黑米又称血米、乌米等,是一种特殊的水稻品种。黑米作为米中珍品,是一种药、食兼用的大米,有“世界米中之王”的美称[1]。全球60%以上分布在中国,占全球总产量的62%[2]。黑米中富含花青素、γ-氨基丁酸、黄酮、酚类等物质,其中黑米中花青素为主要的活性物质。花青素(也称花色苷)是一种广泛存在于自然界的天然水溶性黄酮化合物,通过改变内源性抗氧化酶和衰老相关酶的活性,并调节SOD1、SOD2和MAO-B基因的表达,故具备抗氧化的功效。氧化产生的自由基会损伤细胞结构和DNA,加速细胞老化;而抗氧化能减少这种损伤,延迟衰老进程。娄秋艳[3]通过液质联用技术对黑米花色苷成分进行系统解析,鉴定出矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside,C3G)、矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷、矢车菊素-飞燕草素-己糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-芸香糖苷和芍药素-3-芸香糖苷等6种特征性苷元。其中,C3G是黑米花色苷中的主要单体,占80%以上。所以在分子对接模拟技术中,以C3G为主要成分,研究其与熊果苷在酪氨酸酶活性中心的结合位点。
酪氨酸酶(又称多酚氧化酶)是黑色素生成的关键限速酶,黑色素的过度堆积会引发人体的皮肤问题,如雀斑、老年斑、黄褐斑甚至皮肤癌[4]。酪氨酸酶与人类体内同类酶有着较高的相似性与同源性,因此抑制酪氨酸酶活性就成为减少黑色素生成的重要手段之一。目前市面上已经有一些可以抑制酪氨酸酶的美白剂(如熊果苷、曲酸等),然而长期使用会伴随一定副作用。故而,寻找安全有效的天然酪氨酸酶抑制剂,是当下生物医药及化妆品等领域的研究热点之一。
本文旨在探讨黑糙米花青素的抗氧化能力及其对酪氨酸酶的抑制效果和作用机制,以期为黑糙米花青素在功能性食品、美白化妆品及医药等领域的开发应用提供理论支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
K2S2O8、维生素C、FeSO4、H2O2、水杨酸、无水乙醇(分析纯),天津永大化学试剂有限公司;ABTS,上海易恩化学技术有限公司;DPPH,上海化成工业发展有限公司;C3G(纯度99.0%)、酪氨酸酶(1 130 U/mg),上海源叶生物科技有限公司;L-酪氨酸,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;熊果苷,上海麦克林生化科技股份有限公司;实验用水为超纯水。
1.2 仪器与设备
CL-80HTD超声清洗仪,济南克林有限公司;UV-5500PC紫外分光光度计,上海元析仪器有限公司;HH-S6水浴锅,北京科伟永兴仪器有限公司;LRH-70F恒温恒湿箱,上海一恒科学仪器有限公司;THZ-82A水浴恒温振荡器,上海新诺仪器集团有限公司;FA2204型电子分析天平(0.1 mg),上海菁海仪器有限公司;K6300C酶标仪,北京凯奥科技发展有限公司;TGL-10B飞鸽牌系列离心机,上海安亭科学仪器厂。
1.3 实验方法
1.3.1 黑糙米中花青素抗氧化活性的研究
1.3.1.1 DPPH自由基清除能力的测定
参考吴春燕等[5]的方法略作修改。精确称量0.019 7 g DPPH标准品于100 mL棕色容量瓶中,以无水乙醇溶解定容后,超声波处理5 min后得到0.2 mmol/L 的DPPH储备液,放入冰箱备用。
