副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是革兰氏阴性菌,菌体呈杆状、弧状或者丝状,有鞭毛,具有较强的运动能力,不产气,无芽孢和荚膜[1]。该菌广泛存在于河口、近海岸海水、海产品中,是常见的食源性致病菌,其可形成抗逆性强的生物膜[2]。生物膜是胞外聚合物将细菌细胞共同黏附在生物或非生物表面的附着聚集体,胞外聚合物主要由胞外多糖、胞外蛋白、脂质和胞外DNA组成[3]。生物膜在微生物的污染和致病机制中起着重要作用[4]。副溶血弧菌生物膜形成主要由luxS/AI-2介导的群体感应系统调控[5],luxS基因缺失株的群体感应信号分子AI-2的产生显著下降,与生物膜形成、抗生素耐药性的相关基因显著下调,说明luxS基因在副溶血弧菌生物膜形成中起重要作用[6]。
植物精油(essential oil,EO)作为植物来源的次级代谢产物,是从芳香植物中提取的重要天然产物[7]。目前研究者已在大约60个科的不同属中挖掘出一些具有良好的抗菌和抗氧化活性的EO,已知在制药和化妆品工业中具有高应用价值的EO主要来自于蒜科、伞形科、菊科、唇形科、桃金娘科、禾本科、柏科、樟科、松科、姜科和芸香科[8]。茶树油(tea tree oil,TTO)具有广谱抑菌、抗炎、抗癌和抗氧化等多种生物活性,现已广泛应用于食品工业和医药领域[9],但茶树油的高疏水性和挥发性使其实际应用受限。纳米乳液具有物理稳定性好、传递效率高和安全性高的特性[10],现已广泛用于药物输送系统。
已有研究表明,茶树油可抑制大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌及单增李斯特菌等食源性致病菌的生长,但对其抑制副溶血弧菌生长及生物膜的相关研究鲜有报道[10-13]。本研究优化了茶树油纳米乳液的制备条件,并以副溶血弧菌及其luxS基因缺失株为研究对象,探究茶树油纳米乳液对副溶血弧菌野生株和突变株的生物膜和群体感应的影响,为拓宽茶树油的应用和防控食品中副溶血弧菌的污染提供数据支持。
1 材料与方法
1.1 实验菌株
副溶血弧菌ATCC 17802、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)BB170、大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 25922、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)ATCC 14028购于广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心。副溶血弧菌ATCC 17802突变株(luxS基因缺失株)由本实验室构建。
1.2 试剂和培养基
茶树油(松油烯-4-醇含量:≥35%)、酸水解酪蛋白、结晶紫,上海麦克林生化科技有限公司;胰蛋白胨、大豆蛋白胨、琼脂,广东环凯生物技术有限公司;葡萄糖、MgSO4、NaOH、K2HPO4、NaCl、冰乙酸、甘油,广州市化学试剂厂;XTT钠盐,深圳市益百顺科技有限公司;甲萘醌,上海迈瑞尔化学技术有限公司;L-精氨酸,上海源叶生物科技有限公司。
胰酪大豆胨液体(tryptic soy broth,TSB)培养基(g/L):胰蛋白胨15.0,大豆蛋白胨5.0,NaCl 30.0,并将最终pH值调整为7.2,121 ℃高温灭菌20 min。
自动诱导生物测定(autoinducer bioassay,AB)培养基(g/L):MgSO4·7H2O 26 g、NaCl 17.5、酸水解酪蛋白2。用3 mol/L NaOH调节溶液pH值为7.5,121 ℃灭菌30 min。冷却后,无菌操作加入10 mL pH值为7.5的1 mol/L的K2HPO4·7H2O、10 mL pH值为7.5的0.1 mol/L的L-精氨酸和20 mL的体积分数50%的甘油。
