香辛料是一类具有芳香和辛香等典型风味的天然植物性调味品,不仅具有调味、着色和增香等作用,还有抗氧化和抗炎等活性功能,广泛应用于食品、医药及化妆品等行业[1-2]。然而,香辛料在种植、采收、干燥和储运等过程中极易受到微生物污染[3],胡椒生长在高温高湿地区,其微生物污染更为严重。研究表明,市售胡椒的总菌落数可达104～107 CFU/g,甚至检出霉菌、大肠菌群及致病性芽孢杆菌[4-5]。微生物不仅影响产品品质,还可能引发食源性疾病,严重制约胡椒等香辛料产业的可持续发展。

传统的热杀菌或化学熏蒸方法会破坏胡椒等香辛料的风味,而辐照技术因其高效、低温、无化学残留等优势[6],被国际食品法典委员会及多国监管机构批准用于香辛料灭菌,推荐使用的最大剂量为10 kGy[7]。研究表明,4～10 kGy的辐照处理可使胡椒的微生物数量降低2～4 lg CFU/g[8]。然而,部分微生物,尤其是芽孢杆菌,因其具有耐干燥、耐热及耐辐照等抗逆特性,可在高剂量辐照后存活,导致产品在贮藏期间发生二次污染[9]。例如,MTENGA等[10]发现经剂量为10 kGy的γ射线处理后,大米中的蜡样芽孢杆菌营养细胞降低了6.32 lg CFU/g(初始值为7.9 lg CFU/g);而经20 kGy剂量辐照后,蜡样芽孢杆菌芽孢(初始值为7.7 lg CFU/g)仅减少了4.28 lg CFU/g。MUHAMMAD等[11]发现经12 kGy的电子束处理后,红烧牛肉样品所污染的蜡样芽孢杆菌芽孢未被完全杀灭,仅由6.74 lg CFU/g降低至3.12 lg CFU/g。此外,不同来源的胡椒可能污染具有不同耐受特性的微生物群落,辐照灭活效果存在较大差异。因此,系统研究胡椒中耐辐照菌的种类及灭活规律,对完善辐照灭菌工艺至关重要。

本研究旨在从胡椒样品中分离耐辐照微生物,并通过生理生化、革兰氏染色和16S rDNA等方法对其进行鉴定;同时,测定不同辐照剂量下耐辐照菌的存活率,构建辐照失活动力学模型,分析其辐照抗性规律,评估胡椒辐照杀菌的适用性,以期为胡椒及其他香辛料的辐照杀菌工艺优化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源

胡椒样品来自不同地区,采购于超市,样品包装完好,详细信息见表1。

1.2 主要试剂与材料

胰蛋白胨大豆琼脂(tryptone soy agar,TSA)培养基、胰酪大豆胨液体(tryptone soy broth,TSB)培养基、硫酸锰营养琼脂(manganese nutrient agar medium,MNA)培养基、HBIG14生理生化鉴定条,青岛高科技工业园海博生物技术有限公司;甘油、香柏油,南京全隆生物技术有限公司;芽孢染色试剂盒、革兰氏染色试剂盒,北京索莱宝科技有限公司;Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒,生工生物工程(上海)股份有限公司;Taq Plus DNA聚合酶(ET105)、琼脂糖,天根生化科技(北京)有限公司;GeneRuler DNA Ladder Mix,美国Thermo Fisher Scientific公司;抗菌药物药敏纸片,常德比克曼生物科技有限公司。

1.3 主要仪器设备

DZm-6/8/10电子直线加速器(束能10 MeV,功率20 kW),河南省科学院同位素研究所有限责任公司;B3500型薄膜剂量计,美国GEX公司;5427R高速冷冻离心机,德国Eppendorf公司;Applied BiosystemsTM VeritiTM 96孔PCR仪,美国Thermo Fisher Scientific公司;EPS-600型电泳仪,上海天能生命科学有限公司;ChemiDocTM XRS+化学发光成像系统,美国Bio-Rad公司;YCT-80B型恒温摇床,上海捷呈实验仪器有限公司;MJ54A型高压灭菌锅,施都凯仪器设备(上海)有限公司;TL3701P型光学显微镜,江苏缔伦光学有限公司;FXB303-2电热恒温培养箱,上海树立仪器仪表有限公司;JSM-7001F型场发射扫描电镜,日本JEOL公司。