取2 mL不同质量浓度的黑糙米花青素溶液,依次加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液,混匀后室温避光孵育30 min,在517 nm处测定其吸光值A1;以无水乙醇作为参比溶液,空白组以等体积无水乙醇替代DPPH溶液,按照相同操作流程测定吸光值A2;对照组则以等体积无水乙醇替换黑糙米花青素提取液,其余步骤一致,测定吸光值A0;以相同质量浓度的维生素C作为阳性对照,平行重复3次,DPPH自由基清除率按公式(1)计算:
DPPH自由基清除率
(1)
1.3.1.2 ABTS阳离子自由基清除能力的测定
参照刘晓燕等[6]的制备方法稍作修改,具体步骤为:采用的0.2 mol/L PBS(pH 7.4)准确配制7 mmol/L ABTS溶液、2.6 mmol/L K2S2O8溶液,按1∶1的体积比混合后避光放置12 h,得到ABTS工作液。使用前用体积分数70%乙醇溶液稀释至OD734=0.70。
将0.5 mL不同质量浓度的黑糙米花青素溶液加到2.5 mL的ABTS溶液中,避光反应10 min,于波长734 nm处测其吸光值Ay;以体积分数70%乙醇溶液替代ABTS溶液,其他操作相同,测定吸光值Az;以体积分数70%乙醇溶液替代黑糙米花青素样液,其他操作相同,测定吸光值Ax;以相同质量浓度的维生素C作为阳性对照,平行重复3次,ABTS阳离子自由基清除率按公式(2)计算:
ABTS阳离子自由基清除率
(2)
1.3.1.3 羟自由基(·OH)清除能力的测定
参照周理红[7]的实验方法稍作调整。取1 mL不同质量浓度的黑糙米花青素溶液,依次添加1 mL FeSO4溶液(9 mmol/L)、水杨酸-乙醇溶液(9 mmol/L)及H2O2(8.8 mmol/L)溶液,混合均匀后,在37 ℃恒温水浴中反应0.5 h,以蒸馏水调零,在510 nm处测定吸光度Aa;以蒸馏水替代H2O2溶液作为空白组,其他操作相同,测定吸光值Ab;以蒸馏水替代黑糙米花青素样液作为对照组,其他操作相同,测定吸光值Ac;以相同质量浓度的维生素C作为阳性对照,平行重复3次,·OH清除率按公式(3)计算:
·OH清除率
(3)
1.3.2 黑糙米花青素对酪氨酸酶活性抑制试验
参照
ÖHRETO
LU等[8]和LIU等[9]的方法,稍作修改。使用PBS(pH 6.8)分别配制50 U/mL酪氨酸酶溶液及2 mmol/L L-酪氨酸底物液。按表1构建反应体系,向96孔板依次加入酪氨酸酶、PBS(pH 6.8)、体积分数80%乙醇溶液及梯度浓度样品,充分混匀后37 ℃恒温孵育10 min;加入L-酪氨酸底物启动反应10 min。测定其在475 nm波长处的吸光值。以熊果苷为阳性对照,纯净水为阴性对照,平行重复测定3次,酪氨酸抑制率按公式(4)计算:
酪氨酸酶抑制率
(4)
表1 酪氨酸酶反应体系 单位:μL
Table 1 Tyrosinase reaction system
反应液A1A2A3A4酪氨酸酶200—200—PBS—200—200体积分数80%乙醇溶液2020——样品溶液——2020L-酪氨酸50505050总体积270270270270
注：“—”表示不添加该溶液。
1.3.3 C3G、熊果苷与酪氨酸酶的分子对接
蛋白预处理:获取PDB 2Y9X(2.78 Å分辨率)双孢蘑菇源酪氨酸酶的晶体结构[10],采用Pymol软件针对四聚体结构进行A链选择性保留处理。
配体制备:在PubChem数据库下载C3G、熊果苷的3D结构(C3G编号:197081;熊果苷编号:440936)。
对接参数:通过Auto Dock Tools(Ver 1.5.6)软件将受体(酪氨酸酶)进行去水、加氢处理;对C3G和熊果苷(配体)进行加氢处理,采用MOE 2019软件进行柔性对接,设置30个初始构象。