1.3 仪器和设备
Forma Class Ⅱ生物安全柜,美国 Thermo 公司;THZ-100恒温培养摇床,上海一恒科学仪器有限公司;SP-02生化培养箱,广州市绿向生物科技有限公司;CFX96 qPCR仪,美国伯乐科技有限公司;IVD Multiskan FC 酶标仪,赛默飞世尔(上海)仪器有限公司;Axio Observer A1荧光倒置显微镜,德国 Zeiss 公司;Evolution 300 全波长紫外可见分光光度计,赛默飞世尔科技有限公司;EVO MA 15场发射扫描电镜,美国 FEI 公司;Mastersizer 3000激光粒度仪,英国马尔文仪器有限公司;SCIENTZ-950E超声波细胞破碎仪,宁波新芝生物科技股份有限公司;FSH-2A高速匀浆机,杭州旌斐仪器科技有限公司。
1.4 实验方法
1.4.1 茶树油纳米乳液的制备
称取一定量的壳聚糖溶于0.5%(体积分数)乙酸溶液中,过夜搅拌获得壳聚糖溶液。以1 g/L壳聚糖溶液为乳液基质,依次加入体积分数为0.25%卵磷脂和体积分数为0.25%无水乙醇,混合均匀后加入茶树油,混合物于750 r/min搅拌1 h,高速匀浆机18 000 r/min下均质2 min制得粗乳液。冰浴条件下通过超声波细胞破碎仪进一步均质乳化获得茶树油纳米乳液。
采用单因素试验对乳液制备条件进行优化,分别探究超声波功率(0、150、300、450、600 W)、超声波时间(0、5、10、15、20、25 min)以及茶树油添加量(1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%)对纳米乳液特性的影响。
1.4.2 茶树油纳米乳液特性的测定
1.4.2.1 纳米乳液粒径、PDI和zeta电位测定
将制得的茶树油纳米乳液用无菌水稀释100倍后用马尔文纳米激光粒度仪测量乳液的平均粒径、多分散指数(polymer dispersity index,PDI)和zeta电位[14]。
1.4.2.2 包封率的测定
将茶树油用体积分数为95%乙醇稀释成不同梯度浓度的标准溶液,进行紫外可见分光光谱分析,于199 nm处获得茶树油最大吸收峰,绘制标准曲线。将5 mL茶树油纳米乳液于4 ℃条件下10 000 r/min离心10 min,取0.1 mL上清液,添加体积分数为95%乙醇稀释至合适梯度,测定199 nm处吸光度值。包封率为包封茶树油的质量与原始茶树油质量的比值,根据公式(1)计算:
包封率
(1)
1.4.2.3 稳定性测定
将待测纳米乳液置于离心管中,分别于50、75、100 ℃下处理15 min,观察颜色和外观状态以评定热稳定性。
将待测纳米乳液分装于试剂瓶中,在25 ℃和4 ℃下密封存储30 d,观察乳液外观稳定性,每隔7 d测定乳液的粒径、PDI、zeta电位以评定贮藏稳定性。
1.4.3 茶树油纳米乳液对副溶血弧菌生物膜和群体感应的影响
1.4.3.1 菌种活化
将菌株从-80 ℃冰箱取出解冻30 min,副溶血弧菌ATCC 17802及其突变株ΔluxS以2%的体积分数接种于TSB培养基中,哈维氏弧菌BB170以2%的体积分数接种于AB培养基中,大肠杆菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 25923、鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028以2%的体积分数接种于LB培养基中,所有菌株置于37 ℃培养,活化2代后调整菌液浓度为107 CFU/mL。
1.4.3.2 抑菌能力的测定
