野山杏仁在我国属于中药苦杏仁中的一类,野山杏仁及杏仁产品表现出多重生物活性,包括抗氧化作用、血脂调节及肿瘤抑制等功效[1]。除了具有良好的药用作用外,目前部分杏仁用来榨油,由此产生的加工副产物杏仁粕蛋白质含量丰富,野山杏仁粕蛋白质含量达30%以上。然而,长期以来野山杏仁粕的蛋白质资源浪费极大。近年来国内外研究者多对杏仁蛋白开展了初步研究,刘媛等[2]探究不同蛋白酶的种类以及不同酶解条件对脱脂杏仁粕DPPH自由基清除率的影响;张玥等[3]优化苦杏仁粕蛋白的制备工艺,提高杏仁粕蛋白的溶解率。TANWAR等[4]通过小鼠饮食比较脱毒前后苦杏仁蛋白质消化率、利用率等参数,研究发现脱毒杏仁蛋白可作为补充原料提高食品质量。
目前研究证实,植物蛋白经酶解处理可产生具有独特氨基酸序列的功能性肽段,包括具有抗氧化特性、抗菌活性的多肽组分或血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)的抑制肽等[5]。近年来随着杏仁产业规模的扩大和加工技术的进步,杏仁蛋白资源的高值化利用显得十分重要,探究杏仁蛋白水解特性及其水解物中多肽的功能活性,为开发新型生物活性肽提供新的思路[6-7]。值得注意的是,野山杏仁作为我国特有杏仁种类,可为开发具有独特功能活性的野山杏仁肽提供依据。
随着分析科学的高速发展,柱层析法、HPLC、毛细管电泳法、超滤法等用于分离检测的技术手段不断发展。近年来,LC-MS/MS日趋成熟,实现在复杂体系中确定蛋白质并对其中多肽序列、分子质量等方面进行准确解析[8]。管晶晶等[9]采用LC-MS/MS肽组学技术鉴定了鲣鱼酶解产物的各组分肽段长度,共鉴定出2 395条肽段,鉴定出来的肽段大部分集中在8～18肽,谷氨酸为多肽中含量最高的氨基酸。张钺等[10]利用LC-MS/MS鉴定奶牛胎盘酶解产物中蛋白和肽段,并进行抗氧化活性预测,结果显示不同蛋白酶酶解产物蛋白种类不同,肽段长度和种类也各不相同,含有不同的氨基酸残基。LC-MS/MS同时具有色谱的高分离特性和质谱强大的定性能力,目前已经成为了食品检测分析、食品安全等领域重要的系统分析手段。
经文献调研,尚未有研究结合LC-MS/MS技术与多肽组学De novo鉴定野山杏仁的特征性多肽,也未发现对杏仁粕中抗氧化指标成分进一步分析的相关研究。本研究通过LC-MS/MS与多肽组学结合,系统性地对酶解后野山杏仁粕的多肽组分进行序列鉴定,表征杏仁多肽的多肽特性,对杏仁粕的功能活性进行预测,后续比较不同模拟消化阶段杏仁粕多肽的体外抗氧化活性,综合利用杏仁粕蛋白资源,为开发具有抗氧化活性的杏仁肽提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
杏仁粕,河北承德露露股份有限公司。
芦丁、没食子酸、DPPH,上海源叶生物科技有限公司;Tris-HCl,美国Bio-Rad公司;福林酚、FeSO4、Al(NO3)3、NaNO2、NaOH、Na2CO3,上海麦克林生化科技有限公司;H2O2,国药集团化学试剂有限公司;水杨酸,北京索莱宝试剂有限公司;无水乙醇、邻苯三酚、ABTS,北京迈瑞达公司;以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
Easy-nLC 1200/Q Exactive HF-X液相色谱-质谱联用仪,美国Thermo Fisher Scientific公司;RP-C18液相色谱柱,美国Column Technology公司;Infinite M200 PRO NanoQuan多功能酶标仪,瑞士Tecan公司;NovaSafety盖勃离心机,德国Funke Gerber公司;恒温水浴锅,天津泰斯特仪器有限公司;PL403电子天平,上海梅特利-托利多仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 原料制备
参考张玥等[3]优化苦杏仁粕蛋白的制备工艺的方法。以水解率作为响应指标,采用3因素3水平响应面设计试验,优化杏仁粕的最佳酶解工艺。取酶底比2 500 U/g、酶解时间2.5 h,酶解温度54 ℃,底物浓度16 mol/L,pH值7.5工艺条件下的酶解液进行体外消化模拟处理,进行胃肠消化模拟,分别在消化后0、2、4 h取样进行质谱检测。