1.4 实验方法

1.4.1 辐照处理

将采购的原包装胡椒样品进行电子束辐照,辐照剂量设定为12 kGy。采用薄膜剂量计跟踪检测样品实际吸收剂量,测定结果为12.06 kGy。

1.4.2 耐辐照菌的分离与纯化

取辐照后的胡椒样品5 g置于50 mL TSB培养基中,于37 ℃、180 r/min培养12 h。准确吸取TSB培养基,采用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释。分别吸取100 μL合适梯度的稀释液,均匀涂布于TSA平板。待菌落长出后,挑取外观形态、大小、颜色不同的单菌落,反复划线于TSA平板进行纯化,直到出现纯菌落为止。将初步获得的菌株接种于TSB并于37 ℃、180 r/min培养12 h;5 246 r/min离心10 min,用无菌生理盐水洗涤2次并收集菌体,重悬于2 mL无菌生理盐水,取1 mL重悬液进行12 kGy剂量辐照,取辐照后的菌悬液100 μL样品涂布于TSA平板,37 ℃培养24 h后仍然存活的即为耐辐照菌,对其进行编号。将获得的耐辐照菌接种于TSB培养基,摇床37 ℃、180 r/min培养12 h。准确吸取500 μL菌悬液与500 μL质量分数50%的无菌甘油混合均匀,于-80 ℃超低温冰箱冻存。

1.4.3 菌株形态学鉴定

参照《常见细菌系统鉴定手册》[12]对分离菌株的形态进行初步鉴别。

1.4.4 生理生化鉴定

采用生理生化鉴定条对菌株生理生化特性进行鉴定,具体步骤参考说明书。

1.4.5 染色镜检

革兰氏染色:参考LEKFIF等[13]的方法,对分离菌株进行革兰氏染色,并通过光学显微镜观察菌体形态及染色结果。

芽孢染色:参考HU等[14]的研究,将耐辐照菌分别接种于MNA平板进行产芽孢培养,再进行芽孢染色,并采用光学显微镜观察芽孢染色结果。

1.4.6 扫描电镜

参考DING等[15]的方法并略做修改,采用场发射扫描电镜观察耐辐照菌的形态特征。将耐辐照菌接种于TSB培养基,培养12 h后于5 246 r/min离心5 min收集菌体,用无菌生理盐水清洗菌体2次,并采用2.5%(体积分数)戊二醛溶液(500 μL)4 ℃避光固定4 h。采用无菌磷酸盐缓冲溶液(0.1 mol/L,pH 7.2)离心洗涤3次后,分别用10%～100%(体积分数)乙醇溶液逐级洗脱10 min,其中无水乙醇脱水2次;最后用乙酸异戊酯置换无水乙醇2次,每次置换时间为10 min,离心后吸出800 μL上清液,将剩余的液体与菌体沉淀混匀,并滴加到硅片上室温过夜干燥。通过真空蒸镀仪喷金涂层,并采用场发射扫描电镜(3.0 kV,10 000×)观察耐辐照菌形态特征。

1.4.7 分子生物学鉴定

采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取各分离菌株DNA,按试剂盒说明书方法操作。以27F:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT为引物进行PCR扩增,扩增完成后用琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物。并将产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序所得序列在NCBI进行同源性比对,使用BLAST算法对分离的耐辐照菌进行鉴定,并使用MEGA11软件构建系统发育树。

1.4.8 药物敏感性实验

参考HOU等[16]的方法,选取青霉素、头孢唑啉、庆大霉素、红霉素、阿奇霉素和四环素等23种抗生素对耐辐照菌进行药敏实验。将耐辐照菌悬液浓度调整到约8 lg CFU/mL,准确吸取100 μL涂布于TSA培养基上,取3片相同的药敏纸片轻轻放置于平板表面,37 ℃培养24 h后测定抑菌圈大小。结果的判定参照美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)标准M100:Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing。根据抑菌圈直径大小,可将结果分为敏感(susceptibility,S)、中等耐药(intermediate resistance,I)和耐药(resistance,R)。

1.4.9 杀菌动力学模型评价

将初始浓度约8 lg CFU/mL的菌悬液分装到2 mL无菌离心管中,每管1 mL。辐照剂量设定为2、4、6、8、10、12、14 kGy(实际吸收剂量分别为2.03、4.00、6.34、8.47、10.30、11.99、13.90 kGy)。经辐照后梯度稀释(10-6～10-1),取稀释后的液体100 μL涂布于TSA平板,于37 ℃培养24 h,进行菌落计数。分别采用线性模型[17]、Weibull模型[18]和Log-Logistic模型[19]评估其失活动力学规律,计算方程如公式(1)～公式(3)所示:

线性模型:

(1)

Weibull模型:

(2)

Log-Logistic模型:

(3)

式中:N,特定剂量高能电子束辐照处理后的活菌数,CFU/mL;N0,初始菌落数,CFU/mL;x,辐照剂量,kGy;D,杀灭90%细菌所需要的辐照剂量,kGy;b,尺度参数,其值越大表明失活速度越快;n,形状因子,n>1时拟合曲线向外凸起,n=1时拟合曲线为线性,n<1时拟合曲线向内凹;c,杀菌效果的最大可能值(通常假设为初始数量的对数);xm,达到50%杀菌效果所需的辐照剂量,kGy;d,斜率参数,控制曲线的形状。

1.5 数据处理与分析

结果表示为“平均值±标准差”,每组实验均设置3个平行样本。实验数据使用Origin 2018进行线性和非线性分析及作图。

2 结果与分析

2.1 耐辐照菌分离结果和形态特征

从经12 kGy辐照的30个胡椒样品中共分离出34株菌。将纯化后的34株菌经增菌培养,离心、收集沉淀并重悬于生理盐水;将初始菌浓度调至7～8 lg CFU/mL,经12 kGy辐照处理后,涂布于TSA平板,得到3株耐辐照菌,分别命名为F3-2、F15-4和F25-1,其菌落形态特征见表2。

2.2 生理生化鉴定结果

生理生化鉴定可以通过测定细菌对特定底物的利用能力、代谢产物的生成情况以及酶促反应的特性,初步鉴定细菌属或种情况。由表3可知,3株分离菌的乙酰甲基甲醇(Voges-Proskauer,V-P)实验和淀粉水解实验结果均为阳性,表明其能够分解葡萄糖产生丙酮酸,同时也能分泌淀粉酶。3株菌在7% NaCl均无法生长,表明其不耐高盐环境,可能为非嗜盐菌。除菌株F15-4外,其他2株菌在明胶液化表现为阳性,说明其能分泌蛋白酶并分解明胶。菌株F3-2的柠檬酸盐、丙酸盐和pH 5.7生长实验均呈阳性,说明该菌可利用柠檬酸盐和丙酸盐,有耐弱酸性。菌株F15-4柠檬酸盐、D-木糖和硝酸盐还原实验为阳性,说明该菌可以利用柠檬酸盐,发酵D-木糖,还可以将硝酸盐还原为亚硝酸盐。菌株F25-1的L-阿拉伯糖、D-甘露醇呈阳性,但D-木糖呈阴性,说明该菌可以利用L-阿拉伯糖、D-甘露醇,但不能发酵D-木糖。

2.3 镜检结果

革兰氏染色是根据细胞膜结构鉴别细菌的一种方法[20]。革兰氏阳性菌因其细胞壁中厚密的肽聚糖层能够有效截留结晶紫-碘复合物,从而在革兰氏染色中呈现紫色,革兰氏阴性菌由于外膜在乙醇脱色过程中被破坏,加之其肽聚糖层较薄,无法有效保留结晶紫-碘复合物,最终经番红复染后呈现红色。如图1-a～图1-c所示,分离出的3株耐辐照菌均为革兰氏阳性菌,菌体成杆状,菌株F3-2和F15-4为短杆菌,菌株F25-1为长杆菌,呈线性排列,其菌体显著大于F3-2和F15-4。由图1-d～图1-f可知,3株分离菌经染色后镜检发现部分细胞被染成绿色,说明这3株菌可以由营养体状态转变成芽孢状态。

2.4 扫描电镜结果

如图2所示,3株耐辐照菌均为杆状,其中菌株F3-2有鞭毛,菌体宽约0.5 μm,长约1.3～2.2 μm;菌株F15-4菌体宽约0.7 μm,长约1.1～2.0 μm;菌株F25-1菌体宽约0.9 μm,长约1.9～4.3 μm。