采用牛津杯琼脂扩散法测定。吸取100 μL的浓度为107 CFU/mL菌液于TSA/LB固体培养基上,均匀涂布,用镊子取无菌牛津杯置于平板上,牛津杯中加入200 μL待测茶树油纳米乳液,37 ℃静置培养24 h,测量抑菌圈直径。
1.4.3.3 茶树油纳米乳液对副溶血弧菌生物膜形成的影响
96孔板中加入茶树油纳米乳液和活化后的菌液,使乳液终浓度分别为1/8 最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)、1/4 MIC、1/2 MIC和1 MIC,混合均匀后置于37 ℃下孵育24 h。采用结晶紫法[15]测定生物膜形成量,具体方法如下:弃去孔板上层浮游菌,用200 μL生理盐水轻缓洗涤2次,60 ℃干燥固定30 min,加入1 g/L结晶紫溶液染色5 min,用生理盐水轻缓洗涤3次,再次干燥后加入体积分数为33%冰乙酸脱色10 min,用酶标仪在595 nm处测定样品OD值。
采用XTT法[16]测定生物膜的代谢活性。按照前述方法制备孔板,37 ℃下分别培养24 h后,移除菌液,加入100 μL无菌PBS轻缓清洗2次,再向每孔加入100 μL无菌PBS和XTT-甲萘醌混合液13.5 μL(体积比为12.5∶1),轻轻振动孔板,37 ℃避光孵育2～3 h,测定OD450nm处吸光值。
1.4.3.4 茶树油纳米乳液对副溶血弧菌成熟生物膜的清除能力
参考ZHU等[17]的方法稍加修改。活化好的副溶血弧菌(野生株和突变株)接种于无菌TSB培养基,于96孔板中37 ℃培养48 h形成成熟生物膜,培养结束后除去上层菌液,用无菌PBS溶液轻缓清洗2次;再加入200 μL的茶树油纳米乳液,使其终浓度分别为4 MIC、2 MIC、1 MIC和1/2MIC,孔板置于37 ℃下孵育3 h,按照1.4.3.3节方法测定生物膜形成能力和XTT代谢活性,计算清除率。
1.4.3.5 茶树油纳米乳液对副溶血弧菌AI-2信号分子活性的影响
活化好的副溶血弧菌(野生株和突变株)接种于含茶树油纳米乳液终浓度为1/4 MIC、1/2 MIC和1 MIC 的TSB培养基中,37 ℃,180 r/min培养12 h,收集无细胞上清液,参考HAN等[18]的方法,采用生物发光法测定副溶血弧菌野生株AI-2信号分子的产生量,并稍加修改。调节活化好的哈维氏弧菌BB170的OD595nm值为1.0～1.2,以1∶5 000的比例稀释到新鲜无菌AB培养基中。活化后的副溶血弧菌离心取无细胞上清液,以1∶9的比例与稀释的哈维氏弧菌混合,30 ℃、110 r/min振荡培养5 h。在1～5 h内每隔1 h取200 μL菌液于黑色96孔酶标板中,使用连续波长多功能微孔板检测平台生物发光模式测定荧光强度。以哈维氏弧菌无细胞上清液为阳性对照,无菌AB培养基为阴性对照,无菌TSB为介质对照。
1.4.3.6 生物膜可视化分析
副溶血弧菌野生株和突变株活化培养后接种于不同茶树油纳米乳液终浓度(1/4 MIC、1/2 MIC和1 MIC)的TSB培养基中,混匀后,于8室细胞培养玻片中37 ℃下培养24 h。培养结束后用PBS轻轻洗去附着在玻片表面的浮游菌,使用活/死细菌染料染色菌体,避光处理15 min后使用倒置荧光显微镜观察。
参考XIN等[19]的方法,使用扫描电镜观察副溶血弧菌在茶树油纳米乳液处理后的微观变化。副溶血弧菌活化培养后接种于含0和1/2 MIC茶树油纳米乳液的TSB培养基中,37 ℃,180 r/min培养12 h,离心洗涤重悬于PBS中,在4 ℃下用25 g/L戊二醛溶液固定24 h。用0.1 mol/L PBS轻缓洗涤3次,除去残留的戊二醛。立即用10 g/L锇酸固定0.5 h,用PBS轻缓洗涤3次除去残留的锇酸。用体积分数为30%、50%、70%、80%、90%乙醇各脱水10 min,最后用体积分数为100%乙醇脱水2次,每次10 min。预处理后的盖玻片经装台、干燥和喷金操作后,在场发射扫描电镜下观察生物膜结构。