1.3.2 LC-MS/MS检测样品前处理与分析条件
取1 000 μL的样品,10 kDa超滤管超滤,取小于10 kDa部分进行后续实验。
还原烷基化:移取1 μL 1 mol/L二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)溶液加入样品中,使其中的DTT终浓度为10 mmol/L,接着在56 ℃的水浴中还原1 h。后续移取2 μL 1 mol/L碘乙酰胺溶液加入样品中,使碘乙酰胺终浓度20 mmol/L,暗处室温反应40 min。移取1 μL 1 mol/L DTT溶液加入样品中,使DTT终浓度为10 mmol/L,以中和未反应的碘乙酰胺。
毛细管液相色谱条件:采用预柱(50 mm×150 μm内径,填充Reprosil-Pur 120 C18-AQ固定相,粒径3 μm)与分析柱(170 mm×150 μm内径,填充Reprosil-Pur 120 C18-AQ固定相,粒径1.9 μm)进行分离。流动相A相:0.1%(体积分数,下同)的甲酸水溶液;B相:0.1%的甲酸乙腈-水溶液(乙腈体积分数为80%)。100%的A相充分平衡柱子后,样品经自动进样器进入色谱柱,随后以600 nL/min的流速进行梯度洗脱,总运行时间66 min。洗脱程序:0～2 min,4%～8%B;2～45 min,8%～28%B;45～55 min,28%～40%B;55～56 min,40%～95%B;56～66 min 95%B。
质谱条件:1)一级质谱参数:分辨率70 000;自动增益控制目标3e6;最大喷射时间50 ms;扫描范围100～1 500 m/z。2)二级质谱参数:分辨率17 500;自动增益控制目标1e5;最大喷射时间50 ms;选择强度高的前20个母离子,碰撞能量28。
数据库检索:使用软件PEAKS De novo解析多肽序列。参数如下:固定修饰Carbamidomethyl (C,半胱氨酸的脲基甲基化);可变修饰Oxidation (M,甲硫氨酸的氧化)、Acetyl (Protein N-term,蛋白N端的乙酰化);酶切方式:非特异性酶切;遗漏酶切位点2;一级质谱误差20 ppm;二级质谱误差0.02 Da。筛选合适的多肽进行化学合成。
1.3.3 抗氧化能力测定
DPPH自由基清除率:在2.0 mL、0.1 mmol/L的DPPH溶液(95%乙醇为溶剂)中分别加入2 mL不同消化时间的杏仁粕酶解液,混匀,室温下静置30 min,517 nm处测定吸光度值A1;空白对照加入2 mL蒸馏水代替样品记录吸光度值为A0;再用2 mL样品与2.0 mL 95%的乙醇混合液为样品对照吸光度值A2。DPPH自由基清除率的计算如公式(1)所示:
DPPH自由基清除率
(1)
羟自由基(·OH)清除率:取不同消化时间的酶解液各0.5 mL,依次加入10 mmol/L FeSO4溶液0.5 mL、10 mmol/L水杨酸-乙醇溶液0.5 mL、蒸馏水3.5 mL,随后加入10 mmol/L H2O2溶液5 mL,摇匀后静置30 min,536 nm处测定吸光度值A1;蒸馏水代替水杨酸溶液记录吸光度值为A2;空白对照组加入蒸馏水代替样品记录吸光度值为A0。·OH清除率的计算如公式(2)所示:
·OH清除率
(2)
超氧阴离子自由基
清除率:采用邻苯三酚法,将4 mL 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.2)于25 ℃水浴,预热20 min后依次加入到1 mL不同消化时间的酶解液中,再加入10 mmol/L邻苯三酚溶液(以0.1 mol/L HCl配制)1 mL,水浴5 min,混合液加入0.1 mL浓盐酸终止反应,325 nm处测吸光度值记为A1,空白对照组加入蒸馏水代替样品记录吸光度值为A0。·O2-清除率的计算如公式(3)所示:
·O2-清除率
(3)