构象筛选:使用MOE算法进行构象采样和打分,参照对接得分进行构象排序,挑选出10个分数靠前的构象,根据结合位点选取最优构象。相互作用图使用MOE软件绘制,结合示意图使用Pymol绘制。
1.3.4 C3G、熊果苷与酪氨酸酶的分子动力学模拟
通过分子动力学模拟技术探究蛋白质-小分子复合物的相互作用机制及构象稳定性,采用GROMACS 2022软件开展100 ns的分子动力学模拟。基于AMBER99SB-ILDN力场参数构建酪氨酸酶拓扑文件,配体分子则通过Amber 20软件经GAFF力场参数生成拓扑文件。采用TIP3P水模型建立水盒子,确保蛋白与盒子边缘距离≥1.2 nm,通过添加Na+/Cl-平衡体系电荷。执行50 000步最陡下降法,依次对其进行NVT和NPT系综平衡,在300 K恒温和1 bar恒压条件下开展100 ns的分子动力学模拟,设置10 Å为非键相互作用截断半径。
以熊果苷作为参比体系,通过计算结合自由能揭示分子间相互作用强度,结合均方根偏差(root mean square deviation,RMSD)、均方根波动(root mean square fluctuation,RMSF)分析解析构象稳定性,以及关键氨基残基能量分解探讨关键作用位点。该方法为解析黑糙米花青素与酪氨酸酶的作用机制提供了分子层面的依据,同时有望为药物设计和疫病治疗提供理论支撑。
1.4 数据处理
本研究所有实验都经过3组平行测定,结果用“平均值±标准差”表示;试验数据运用SPSS 17.0软件进行数据方差分析,并运用Origin Pro 2021软件绘制图表。
2 结果与讨论
2.1 黑糙米花青素抗氧化活性的研究
2.1.1 DPPH自由基清除能力
如图1-a所示,当质量浓度处于20～160 μg/mL时,随花青素和维生素C质量浓度的增大,黑糙米花青素对DPPH自由基清除率逐渐升高后趋于稳定,与吕秋洁[11]的研究结果一致。通过比较黑糙米花青素粗提物和维生素C对DPPH自由基清除率的IC50值得出,黑糙米花青素对DPPH自由基具有较好的清除能力。曾繁森等[12]研究表明,黑米花色苷清除DPPH自由基的IC50值为4.462 μg/L,显著低于维生素C对照组(34.56 μg/L),表明其具有更强的自由基淬灭能力。
a-DPPH自由基清除能力;b-ABTS阳离子自由基清除能力;c-·OH清除能力
图1 黑糙米花青素抗氧化活性测定
Fig.1 Assay of anthocyanin antioxidant activity of germinated black brown rice
注:不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)(下同)。
2.1.2 ABTS阳离子自由基清除能力
ABTS在特定氧化条件下会先转化为ABTS自由基,进一步氧化后形成稳定的蓝绿色ABTS阳离子自由基,与抗氧化物反应后还原为无色ABTS(中性分子),以此评估样品抗氧化力。如图1-b所示,随着样品质量浓度的增加,ABTS阳离子自由基的清除率先上升后趋于稳定,表明可能因存在剂量饱和效应或分子间竞争结合,导致单位质量浓度的增益效率降低。通过比较黑糙米花青素粗提物与维生素C对ABTS阳离子自由基清除能力的IC50值得出,黑糙米花青素对ABTS阳离子自由基具有较好的清除能力。常世敏等[13]研究表明黑米花色苷清除ABTS阳离子自由基的能力大于维生素C,但黑米花色苷和维生素C对ABTS阳离子自由基清除率的IC50值分别为0.75、6.92 μg/mL;而郝杰[14]的实验结果则显示二者清除活性相近,IC50值分别为(13.09±0.11)、(12.83±0.03) μg/mL。这种数值的差异可能与原料品种、提取物纯度及花青素含量等因素密切相关。