1.4.3.7 茶树油纳米乳液对副溶血弧菌群体感应相关基因的影响
将副溶血弧菌野生株和突变株分别接种于含0和1/2 MIC茶树油纳米乳液的30 g/L 3% NaCl的TSB培养基中,于37 ℃、180 r/min培养12 h后,分别提取RNA后并进行逆转录合成cDNA,适量稀释cDNA作为qPCR模板进行扩增。扩增体系(20 μL):SYBR Green Master Mix 10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL,ddH2O 8.2 μL,模板cDNA 1 μL。扩增条件:95 ℃ 2 min,40个循环(95 ℃ 10 s,60 ℃,30 s,收集荧光),60～95 ℃熔解曲线分析。设计对应引物对群体感应相关的鞭毛基因flaA和flgM、外膜蛋白基因ompW、溶血素基因toxS、toxR进行qPCR验证,以16S rRNA基因作为内参基因,使用2-ΔΔCT方法计算基因表达量的变化。
1.4.4 数据处理与分析
所有试验重复3次,取平均值,结果采用Graphpad prism 10.0作图,数据采用SPSS 26.0进行统计学分析,P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 不同制备条件对茶树油纳米乳液的影响
2.1.1 超声波功率对纳米乳液的影响
超声法是常见的减小乳液平均液滴粒径的有效方法,而超声波功率和时间是影响超声效果的重要参数[20]。本研究在茶树油添加量2%和超声波时间15 min下,考察超声波功率对茶树油纳米乳液的影响,由图1-a可知,随超声波功率增加,茶树油纳米乳液的包封率呈先增加后减少的趋势,且在超声波功率为450 W时包封率最大(62.40%);此外,超声波处理可以获得更小的粒径。一般纳米乳液粒径越小其稳定性越高[21]。PDI和zeta电位是考察纳米乳液稳定性的重要指标,其中PDI表示样本内群体大小的分布,PDI值≤0.3表示样品粒度分布均匀,大于0.7表示样品具有非常宽的粒度分布[22];而zeta电位表示颗粒间的静电排斥力,zeta电位值≥±30 mV表明纳米乳液具有稳定性[23]。图1-b表明超声波处理可使乳液的PDI值降至0.3以下,但增加超声波功率对PDI无显著影响;zeta电位会随超声波功率的增加而降低,但仍大于30 mV;说明超声波处理可获得分布均匀且稳定性较好的乳液。图1-c结果表明,超声波处理后的乳液相较于未处理组的抑菌能力显著增强,但增强超声波功率对抑菌能力无显著影响。综上所述,确定超声波功率450 W制备茶树油纳米乳液。
a-对包封率和粒径的影响;b-对乳液zeta电位和PDI的影响;c-对乳液抑菌能力的影响
图1 超声波功率对茶树油纳米乳液的影响
Fig.1 Effects of ultrasonic power on TTO nanoemulsion
注:图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
2.1.2 超声波时间对纳米乳液的影响
在茶树油添加量2%和超声波功率450 W下,探究超声波时间对茶树油纳米乳液的影响。由图2-a可知,随超声波时间增加,乳液的包封率呈先增加后减少的趋势,且在超声波时间为20 min时包封率最大(88.90%)。由图2-a、图2-b可得,超声波时间会影响纳米乳液的粒径、zeta电位和PDI值;超声波时间增加会导致乳液粒径和PDI值变小,但超声波时间在10～25 min其粒径无显著变化,这与白师茹等[24]的研究结果相似;随着超声波时间的增加,乳液的zeta电位呈上下波动,15 min后zeta电位基本维持在65 mV,变化不显著。对于抑菌能力(图2-c),随超声波时间增加,乳液的抑菌圈直径显著增加,在15 min达到最大抑菌圈直径(1.38±0.03) cm,继续延长超声波时间,抑菌圈直径反而有所下降。这可能是因为在合适的超声条件下乳液中的茶树油分布逐渐趋于均衡,抑菌效果提升,而过长时间的超声波处理使乳液的小液滴重新聚集从而导致茶树油释放受限。因此,选择超声波时间为20 min以制备茶树油纳米乳液。
