组人源蛋白表达的影响,包括:添加1%、0.5%、0.2%和不添加吐温-80。如图9所示,在16 h时,添加1%、0.5%、0.2%和不添加吐温-80对应的总蛋白质量浓度分别为(0.48±0.05)、(0.39±0.02)、(0.45±0.01)、(0.47±0.07)g/L。其中,在16 h时,添加1%吐温-80条件下,E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4的总蛋白质量浓度最高,分别为添加0.5%、0.2%和不添加吐温-80时总蛋白浓度的1.23、1.07、1.02倍。同时,在16 h时,添加1%、0.5%、0.2%和不添加吐温-80条件下,E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4的胞外蛋白质量浓度分别为(0.11±0.01)、(0.20±0.06)、(0.16±0.04)、(0.13±0.04)g/L。在16 h时,添加1%、0.5%、0.2%和不添加吐温-80条件下对应的菌浓OD600值分别为(3.84±0.09)、(3.10±0.19)、(3.11±0.25)和(3.71±0.18)。结果表明:不添加吐温-80时更有利于E. coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4的生长,添加吐温-80有利于重组人员蛋白的表达和分泌。吐温-80的添加对重组E. coli的生长状况影响较小,不同添加量时重组E. coli的生长状况接近。不添加吐温-80时,胞外蛋白质量浓度较低。随着添加吐温-80浓度的提升,胞外蛋白量增加,且胞外蛋白电泳出现目标蛋白条带,表明重组人源胶原蛋白的胞外分泌量提高。添加吐温-80和甘氨酸等可以促进E. coli胞外生产重组蛋白。QIN等[19]通过添加甘氨酸提高重组E. coli的纤维二糖差向异构酶的胞外蛋白生产水平,研究发现当添加70 mmol/L甘氨酸时其胞外蛋白浓度达到最大。
图9 不同吐温-80添加量对重组人源胶原蛋白ⅩⅦ-4胞外表达的影响
Fig.9 Effects of different added tween-80 concentrations on extracellular expression of recombinant human collagen ⅩⅦ-4
2.9 基于正交试验优化提高重组人源胶原蛋白ⅩⅦ的表达水平
温度是影响工程菌生长、质粒稳定性和重组产物形成的重要因素。吐温-80的添加能增加重组E. coli细胞的通透性同时不引起细胞裂解,能够提高重组人源胶原蛋白的胞外生产。镁离子是细胞生长不可或缺的微量元素,对于维持微生物细胞的正常代谢和生长至关重要。在发酵过程中,镁离子的添加可以显著提升细胞的生长速度和生物量,提高发酵效率。根据上述实验结果,选择培养温度、吐温-80浓度、硫酸镁添加量3因素3水平进行正交试验设计,制作L9(33)正交表,根据正交表进行重组人源胶原蛋白的发酵实验(表2)。
表2 L9(33)正交试验设计
Table 2 L9 (33) orthogonal experiment design
实验编号培养温度/℃吐温-80浓度/%硫酸镁添加量/(g/L)1200.202200.50.5320114250.20.55250.51625107300.218300.5093010.5
如图10和表3所示,培养温度25 ℃、吐温-80添加量0.5%、硫酸镁添加量1 g/L时,胞外蛋白质量浓度最高。同时,SDS-PAGE显示的目的蛋白的条带最明显(图10-b),证明在该条件下的胞外重组人源胶原蛋白表达量最高。在25 ℃条件下,重组E. coli能实现重组人源胶原蛋白的高效表达。同时,1 g/L硫酸镁的添加能提升生长速度和生物量。0.5%吐温-80的添加,能促进重组人源胶原蛋白ⅩⅦ的胞外分泌。在此条件下,重组E. coli的重组人源胶原蛋白ⅩⅦ的胞外生产达到最佳水平,本研究首次实现了重组人源胶原蛋白ⅩⅦ的高效胞外表达。
M-标准分子质量蛋白(Marker)。
a-重组大肠杆菌生长情况和蛋白质量浓度;b-胞外上清液的SDS-PAGE图
图10 正交试验增强重组E.coli生长和蛋白表达
Fig.10 Optimization of recombinant E.coli growth and protein expression through orthogonal experimental design
表3 正交试验设计结果
Table 3 Orthogonal experimental design results
实验编号培养温度/℃吐温-80浓度/%硫酸镁添加量/(g/L)总蛋白质量浓度/(g/L)胞外蛋白质量浓度/(g/L)OD6001200.200.35±0.020.11±0.012.37±0.132200.50.50.37±0.020.11±0.012.31±0.11320110.36±0.040.11±0.032.41±0.084250.20.50.40±0.020.12±0.012.68±0.395250.510.53±0.020.22±0.032.91±0.25625100.48±0.040.16±0.022.77±0.147300.210.43±0.060.13±0.012.97±0.168300.500.38±0.020.11±0.012.80±0.1093010.50.50±0.080.17±0.102.89±0.06
3 结论
E. coli的生长和蛋白调控受到多种因素的综合影响,ⅩⅦ型人源胶原蛋白的异源合成表达优化具有重要意义。研究中构建了重组菌株E.coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4,对其发酵优化进行了系列研究,实现了重组人源胶原蛋白ⅩⅦ的高效胞外表达。研究发现培养基种类、碳源、氮源、无机盐、金属离子、诱导剂浓度、诱导温度、吐温-80添加量等条件对E.coli BL21 ΔdacB pRSFDuet-1-ⅩⅦ-4生产重组人源胶原蛋白具有重要意义。其中,获得的最优生产条件为:采用TB培养基、添加1 g/L硫酸镁、0.5%吐温-80、诱导剂浓度1 mmol/L、诱导温度25 ℃。在该最优条件下,重组人源胶原蛋白的胞外表达量最高。重组人源胶原蛋白的表达量与菌体生长基本呈正相关关系。温度在一定程度影响蛋白酶的活性和蛋白折叠的准确性。在IPTG诱导下,诱导物可与阻遏蛋白形成复合物,使阻遏蛋白构象发生改变,从而不能与目的基因结合,进而使目的基因高效表达,足量诱导剂的添加使基因获得充分表达。研究结果对重组人源胶原蛋白的工业化生产及应用具有指导意义。
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