ABTS阳离子自由基清除率:等量混合7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L K2S2O8溶液,混合液于避光处静置16 h。储备液为734 nm下吸光度值为0.7±0.02的无水乙醇稀释液。每10 μL不同酶解液与200 μL储备液混合均匀后避光反应6 min,734 nm条件下测吸光度值记为A1,空白对照组加入蒸馏水代替样品吸光度值记录为A0。ABTS阳离子自由基清除率的计算如公式(4)所示:
ABTS阳离子自由基清除率
(4)
1.4 数据处理
数据结果采用SPSS Statistics 17进行分析,Origin pro 2021及Chiplot进行绘图。
2 结果与分析
2.1 杏仁粕酶解产物多肽指纹图谱的分析比较
图1为杏仁粕酶解物3个不同消化阶段的总离子流图,离子流图热度图可反映样品在质谱检测过程中离子响应随洗脱时间的变化情况,其中横坐标为洗脱时间、纵坐标为峰强度[11]。通过总离子流图可以较直接地看出各组分的肽段丰度情况。
a-消化模拟0 h;b-消化模拟2 h;c-消化模拟4 h
图1 LC-MS/MS分析不同杏仁粕酶解产物的总离子流图
Fig.1 LC-MS/MS analysis of total ion chromatogram of enzymatic hydrolysis products of different almond meal
质谱的多肽序列如图2所示。在质谱扫描的每个循环生成1个一级谱图(即MS1),在一级谱图中设备会选择丰度/信号强度前20(即质谱参数设置中的TOP 20)进行碎裂,随后,这些被选中的肽段碎裂后产生的碎片,会被质谱记录并产生一张二级质谱图(即MS2或者MS/MS)。根据质谱数据分析图中多肽序列,所用解析序列为LPLMHQDWLDGK的肽。根据其特征谱峰代表的相对分子质量,匹配对应的b、y离子以及其他离子,可以推测出该质谱图对应的肽段为ISEELDH。
图2 酶解产物的多肽组成示例图
Fig.2 Example diagram of the polypeptide composition of the enzymatic hydrolysis product
2.2 杏仁粕多肽的分子质量分布和长度分析
肽段性质大多由多肽的分子质量和长度决定。而对部分活性功能来说,肽的长短可能也影响着对应活性的大小。由表1可知,每组样品均是<1 000 Da的肽段数量最多,在3个不同消化时间段都超过了60%,其中拥有较大分子质量的肽段(1 000～3 000 Da)在0 h的酶解液中最多。说明经过胃肠道消化,大分子质量肽段进一步分解,释放出更多低分子质量的肽,有望具备一定的生物活性。图3展示了3个不同消化时间段的样品中所有鉴定肽段的长度及其数量分布情况。总体而言,这些肽段的长度范围覆盖了从4～30肽,而主要的分布区间则集中在4～12肽之间。
表1 杏仁粕多肽分子质量分布
Table 1 Molecular weight distribution of almond meal peptides
分子质量范围/Da峰面积相对比例/%0 h2 h4 h﹤1 00065.8669.0171.421 000～1 50022.7318.3916.531 500～3 0006.415.836.313 000～5 0003.083.592.895 000～10 0001.923.182.85
图3 不同样本的多肽长度数量分布图
Fig.3 Distribution map of peptide length and quantity for different samples
2.3 多肽氨基酸组成比例分析
图4呈现了杏仁粕经消化酶解后多肽中氨基酸的比例分布,涵盖了共计20种不同的氨基酸。其中,甲硫氨酸(Met)在多肽中的含量最为丰富。在消化模拟0、2、4 h的组分中,Met的占比依次为19.3%、23.8%和16.9%。肽的抗氧化活性受氨基酸的组成、排列方式、分子质量、肽键特性以及空间构象等多种因素影响。研究发现,含有能够提供氢原子或电子的氨基酸残基(如Met)的肽,具备有效清除自由基的能力[10,12]。如图4所示,Pro的含量也较为突出,在3个模拟消化阶段分别为19.0%、13.4%、9.7%。其次是Leu、Asp、Val、Gly。Leu对于促进个体发育以及免疫机能的调控等方面发挥着重要作用。此外,酶解产物中的其他必需氨基酸含量也普遍偏高,这也证实其是一种优质原料多肽,具有较高的营养价值。