2.5 分子生物学鉴定结果

对分离的3株耐辐照菌的DNA片段进行PCR扩增,将扩增得到的DNA片段进行核酸凝胶电泳。由图3-a可知,3株菌的16S rDNA阳性产物序列长度在1 500 bp左右,与预期产物大小一致。将3株菌的16S rDNA测序结果上传至NCBI进行比对,并构建系统发育树。如图3-b所示,菌株F3-2与Bacillus safensis(CP116774.1)亲缘关系更近,结合生理生化特征鉴定及形态学观察结果,鉴定其为沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis);菌株F15-4与Bacillus velezensis(CP061087.1和CP130608.1)亲缘关系更近,结合生理生化特征鉴定及形态学观察结果,鉴定其为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis);菌株F25-1与Priestia megaterium(CP187630.1)亲缘关系更近,鉴定其为巨大普里斯特氏菌(Priestia megaterium)。巨大普里斯特氏菌原名巨大芽孢杆菌,曾长期属于芽孢杆菌属[21],2020年之后,因系统发育差异被独立为普里斯特氏菌属,该菌可产芽孢,在形态和功能上与芽孢杆菌属相似,目前仍属于芽孢杆菌科。分离得到的沙福芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌和巨大普里斯特氏菌均能耐受12 kGy辐照剂量,可能是由于其独特的芽孢结构。这3株菌均可以产生芽孢,其芽孢的多层结构,如富含小酸溶性蛋白的DNA保护层、吡啶二羧酸钙稳定的皮层等,能有效屏蔽电离辐射并减少活性氧损伤,增强了其辐照适应能力[22-23]。

2.6 耐药性结果

如表4可知,3株菌均表现出对氨苄西林和青霉素的耐受性,但耐药情况存在一定差异。其中,菌株F3-2对苯唑西林、头孢他啶和头孢呋辛钠也表现出耐受性,同时对头孢曲松、红霉素、氯霉素和克林霉素呈中等耐药。菌株F15-4除对氨苄西林和青霉素耐受外,还对苯唑西林和四环素具有耐药性,这一结果与薛瑞敏[24]报道的辣椒中分离的耐热贝莱斯芽孢杆菌对青霉素和氨苄西林抗生素的耐药性特征一致。菌株F25-1对氨苄西林、青霉素和克林霉素表现出耐受性,对其他测试抗生素均敏感,这与JENA等[25]从水稻中分离出的2株巨大普里斯特氏菌对氨苄西林均有耐药性的结果相一致。细菌的耐药性与其携带的特定耐药基因有关,细菌对β-内酰胺类抗生素耐药可能是该菌携带广谱β-内酰胺酶基因,产生的β-内酰胺酶特异性水解β-内酰胺环,或者通过改变青霉素结合蛋白的结构引起[26-27];贝莱斯芽孢杆菌对四环素的耐药性可能由ykkD或tet(L)基因介导[28]。巨大普里斯特氏菌对克林霉素的耐药可能由耐药基因erm介导,该基因编码的核糖体甲基化酶通过修饰23S rRNA,阻止抗生素与靶点结合[29]。

2.7 辐照杀菌动力学模型分析结果

建立辐照杀菌技术预测模型可以准确地描述微生物对辐照的敏感性,为工业应用提供重要依据。线性模型是一种典型的失活模型;Weibull模型是应用于不同条件下微生物失活的最简单非线性失活模型;Log-Logistic模型是一种灵活的非线性模型,适用于描述微生物失活的复杂动力学行为。由图4可知,高能电子束对3株分离菌的杀灭效果随辐照剂量(0～14 kGy)的升高而增强;3株分离菌在12 kGy下仍能存活,但其对辐照的敏感性不同。在辐照剂量为2 kGy时,菌株F3-2、F15-4和F25-1分别由初始的7.89、7.84、8.45 lg CFU/mL降低了3.12、1.74、1.54 lg CFU/mL。在辐照剂量为12 kGy时,菌株F3-2、F15-4和F25-1分别降低了6.23、5.46、7.15 lg CFU/mL。表明3株分离菌在高辐照剂量下耐受程度不同,菌株F25-1对高辐照剂量相对更敏感,在14 kGy时已被完全杀灭;但经14 kGy辐照处理后,菌株F3-2和F15-4仍有存活。