a-对包封率和粒径的影响;b-对乳液zeta电位和PDI的影响;c-对乳液抑菌能力的影响
图2 超声波时间对茶树油纳米乳液的影响
Fig.2 Effects of ultrasonic time on TTO nanoemulsion
2.1.3 茶树油添加量对纳米乳液的影响
茶树油的添加量也会影响乳液的分布稳定性和粒径大小。精油添加量过少会导致其抑菌能力不佳,活性不足,而过量的精油将无法被乳液有效包裹,且容易发生聚集碰撞导致纳米乳液的稳定性下降[25]。由图3-a可知,随着茶树油添加量增加,乳液的粒径显著增大,添加量为7%时粒径可达(321.2±4.19) nm。不同茶树油添加量的纳米乳液的zeta电位均大于30 mV,且PDI值均小于0.3,说明乳液具有较好的稳定性(图3-b)。此外,研究发现增加乳液中的茶树油含量可以增大乳液对副溶血弧菌的抑菌圈直径,且在添加量为6%时抑菌圈直径最大,为(1.58±0.03) cm,这是因为纳米乳液的抑菌能力主要依赖于茶树油成分;但茶树油添加量为7%时乳液的抑菌圈直径低于6%时,这可能是因为其粒径增大,茶树油在液滴中分布不均匀。而且研究发现茶树油添加量为7%时乳液易分层,因此后续研究未采用此浓度。
a-对乳液粒径和抑菌的影响;b-对乳液zeta电位和PDI的影响
图3 茶树油添加量对纳米乳液特性的影响
Fig.3 Effects of TTO addition amount on the properties of nanoemulsion
2.2 茶树油纳米乳液的稳定性
分别观察了不同茶树油添加量(1%～6%)的纳米乳液在50、75、100 ℃下处理15 min后的外观状态,结果表明各组茶树油纳米乳液在不同温度处理下均无分层、浑浊等变化,说明制得的茶树油纳米乳液具有较好的热稳定性。
此外,分别测量了在4 ℃和25 ℃条件下贮藏0～28 d期间乳液的粒径、PDI和zeta电位的变化。由图4可知,1%茶树油添加量的乳液在4 ℃和25 ℃下随着贮藏时间的增长,粒径显著增大,且PDI值显著变大,贮藏后期PDI>0.3,zeta电位也呈现不稳定波动;此外,4%茶树油添加量的乳液在2个温度下的粒径随时间延长呈下降趋势,2%添加量的乳液粒径虽无显著变化,但2种乳液的zeta电位都出现明显波动。综上所述,1%、2%、4%茶树油添加量的乳液稳定性较差,不利于长期储存,其余添加量下的乳液相对较为稳定。综合前文不同茶树油添加量的纳米乳液的抑菌能力,确定茶树油纳米乳液的茶树油添加量为6%。
a-4 ℃贮藏期间乳液的粒径;b-25 ℃贮藏期间乳液的粒径;c-4 ℃贮藏期间乳液的PDI;d-25 ℃贮藏期间乳液的PDI;e-4 ℃贮藏期间乳液的zeta电位;f-25 ℃贮藏期间乳液的zeta电位
图4 不同温度下贮藏期间茶树油纳米乳液的特性
Fig.4 Characteristics of TTO nanoemulsion during storage at different temperatures
2.3 茶树油纳米乳液的抑菌活性
使用牛津杯法测定了茶树油纳米乳液对常见食源性致病菌的抑菌效果,结果如图5所示,茶树油纳米乳液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌具有一定的抑制作用,对副溶血弧菌的野生株和突变株均有明显的抑菌效果,但其对野生株和突变株的抑制作用无显著差异。此外,进一步测得茶树油对副溶血弧菌的MIC为8.75 mg/mL,而茶树油纳米乳液的MIC为1.95 mg/mL,相较于纯精油的MIC明显降低。多项研究表明纳米乳液可以提高植物精油对食源性致病菌的抑菌效果,这可能是因为纳米乳液的粒径小,可更好地分散于水相,增加了精油与细菌接触的表面积[26]。