2.1.3 ·OH清除能力
由图1-c所示,随着花青素和维生素C质量浓度的升高,·OH清除率均呈递增的趋势,通过比较黑糙米花青素粗提物和维生素C对·OH清除率的IC50值得出,维生素C清除·OH的效果要比花青素好,但也能说明黑糙米花青素具有一定的清除·OH的能力和良好的抗氧化性。杨忠等[15]在质量浓度为0.1～0.5 mg/mL时,观察到黑米花色苷与维生素C的清除率同步增长且维生素C始终保持更高的清除效能;吕秋洁[11]对紫米花色苷的研究表明,维生素C清除·OH的能力强于紫米花色苷,均与本试验结果相似。
2.2 黑糙米花青素对酪氨酸酶活性的抑制作用
由图2所示,黑糙米花青素在质量浓度30～150 μg/mL时对酪氨酸酶活性呈现浓度依赖性抑制效应,其IC50值为94.2 μg/mL,显著低于阳性对照熊果苷(126.95 μg/mL)。IC50值越低其抑制效果越好,故黑糙米花青素是有效的酪氨酸酶抑制剂且抑制效果高于熊果苷。褚盼盼[16]的实验结果显示,黑豆皮花青素对酪氨酸单、二酚酶的抑制效果均高于维生素C,是良好的酪氨酸酶抑制剂;倪丹等[17]发现鞣花酸对酪氨酸酶的抑制能力(IC50值为0.05 mg/mL)显著高于熊果苷(IC50值为13.13 mg/mL);二者均与本试验结果相似。为了更准确地理解黑糙米花青素与酪氨酸酶之间的相互作用机制,可以进行更深入的研究,包括酶促反应动力学、分子对接、动力学模拟以及酶动力学分析等,更全面地了解黑糙米花青素对酪氨酸酶的抑制作用,并为其在功能性食品开发中的应用提供更为坚实的理论基础。
图2 黑糙米花青素对酪氨酸酶的活性抑制
Fig.2 Inhibition of tyrosinase activity in sprouted black brown rice
2.3 酪氨酸酶促反应动力学研究
酪氨酸酶抑制机制通常分为可逆与不可逆两大类型,在可逆抑制情况下,酶促反应速率与酶浓度的线性关系曲线应通过坐标原点;而不可逆抑制由于酶活性中心的永久失活,其动力学曲线往往偏离原点。如图3所示,黑糙米花青素体系中酶浓度-反应速率曲线在试验误差范围内均通过原点,且随抑制剂浓度增加,直线斜率逐渐下降,表明黑糙米花青素通过可逆结合方式降低酪氨酸酶催化效率,但未导致酶蛋白永久失活。空白对照的直线斜率显著高于含黑糙米花青素体系,进一步证实其可逆性抑制特性。
图3 黑糙米花青素对酪氨酸酶抑制类型
Fig.3 Types of anthocyanins on tyrosinase inhibition of sprouted black brown rice
根据酶抑制剂与酶活性位点或底物的结合方式,抑制类型可分为4种类型,如表1所示:
表1 抑制类型及其相关特性
Table 1 Types of suppression and their associated characteristics
抑制类型特点作用机理竞争性抑制Km值增大,Vmax值不变,且直线相交于y轴抑制剂的化学结构与底物结构较为相似,与底物竞争酶分子上的结合位点,从而减少了酶与底物的结合,降低了酶反应速率非竞争性抑制Km值不变,Vmax值减小,且直线相交于x轴抑制剂与酶分子结合位点不同,但酶抑制剂与底物结合生成的复合物,不能直接生产产物,从而降低酶反应速率反竞争性抑制Km值减小,Vmax值减小,且各直线平行无交点抑制剂通过与酶和底物结合产生的复合物结合,从而改变酶分子结构,使其更易与酶抑制剂结合混合型抑制Km值增大,Vmax值减少;或Km值减小,Vmax值减少,直线相交于第二或第三象限抑制剂作用机理与非竞争性抑制类型相似,但酶与底物或抑制剂结合次序不同,反应常数不同