图4 三组杏仁粕样本的多肽氨基酸组成比例图
Fig.4 Example diagram of the polypeptide composition of three sets of almond meal samples
2.4 N/C端氨基酸类型分析
N端或C端不同特征氨基酸的组成对多肽的活性有重要影响。因此,统计肽段的N/C端氨基酸类型以及占比是有必要的。研究表明,Leu或Val的N端对氧化有更强的抑制效果。由图5可知,在对N端氨基酸进行研究分析时,Val、Leu等表现出明显的优势,主要为非极性脂肪族氨基酸。同时,Cys、Arg等氨基酸在肽链N末端出现的频率较低,表明这类氨基酸若位于肽链的N末端,其功能活性值可能较低。
图5 酶解产物的N端氨基酸组成比例及类别图
Fig.5 Composition ratio and category diagram of N-terminal amino acids in enzymatic hydrolysis products
在预测抗氧化活性方面,C端区域的氨基酸特性对生物活性具有更显著的影响。有研究证明,C端带正电荷的氨基酸能提升ACE的抑制活性[13]。对杏仁粕酶解产物的C端氨基酸进行分析研究,如图6所示,Arg、Pro、Leu等非极性脂肪族氨基酸和碱性氨基酸表现出明显的优势。同时发现,Cys、Thr等氨基酸排列在C末端时,肽段具备抗氧化和降血压生物活性的可能性不高。
图6 酶解产物的C端氨基酸组成比例及类别图
Fig.6 Composition ratio and category diagram of C-terminal amino acids in enzymatic hydrolysis products
2.5 疏水性、等电点和净电荷分析
在对多肽分子特性与构效关系的研究中,肽段等电特性及电荷分布对抗氧化活性的研究较少见。图7为不同消化模拟阶段肽段的等电点(isoelectric point,pI)和蛋白质疏水性分析。亲疏水性是活性肽的重要分子特性之一,肽段的亲疏水性质可能对其与自由基的结合效能产生影响。长期以来已经确定,富含蛋白质的食物苦味存在于肽中,并且蛋白质的水解经常伴随着苦味物质的形成。TAMURA等[14]研究发现,苦味随着化合物疏水性的增加而增加,这意味着苦味受体识别苦味肽的疏水性。同时有研究发现,肽净电荷与特定的生物活性相关,MA等[15]的研究报道了富含Val/Arg的肽,在一定范围内疏水性和抗菌效力之间的关系是线性的。同时有报道称,乳铁蛋白肽所展现的免疫调节及抗炎活性,在很大程度上与其带正电荷的区域相关联,这一区域能够特异性地结合并激活免疫细胞表面的趋化因子受体[16]。
a-消化模拟0 h;b-消化模拟2 h;c-消化模拟4 h
图7 肽段的等电点(pI)和蛋白质疏水性分析(GRAVY)
Fig.7 Analysis of isoelectric point (pI) and protein hydrophobicity of peptide segments (GRAVY)
2.6 活性肽的预测
活性肽作为源于蛋白质的多功能化合物,在调节身体机能(如抗感染、抗氧化、抗炎)及神经递质传递中扮演着关键角色。随着高通量测序技术和实验数据采集技术的发展,越来越多的多功能活性肽被鉴定出来[17]。多功能活性肽可以影响不同靶标来传递多种生理效果,对多种疾病均表现出治疗效果,鉴定识别这些具有治疗潜力的活性肽,成为了肽类药物研发的重点关注对象[18]。将杏仁粕酶解产物的所有多肽序列导入BIO-PEP数据库进行比对,可以通过匹配已知的活性肽片段得到杏仁粕酶解产物中所含有的特征生物活性肽[19]。表2展示了部分多肽序列中活性片段鉴定结果,发现杏仁粕酶解产物内含有抗氧化活性多肽。其共同特征为:具有LV、LP、LE或VVL等结构。抗氧化肽是一类具备抗氧化能力的活性肽,通过多种机制展现抗氧化功效,包括但不限于提供还原能力、消除自由基、保护免受氧化伤害以及调控体内抗氧化/解毒酶系统的活性。在这些机制中,清除自由基是最为核心的作用途径[20]。抗氧化肽在食品及药品领域中扮演双重角色:一方面,能够防止食品或药品中的成分遭受氧化;另一方面,作为关键的活性成分,抗氧化肽在生物体内发挥着重要的生理功能[21]。