由表5可知,菌株F3-2、F15-4、F25-1的D值(杀灭90%细菌所需的辐照剂量)分别为1.81、2.06、1.52 kGy。结果表明,相对于菌株F3-2和F25-1,菌株F15-4具有更高的耐辐照性。一般主要采用相关系数(R2)和均方根误差(root mean square error,RMSE)参数评价模型拟合优度。R2表示模型能解释数据变异的百分比,其值越接近1说明模型拟合越好。RMSE表示模型预测值与实际观测值的平均偏差,其值越低,模型预测越精准。比较3种模型的R2和RMSE发现,3株菌的非线性拟合中,Weibull模型拟合R2分别为0.98、0.99和0.95,高于线性拟合和Log-Logistic拟合的R2;RMSE分别为0.42、0.37和0.67,均低于另外2种模型,表明Weibull模型拟合效果最好。通常情况下,随辐照剂量的升高,微生物结构损伤加剧并发生聚集效应,使得存活的细菌表现出高抗性,导致失活曲线出现拖尾的情况[30],这与Weibull模型拟合效果优于线性模型的结果相一致。

3 结论与展望

本研究从电子束辐照后的胡椒样品中共分离出3株耐辐照菌,分别鉴定为沙福芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌和巨大普里斯特氏菌。3株分离菌对抗生素耐药性略有不同,但都对氨苄西林和青霉素具有耐药性。在构建的3种动力学模型中,Weibull模型R2最接近1,RMSE值最小,拟合效果最好。虽然耐辐照微生物可能带来一定的生物安全风险,但随着研究的深入,因具有独特的抗逆机制,其在放射性污染修复、太空环境净化、极端酶和辐射防护剂开发等诸多领域具有重要价值[31]。今后应采用全基因组学和蛋白质组学等技术系统解析耐辐照菌株的基因组和蛋白质组特征,重点挖掘其耐辐照相关功能基因和蛋白,阐明其在辐照胁迫下的分子调控网络与代谢应答机制,为耐辐照微生物资源的深度开发和安全利用提供理论依据与关键技术支撑。

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Isolation, identification, and inactivation kinetics of radiation-resistant bacteria in pepper

GU Xiaoyu1, WANG Xian1,2, YAN Huili2, ZHANG Dong2, CHEN Sisi2, ZHANG Dianhe2, WANG Rui3, XIANG Qisen1*

1(College of Food and Bioengineering, Zhengzhou University of Light Industry, Zhengzhou 450001, China)

2(Isotope Institute Co. Ltd., Henan Academy of Sciences, Zhengzhou 450015, China)

3(Henan Dongfang Yichu Food Co.Ltd., Changge 461000, China)

ABSTRACT This work aimed to explore the radiation-resistant bacteria in pepper and clarify their resistance patterns.Pepper samples irradiated with a high-energy electron beam at a dose of 12 kGy were utilized as raw materials for the isolation and purification of bacteria.Radiation-resistant bacteria were identified through the physiological-biochemical characterization, Gram staining, and 16S rDNA sequencing.Meanwhile, the radiation resistance of the isolates was further evaluated.The inactivation kinetics of radiation-resistant bacteria after exposure to high-energy electron beam was fitted by the linear, Weibull, and Log-Logistic kinetic models.Three bacteria were isolated from the irradiated pepper, all of which were Gram-positive and spore-forming bacteria.The isolates were identified as Bacillus safensis, Bacillus velezensis, and Priestia megaterium, respectively.All three isolates exhibited resistance to ampicillin and penicillin.Compared to the linear and Log-Logistic models, the Weibull model accurately described the inactivation kinetics of these isolates after exposure to high-energy electron beam, with the highest R2 value (closest to 1) and the lowest root mean square error.This study elucidates the radiation resistance patterns of radiation-resistant bacteria, providing a theoretical foundation for controlling the radiation-resistant microorganisms in spices.

Key words pepper;radiation-resistant bacteria;isolation and identification;16S rDNA;kinetic model

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.043873

引用格式：顾晓雨,王娴,闫慧丽,等.胡椒中耐辐照菌的分离鉴定及失活动力学规律研究[J].食品与发酵工业,2026,52(9):118-125.GU Xiaoyu, WANG Xian, YAN Huili, et al.Isolation, identification, and inactivation kinetics of radiation-resistant bacteria in pepper[J].Food and Fermentation Industries,2026,52(9):118-125.

第一作者：硕士研究生(相启森教授为通信作者,E-mail:xiangqisen2006@163.com)

基金项目：国家自然科学基金项目(32472490);河南省高校科技创新人才支持计划项目(24HASTIT058);河南省科学院基本科研业务费项目(20250604001)

收稿日期：2025-07-11,改回日期：2025-09-04