通过Lineweaver Burk双倒数作图法(图4)分析酪氨酸酶抑制动力学特征,通过拟合不同底物质量浓度下的初始反应速率数据,计算出各组米氏常数(Km)和最大反应速率(Vmax)。空白对照组与添加30、90、150 μg/mL的黑糙米花青素样品组的Km值分别为1.3、2.09、3.76和9.04,而Vmax值稳定在0.037 7～0.038 1 ΔOD/min。随着黑糙米花青素样品浓度的递增,Km值显著增大但Vmax值保持稳定,且4条拟合直线在y轴交汇,这些特征均符合竞争性抑制,说明黑糙米花青素对酪氨酸酶抑制类型属于竞争性抑制,这可能是因为黑糙米花青素与酶的活性中心结合,与底物形成竞争关系,降低了酶和底物的结合量。CORREIA等[18]研究发现,C3G对酪氨酸酶的抑制为可逆性竞争性抑制,与本研究结果一致。
图4 黑糙米花青素对酪氨酸酶抑制作用的Lineweaver-Burk曲线
Fig.4 Lineweaver-Burk curve of tyrosinase inhibition of anthocyanins in germinated black brown rice
2.4 C3G、熊果苷与酪氨酸酶分子对接结果分析
分子对接技术是一种把小分子配体与大分子受体相互作用可视化从而确定配体可能的结合位点和空间构象的有效方法。因此利用分子对接模拟技术,进一步解析了C3G与熊果苷在酪氨酸酶活性中心的结合位点。
设置分子对接次数为30次后,选取熊果苷和C3G分别与酪氨酸酶对接打分最高的构象结果如图5、图6所示。氢键在生物分子识别中起着关键作用[19],它们能够稳定分子间的相互作用,并影响分子的构象和功能。分子对接分数表如表2所示,熊果苷、C3G与酪氨酸酶的结合能分别为-5.10、-6.16 kcal/mol,通常来说,自由结合能小于-5.0 kcal/mol则表明其有较好的结合活性,因此二者均能与酪氨酸酶形成稳定的复合物,且C3G与酪氨酸酶的结合能的绝对值比熊果苷的大,表明C3G与酪氨酸酶结合更加稳定,与2.2节中试验结果相符。
a-对接3D图;b-对接2D图
图5 熊果苷与酪氨酸酶对接图
Fig.5 Butting diagram of arbutin and tyrosinase
a-对接3D图;b-对接2D图
图6 C3G与酪氨酸酶对接图
Fig.6 C3G and tyrosinase docking diagram
表2 C3G、熊果苷与酪氨酸酶分子对接分数表
Table 2 Molecular docking score table of C3G, arbutin and tyrosinase
抑制剂靶点结合自由能/(kcal/mol)熊果苷酪氨酸酶-5.10C3G酪氨酸酶-6.16
由图5可知,熊果苷与酪氨酸酶结合时,熊果苷能够与酪氨酸酶的活性位点(ASP25、ASP367、PHE135、ASN22、HIS390、ARH301、TRP386等)结合,与氨基酸残基ASP25之间形成一个氢键,键长是3.1,氢键是氢相互作用,可以降低结合能,增强稳定性[20],所以氢键是熊果苷与酪氨酸酶相互作用的主要作用力。由图6所示,C3G结合到酪氨酸酶的活性口袋的催化腔中,被酪氨酸酶的活性位点(ASP137、HIS390、ASN22、TRP386、PRO370、PRO366、ASP25等)包围,C3G与酪氨酸酶的残基ASP137、PRO366、ASN22形成了3个氢键,键长分别为3.08、3.05、3.19,结合能分别为-0.9、-1.7、-1.4 kcal/mol,而与酪氨酸酶的氨基酸残基ASP25存在离子作用,离子相互作用是静电相互作用[21],通过与酪氨酸酶活性中心周围的氨基酸作用,由此影响底物通过通道进入酶的活性中心,阻碍了底物与酶的结合,从而降低了酶的活性[22]。熊果苷也与ASP25形成氢键,两者虽然都对残基ASP25有连接,但作用力方法不同,这说明ASP25是酪氨酸酶结合的一个重要残基。分析结果表明,通过降低结合能以及增加与受体酪氨酸酶结合的氢键数量,能够有效提高C3G抑制黑色素形成的可能性。