表2 部分多肽活性预测片段结果
Table 2 Prediction results for the activity of selected peptide fragments
序号序列活性不稳定指数1KLPSTF抗血糖、抗氧化、抗炎68.952CPVVLVKPPKE抗血糖、抗氧化、抗炎52.153HGDVLRVPQ抑制性、抗氧化、抗炎61.574VVLVKPPKE抗血糖、抗氧化、抗炎18.715LLPPNP抗血糖、抗癌、抗氧化、抗炎67.736QLWDPFE抗氧化、抗血糖43.557TDFPLDF抗氧化、抗炎30.898LEDDGVLR抑制性、抗血糖、抗氧化51.099LLEDTVTFPGR抑制性、抗血糖、抗氧化56.06
2.7 不同消化时间杏仁粕酶解液抗氧化能力
DPPH自由基是一种稳定的含氮自由基[22]。DPPH自由基清除能力与杏仁粕酶解产物的抗氧化活能力成正相关,清除能力越强,说明它的抗氧化效果越好[23]。·O2-、·OH自由基、ABTS阳离子自由基等是常见的自由基种类,能够与活体细胞中任何分子快速发生氧化反应,或引起细胞组织损伤、蛋白质分解及机体发生衰老等问题[24]。表征杏仁粕酶解产物抗氧化能力的重要指标是其不同时间自由基的清除能力。
由图8可知,0 h的起始酶解液(未经消化模拟处理)的DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除率最高。相较于初始状态,随着消化过程的延长,2种自由基的清除效能逐渐减弱。这一现象可能因为抗氧化多肽不断分解,导致其含量逐渐减少,导致DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力降低。消化2 h时·O2-清除能力最高,在2～4 h随消化时间的延长清除能力逐渐下降,且最后时刻的清除率低于消化开始时刻,这是可能是由于在胃消化2 h时,体系可能已经趋于饱和,当过渡到肠消化阶段时,新的环境条件改变了体系的反应速率[25]。·OH清除率在0～4 h内呈逐步上升趋势,并且在4 h达到最大值。
图8 不同消化时间酶解液的抗氧化能力
Fig.8 Antioxidant capacity of enzymatic hydrolysates at different digestion times
注:不同小写字母字母表示差异显著(P<0.05)。
3 结论
本文研究了杏仁粕酶解产物在体外消化模拟3个阶段等的多肽组成,并采用LC-MS/MS技术分析鉴定不同模拟消化时间酶解产物的肽序列。分子质量<1 000 Da的肽段数量最多,占比超过了60%,鉴定出来的肽段大部分集中在5～12肽。Met为杏仁粕酶解液多肽含量最高的氨基酸,其次是Pro。杏仁肽在分析N端氨基酸时,Val、Leu等表现出明显的优势。在分析C端氨基酸时,Arg、Pro、Leu等表现出明显的优势。对多肽序列中活性片段进行活性肽预测,其共同特征为:抗氧化活性片段出现频率最高,共同具有LV、LP、LE或VVL等结构。最后,对不同体外消化阶段的杏仁粕酶解液进行抗氧化活性的测试,0 h样品的DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除率最高,但·OH清除率从0～4 h内呈上升趋势,在4 h样品中达到最大值,证明杏仁粕酶解液具有一定的抗氧化功能。本研究为野山杏仁及杏仁粕系列活性产物的深加工与应用开发奠定了必要的基础,可为开发具有抗氧化活性的杏仁肽提供理论依据。
[1] KAMIL A, OLIVER CHEN C Y.Health benefits of almonds beyond cholesterol reduction[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(27):6694-6702.