图5 茶树油纳米乳液对常见食源性致病菌的抑菌活性
Fig.5 Antibacterial activity of TTO nanoemulsion against common foodborne pathogens
注:Vp-副溶血弧菌野生株;VpΔluxS-副溶血弧菌突变株;Sa-金黄色葡萄球菌;Ec-大肠杆菌;St-鼠伤寒沙门氏菌(下同)。
2.4 茶树油纳米乳液对副溶血弧菌生物膜形成的影响
如图6所示,不同浓度的茶树油纳米乳液能够显著抑制副溶血弧菌野生株和突变株生物膜的形成,降低生物膜形成量和XTT代谢活性,且抑制效果与乳液浓度呈正相关。对比乳液对副溶血弧菌野生株和突变株的抑制效果,发现乳液对突变株的抑制作用显著优于对野生株的抑制作用。在1 MIC处理时,对野生株和突变株生物膜抑制率分别为55.86%和60.38%,代谢活性抑制率为59.31%和68.69%;在1/2 MIC处理时,对野生株和突变株生物膜抑制率分别为48.19%和55.52%,代谢活性抑制率为42.60%和62.03%;1/4 MIC处理,对野生株和突变株生物膜的抑制率分别为36.46%和47.04%,代谢活性抑制率为32.96%和57.73%。
a-生物膜抑制率;b-XTT代谢活性抑制率
图6 茶树油纳米乳液对副溶血弧菌生物膜形成的影响
Fig.6 Effects of TTO nanoemulsion on biofilm formation of V.parahaemolyticus
2.5 茶树油纳米乳液对副溶血弧菌成熟生物膜的清除能力
由图7可知,茶树油纳米乳液对副溶血弧菌野生株和突变株的成熟生物膜均有清除作用,且其作用效果有浓度依赖性。各浓度下茶树油纳米乳液对副溶血弧菌野生株生物膜的清除率显著高于突变株。处理浓度为4 MIC时,野生株和突变株的生物膜清除率最高,分别为38.18%和19.35%。
图7 茶树油纳米乳液对成熟生物膜的清除能力
Fig.7 Eradication rate of TTO nanoemulsion against mature biofilms
2.6 茶树油纳米乳液对副溶血弧菌AI-2信号分子及群体感应相关基因表达量的影响
AI-2型群体感应系统是调控副溶血弧菌生物膜形成的关键,前期研究已证实副溶血弧菌突变株不产AI-2信号分子[27],因此只考察茶树油纳米乳液对副溶血弧菌野生株AI-2信号分子的影响。由图8-a可知,在茶树油纳米乳液的作用下,副溶血弧菌的AI-2信号分子的生成受到抑制,且随纳米乳液浓度增大,抑制效果增强;在1 MIC浓度下,茶树油纳米乳液对副溶血弧菌AI-2生成的抑制率可达50.27%。
a-对AI-2信号分子的抑制率;b-野生株群体感应相关基因表达量变化;c-突变株群体感应相关基因表达量变化
图8 茶树油纳米乳液对副溶血弧菌AI-2信号分子及群体感应相关基因的影响
Fig.8 Effects of TTO nanoemulsion on AI-2 signaling molecule and QS-related genes of V.parahaemolyticus
注:*,P<0.05;**,P<0.01。