2.5 分子动力学模拟分析
使用分子动力学模拟来探索配体-蛋白质复合物的各个方面,包括他们的内部运动、构象变化、相互作用机制和结合稳定性[23]。为了确定C3G、熊果苷分别与酪氨酸酶结合的蛋白复合物的稳定性,进行100 ns的分子动力学模拟,计算了RMSD、RMSF、回旋半径(radius of gyration,Rg)、结合自由能等,如图7和图8所示。
a-RMSD结果;b-RMSF变化情况;c-Rg变化图;d-氢键数量变化
图7 C3G-酪氨酸酶、熊果苷-酪氨酸酶复合物体系的分子动力学仿真分析
Fig.7 Molecular dynamics simulation analysis of C3G-tyrosinase and arbutin-tyrosinase complex system
a-熊果苷结合能属性分解图;b-熊果苷残基分解图;c-C3G体系结合能属性分解图;d-C3G体系残基分解图
图8 结合自由能分解示意图
Fig.8 Combined with free energy decomposition diagram
2.5.1 RMSD分析
采用RMSD评价配体-蛋白复合物的结构稳定性和偏差。如图7-a所示,熊果苷-酪氨酸酶复合物和C3G-酪氨酸酶复合物的RMSD值在前20 ns略有增加,但都小于0.2 nm,这表明在模拟过程中由于催化口袋中的配体结合,系统的结构发生了变化。然而随着模拟时间的延长,RMSD值波动幅度变小,逐渐趋于稳定。这表明2种复合物中配体与蛋白相互作用得到了相对较好的维持,与初始构象的偏差较小。
2.5.2 RMSF分析
RMSF可以观察体系在模拟过程中局部氨基酸残基位点结构波动的情况,该值越大表明该位置残基越柔性。通过图7-b可知,熊果苷-酪氨酸酶复合物和C3G-酪氨酸酶复合物的RMSF值波动情况基本一致,但特定区域的残基柔性存在细微差异,这种差异主要归因于配体与酶活性中心结合强度的差异,反应了不同配体与酪氨酸酶相互作用的特异性。在77、248号附近残基处表现出较高的结构灵活性,但所有残基的RMSF均小于0.6 nm,波动较小,说明这些复合物在模拟过程中没有发生明显的结构偏差,具有良好的稳定性。
2.5.3 Rg分析
Rg用于评价体系结构的紧密程度,该差值越大表示蛋白质结构越松散,越小则表示越紧密。由图7-c可以看出,在100 ns模拟中,熊果苷体系的Rg值介于2.036 86～2.081 98 nm;C3G体系的Rg值介于2.037 5～2.098 83 nm,两者差值都在0.065 nm以内,而且都出现低程度的波动,这表示2种不同的体系在结构密度上并无太大的差异,且配体与蛋白质相互作用的紧密度和稳定性很高。结合RMSD值和Rg值来看,体系在100 ns模拟中,体系趋于稳定,收敛。
2.5.4 氢键数量分析