[2] 刘媛, 王健, 杨立亭, 等.响应面法优化杏仁粕蛋白酶解工艺及酶解液抗氧化活性研究[J].粮食与油脂, 2019, 32(10):13-17.LIU Y, WANG J, YANG L T, et al.Study on optimization of enzymatic hydrolysis of almond meal protein by response surface methodology and its antioxidant activity[J].Cereals &Oils, 2019, 32(10):13-17.
[3] 张玥, 李芳, 李菊梅, 等.葡萄糖修饰苦杏仁粕谷蛋白糖基化反应条件的优化[J].食品研究与开发, 2022, 43(3):94-101.ZHANG Y, LI F, LI J M, et al.Optimization of conditions for glycosylation of glucose modified gluten in bitter apricot kernel meal[J].Food Research and Development, 2022, 43(3):94-101.
[4] TANWAR B, MODGIL R, GOYAL A.Effect of detoxification on biological quality of wild apricot (Prunus armeniaca L.) kernel[J].Journal of the Science of Food and Agriculture, 2019, 99(2):517-528.
[5] 曲亭菲. 基于多肽组学与生物信息学的海参活性肽筛选及活性研究[D].大连:大连海洋大学, 2023.QU T F.The screening and activities research of sea cucumber-derived peptides based on peptidomics and bioinformatics[D].Dalian:Dalian Ocean University, 2023.
[6] 关利, 魏文志, 虞丹丹, 等.不同品种紫苏汁的生物活性成分及抗氧化性研究[J].中国调味品, 2024, 49(11):42-47.GUAN L, WEI W Z, YU D D, et al.Study on bioactive components and antioxidant activity of different varieties of Perilla frutescens juice[J].China Condiment, 2024, 49(11):42-47.
[7] 田丝雨, 杨晓君, 何笑娜, 等.伊吾县野山杏仁多肽的提取及其抗氧化活性的研究[J].中国食品添加剂, 2018(4):74-79.TIAN S Y, YANG X J, HE X N, et al.Study on the extraction and antioxidant activity of polypeptide from wild almond in Yiwu County[J].China Food Additives, 2018(4):74-79.
[8] GAO D, KIM J H, CHO C W, et al.Optimization of an extraction method for the simultaneous quantification of six active compounds in the aril part of Orostachys japonicus using HPLC-UV[J].Analytical Science and Technology, 2021, 34(4):153-159.
[9] 管晶晶, 冯勇强, 易佳雯, 等.基于液相色谱-串联质谱肽组学技术鉴定鲣鱼的多肽组成[J].现代食品科技, 2024, 40(12):377-385.GUAN J J, FENG Y Q, YI J W, et al.Peptide composition in skipjack tuna identified using LC-MS/MS peptidomics[J].Modern Food Science and Technology, 2024, 40(12):377-385.
[10] 张钺, 尤留超, 朱颍琨, 等.基于LC-MS/MS分析不同蛋白酶酶解奶牛胎盘产物差异及其抗氧化活性预测[J].中国农业大学学报, 2021, 26(11):133-141.ZHANG Y, YOU L C, ZHU Y K, et al.LC-MS/MS based comparative analysis and antioxidant activity prediction of cow placenta hydrolyzed by different proteases[J].Journal of China Agricultural University, 2021, 26(11):133-141.