副溶血弧菌的致病性及生物膜形成相关基因受群体感应系统的调控,如溶血素基因、鞭毛基因及外膜蛋白基因,其中溶血素基因toxR是副溶血弧菌最常见的毒力基因[28],其活性由toxS决定,toxS的缺失会促进toxR的水解[29];副溶血弧菌的鞭毛在调节其生物膜形成和致病性上有重要作用[30],研究表明flaA和flgM基因在调控副溶血弧菌鞭毛的组装中具有重要作用,flaA基因编码极性鞭毛蛋白,有利于副溶血弧菌的泳动,flgM基因编码抗σ28因子,属于副溶血弧菌的外侧鞭毛基因系统,可使细菌移动并定植表面[31]。此外,在生物膜定植过程中,外膜蛋白(outer membrane proteins, OMPs)与细菌的黏附密切相关,其中ompW参与调节渗透压和疏水小分子的跨膜运输[32]。图8-b、图8-c表明,经乳液处理后,副溶血弧菌野生株的溶血素基因toxR下调,toxS上调,鞭毛相关基因flaA下调,flgM上调,外膜蛋白ompW下调(图8-b),变化显著;突变株的溶血素基因toxR下调,toxS上调,而鞭毛和外膜蛋白相关基因没有显著改变(图8-c)。这说明乳液可减少副溶血弧菌野生株和突变株溶血素基因toxR的表达,抑制副溶血弧菌野生株的泳动并可能通过抑制ompW的表达来限制其与生物膜形成相关的物质运输,从而干扰副溶血弧菌的群体感应系统;乳液处理前后突变株的鞭毛和外膜蛋白相关基因表达量无明显变化,这可能是因为突变株缺少luxS基因,乳液无法通过相同途径作用于群体感应系统,推测乳液可通过其他作用方式达到抑菌和抗生物膜效果。
2.7 荧光显微镜可视化生物膜变化
由图9可知,未处理的野生株和突变株对照组中生物膜细菌活菌居多且分布密集;其中突变株的生物膜细菌比野生株的更聚集,并呈片状分布,说明突变株的生物膜形成能力更强。经茶树油纳米乳液处理后,生物膜细菌中的活菌数明显减少,而死菌数显著增加;随着乳液浓度增加,该变化更为明显,表明茶树油纳米乳液可以有效地抑制野生株和突变株的生物膜形成。
a-野生株活菌;b-野生株死菌;c-突变株活菌;d-突变株死菌
图9 荧光显微镜可视化观察副溶血弧菌生物膜的变化
Fig.9 Fluorescence microscopy visualization of changes in V.parahaemolyticus biofilms
注:下标1～3表示乳液添加量为0、1/4 MIC、1/2 MIC。
a-菌体形态;b-生物膜形态
图10 扫描电镜观察纳米乳液处理后副溶血弧菌形态和生物膜变化
Fig.10 SEM of morphological changes and biofilm alterations in V.parahaemolyticus after nanoemulsion treatment
注:1-对照;2-1/2 MIC。
2.8 扫描电镜可视化
采用扫描电镜观察乳液处理后副溶血弧菌细胞表面形态和生物膜的变化。由图10可知,对照组(未经乳液处理的副溶血弧菌)菌体表面光滑饱满、轮廓清晰,有规则和典型的弧菌形态;而处理组菌体形态出现明显变形、褶皱和破裂,内容物泄露,损伤严重。此外,对照组生物膜中细胞聚集明显,菌体间紧密成团,且周围被胞外多聚物包裹,形成致密生物膜特征;而处理组生物膜结构严重受损,菌体和胞外多聚物显著减少,菌体相对分散。上述结果直观地说明了茶树油纳米乳液对副溶血弧菌及其生物膜的抑制作用。
3 结论与讨论
本文通过探究超声波功率、超声波时间及茶树油添加量对纳米乳液的影响,优化了茶树油纳米乳液的制备条件,并考察了该乳液对副溶血弧菌野生株和突变株生物膜和群体感应的影响。结果表明,茶树油纳米乳液可有效抑制副溶血弧菌生物膜的形成,且其对突变株的抑制率高于野生株。对于成熟副溶血弧菌生物膜,茶树油纳米乳液对野生株的抑制效果优于突变株。茶树油纳米乳液可有效抑制副溶血弧菌野生株AI-2信号分子的生成,并降低野生株群体感应相关基因溶血素基因toxR、鞭毛基因flaA及外膜蛋白基因ompW的表达量,其对突变株的鞭毛和外膜蛋白基因无影响,这说明该乳液可通过干扰副溶血弧菌基于AI-2信号分子的群体感应系统,调控生物膜形成以及运动和毒力相关基因的表达,可作为一种具有应用潜力的抗副溶血弧菌及其生物膜的制剂。
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