氢键可以显著影响复合物的稳定性和结合亲和力[24],通过分析氢键数量的变化,可以深入了解配体与蛋白质之间的相互作用强度和稳定性。由图7-d可知,在100 ns分子动力学模拟中,蛋白和小分子可以形成氢键相互作用,熊果苷体系形成氢键数量介于0～5,氢键的平均数量为1.829 17±0.961 14;C3G体系形成的氢键数量介于0～4,氢键的平均数量为1.174 83±0.753 93。氢键数量的波动可能受到不同氢键类型的相互影响,而熊果苷体系中氢键数量波动幅度要高于C3G体系,这可能是源于熊果苷分子与酶活性中心之间存在更多的结构变化所导致的。
2.5.5 结合自由能和有贡献残基分解图分析
结合自由能分析是评估蛋白质-配体相互作用强度和稳定性的重要方法。通过分解结合自由能的各个能量成分,可以深入了解不同相互作用力对结合过程的贡献。熊果苷-酪氨酸酶、C3G-酪氨酸酶的结合自由能分别如图8-a、图8-c所示。GGAS代表气相自由能,其是范德华力和静电相互作用力综合计算得到的;在熊果苷和C3G体系中,范德华力和静电相互作用力均小于0,表明疏水作用、静电能促进了配体和蛋白的结合,而静电相互作用力的值比范德华力的值更小,说明静电能相互作用是促进二者结合的显著驱动力,且C3G体系总GGAS的绝对值要比熊果苷体系大很多,这表示C3G体系的结合能力更强;溶剂化能则是广义玻恩能和表面能综合计算得到的,在熊果苷体系中,表面能小于0,但数值较小,广义玻恩能大于0,表明极性溶剂不利于配体和蛋白的结合,而在C3G体系中,表面能为负值,与熊果苷体系一样,数值都较小,但广义玻思能的值相较于熊果苷体系则增大了很多,表明C3G体系在极性溶剂化不利于结合[25]。最终C3G和熊果苷体系的总自由能分别为(-16.9±3.51)、(-11.82±5.17) kcal/mol,结果均为负数,表明蛋白质与小分子配体的结合是一个自发过程[25],C3G体系总自由能的绝对值要大于熊果苷体系,这说明C3G与酪氨酸酶结合更加稳定,进一步印证了2.2节、2.4节中试验结果。
蛋白与小分子可以发生相互作用,主要通过图8-b、图8-d的残基体现。由图8-b可以看出,ASP25残基结合能最大,对结合的贡献显著大于其他残基,表明在熊果苷体系中ASP25残基结合能力最好,与2.4节分子对接试验中结果相一致。通过图7-d可以看出,在C3G体系中TYR140、TRP386残基对结合的贡献显著大于其他残基。
3 结论
以黑糙米中的花青素为研究对象,通过对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基和·OH的体外清除试验,探讨了黑糙米花青素的抗氧化性能。以维生素C为阳性对照,在试验浓度范围内,黑糙米花青素对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基的清除能力要强于阳性对照维生素C,而在·OH清除试验中,黑糙米花青素的清除能力略低于维生素C,这说明黑糙米花青素具有较好的抗氧化性。研究发现黑糙米花青素对酪氨酸酶(IC50值为94.2 μg/mL)有一定的抑制作用,且效果强于阳性对照熊果苷(IC50=126.95 μg/mL)。利用酶促动力学模型与Lineweaver-Burk曲线进行深入分析得出花青素对酪氨酸酶的抑制类型为可逆竞争性抑制。基于分子对接分析熊果苷、C3G和酪氨酸酶的互作关系,确定熊果苷、C3G和酪氨酸酶内部TYR140、PRO366、TRP386和HIS390等氨基酸残基结合,结合作用力主要为氢键、静电作用为离子键,结合能分别为-11.82、-16.9 kcal/mol,结合较为稳定。综上所述,黑糙米花青素具有良好的抗氧化活性,可作为一种天然的酪氨酸酶抑制剂,为黑糙米花青素在延缓衰老以及美白产品的深层次研究开发利用和功能性食品的开发方面提供一定的参考依据。
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