[11] 范丽琪, 刘洋, 杨宝, 等.酸溶性大豆蛋白酶解产物的制备及特性研究[J].食品工业科技, 2025, 46(3):53-59.FAN L Q, LIU Y, YANG B, et al.Preparation and characteristics of acid-soluble soybean protein hydrolysates[J].Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(3):53-59.
[12] ZHANG M, HUANG T S, MU T H.Production and in vitro gastrointestinal digestion of antioxidant peptides from enzymatic hydrolysates of sweet potato protein affected by pretreatment[J].Plant Foods for Human Nutrition, 2019, 74(2):225-231.
[13] LI Y W, LI B.Characterization of structure-antioxidant activity relationship of peptides in free radical systems using QSAR models:Key sequence positions and their amino acid properties[J].Journal of Theoretical Biology, 2013, 318:29-43.
[14] TAMURA M, MIYOSHI T, MORI N, et al.Mechanism for the bitter tasting potency of peptides using O-aminoacyl sugars as model compounds[J].Agricultural and Biological Chemistry, 1990, 54(6):1401-1409.
[15] MA Q Q, JIAO W J, LV Y F, et al.Structure-function relationship of Val/Arg-rich peptides:Effects of net charge and Pro on activity[J].Chemical Biology &Drug Design, 2014, 84(3):348-353.
[16] FAN F J, TU M L, LIU M, et al.Isolation and characterization of lactoferrin peptides with stimulatory effect on osteoblast proliferation[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2017, 65(33):7179-7185.
[17] CONLON J M, MECHKARSKA M, LUKIC M L, et al.Potential therapeutic applications of multifunctional host-defense peptides from frog skin as anti-cancer, anti-viral, immunomodulatory, and anti-diabetic agents[J].Peptides, 2014, 57:67-77.
[18] LAMMI C, AIELLO G, BOSCHIN G, et al.Multifunctional peptides for the prevention of cardiovascular disease:A new concept in the area of bioactive food-derived peptides[J].Journal of Functional Foods, 2019, 55:135-145.
[19] 燕禹彤, 高春雨, 张晓梅, 等.不同酶处理的啤酒酵母蛋白酶解液功能肽组学分析[J].色谱, 2023, 41(11):995-1001.YAN Y T, GAO C Y, ZHANG X M, et al.Functional peptidomics analysis of Saccharomyces pastorianus protein hydrolysates based on different enzyme treatments[J].Chinese Journal of Chromatography, 2023, 41(11):995-1001.
[20] FENG G Z, WU J, YANG H L, et al.Discovery of antioxidant peptides from amphibians:A review[J].Protein and Peptide Letters, 2021, 28(11):1220-1229.
[21] WU R B, HUANG J F, HUAN R, et al.New insights into the structure-activity relationships of antioxidative peptide PMRGGGGYHY[J].Food Chemistry, 2021, 337:127678.
[22] 薛蕾. 苦杏仁蛋白及抗氧化活性肽制备工艺研究[D].杨凌:西北农林科技大学, 2012.XUE L.Study on preparation of bitter almondprotein and antioxidative oligopeptides[D].Yangling:Northwest Agriculture &Forestry University, 2012.
[23] SO V, POCASAP P, SUTTHANUT K, et al.Effect of harvest age on total phenolic, total anthocyanin content, bioactive antioxidant capacity and antiproliferation of black and white glutinous rice sprouts[J].Applied Sciences, 2020, 10(20):7051.
[24] 徐青, 安松, 李玉娇, 等.不同产地紫果百香果主要功能成分含量及抗氧化活性研究[J].中国果树, 2023(5):76-83.XU Q, AN S, LI Y J, et al.Contents of main functional components and antioxidant activity of purple passion fruit(Passiflora edulis f.edulis) from different habitats[J].China Fruits, 2023(5):76-83.
[25] JIANG Y R, MAO S Q, HUANG W S, et al.Phenylethanoid glycoside profiles and antioxidant activities of Osmanthus fragrans lour.flowers by UPLC/PDA/MS and simulated digestion model[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2016, 64(12):2459-2466.